RICERCA ITALIANA     

FUMO DI TABACCO, INFIAMMAZIONE E CANCRO DEL POLMONE: ASPETTI MOLECOLARI, BIOLOGICI, CLINICI E ANATOMOPATOLOGICI

Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia

Abstract

Il fumo di tabacco rappresenta il principale fattore di rischio per broncopneumopatia cronica ostruttiva e tumore del polmone nei Paesi industrializzati ed il suo impatto nello sviluppo di queste malattie è in progressiva crescita anche nei Paesi in via di sviluppo. Inoltre, esso rappresenta non solo il fattore eziopatogenetico comune alle due patologie ma la patologia infiammatoria cronica polmonare ad esso associata, specialmente se associata alla limitazione al flusso aereo, può costituire di per sé un fattore predisponente all'insorgenza della neoplasia.
Lo scopo del presente progetto di ricerca, multicentrico e interdisciplinare, è lo studio in vitro delle modificazioni biologiche e molecolari indotte dal fumo di sigaretta nelle cellule e tessuti polmonari, e la valutazione in vivo delle rispettive risposte sul piano clinico ed anatomo-patologico.
Il programma riguarda 7 Unità di ricerca, alcune delle quali prevalentemente impegnate in studi sperimentali in vitro mediante tecniche di biologia cellulare, biologia molecolare, o genetica molecolare i cui risultati potranno essere usati per l'interpretazione dei dati ottenuti in vivo dalle altre Unità a prevalente impronta clinica. Nell'ambito di ogni progetto si cercherà di analizzare le possibili relazioni fra infiammazione e tumore polmonare. Ogni singolo progetto ha un obiettivo ben definito e autonomamente in grado di fornire contributi originali. Tuttavia, la inter-disciplinarietà del progetto di ricerca, che costituisce la peculiarità del programma nel suo complesso, fra Unità accomunate dallo studio degli effetti del fumo di tabacco sul polmone umano sarà in grado di fornire dati solidi e potenzialmente fruibili anche al di fuori del settore specialistico. Infine, alcune aree di ricerca (ad esempio, espressione genica dopo stimolazione con estratto di matrice ambientale, ruolo dei recettori decoy nella infiammazione delle vie aeree) rappresentano settori assolutamente innovativi i cui risultati costituiranno comunque un avanzamento delle conoscenze. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Leonardo FABBRI Università degli Studi di MODENA e REGGIO EMILIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il fumo di tabacco rappresenta il principale fattore di rischio per broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) e tumore del polmone nei Paesi industrializzati, con una incidenza di morbilità e mortalità per queste 2 patologie in progressiva crescita. Il fumo di sigaretta rappresenta non solo il fattore eziopatogenetico comune a BPCO e tumore polmonare. La patologia infiammatoria cronica polmonare, specialmente se associata alla limitazione al flusso aereo, costituisce di per sé un fattore predisponente all'insorgenza della neoplasia. I complessi meccanismi molecolari e biologici alla base di questa azione favorente sono ancora in gran parte sconosciuti, ma riguardano probabilmente molteplici vie fisiopatologiche quali lo stress ossidativo, il rimodellamento, la proliferazione cellulare, l'apoptosi.
Lo scopo di questo programma di ricerca interdisciplinare è lo studio in vitro delle modificazioni biologiche, molecolari indotte dal fumo di sigaretta nelle cellule e tessuti polmonari, sia in senso pro-infiammatorio che pro-neoplastico, e nella valutazione in vivo delle rispettive risposte sul piano clinico ed anatomopatologico. Ove possibile, si cercherà di analizzare nell'ambito dello stesso progetto le possibili relazioni fra infiammazione e tumore polmonare. Il progetto complessivamente riguarda 7 Unità di ricerca. Nella parte relativa alle ricerche in vitro verranno usate dalle varie Unità tecniche analitiche fra loro complementari (biologia cellulare, biologia molecolare, genetica molecolare) i cui risultati potranno essere usati a posteriori per l'interpretazione dei dati ottenuti in vivo dalle Unità a prevalente impronta clinica. Ogni singolo progetto si prefigge un obiettivo ben definito e autonomamente in grado di fornire contributi originali. Tuttavia, la interdisciplinarietà e la complementarietà delle varie Unità di ricerca coinvolte in progetti aventi come denominatore comune gli effetti del fumo di tabacco sul polmone umano costituiscono un carattere distintivo del programma nel suo complesso e sono in grado di fornire una più ampia e solida base di conoscenza sull'argomento scelto. Alcune aree di ricerca costituiscono poi dei campi di interesse assolutamente innovativi (ad esempio, espressione genica dopo stimolazione con estratto di matrice ambientale, ruolo dei recettori decoy nella infiammazione delle vie aeree) i cui risultati costituiranno comunque un avanzamento delle conoscenze. <<<

Risultati parziali attesi

Definizione dei protocolli sperimentali, generazione di linee cellulari e messa a punto delle metodiche di preparazione dei reagenti sperimentali.
Assegnazione competenze alle varie Unita' Operative.
Definizione dei criteri di selezione (inclusione ed esclusione) della popolazione in studio.Al termine di questa fase le Unita' di ricerca avranno completato l'espressione delle molecole di attivazione in studio in plasmidi, linee cellulari e campioni di biopsia e di lavaggio bronco-alveolare.
Inoltre, verranno analizzate le risposte di linee cellulari a stimolazione con fumo di sigaretta e matrici ambientali ed estratti di virus.
Il ruolo e la caratterizzazione di linfociti T coinvolti nella patogenesi di BPCO e cancro del polmone verranno analizzati su linee cellulari e campioni bioptici.
Parametri di attivazione infiammtoria cellulare saranno misurati nei pazienti selezionati sulla base dei criteri stabiliti nella precedente fase.
I parametri per l'analisi discriminante dei pazienti con prevalente enfisema e prevalente bronchite cronica saranno applicati ad una coorte prospettica.Nell'ultima fase del progetto i dati ottenuti in vitro saranno raccolti ed analizzati statisticamente.
I dati ottenuti saranno poi correlati con i dati relativi ai pazienti da cui i campioni bioptici sono stati ottenuti. I risultati saranno correlati con indici di gravita' di malattia, di sopravvivenza e di risposta alla terapia.
I dati genetici ottenuti saranno confrontati con quelli disponibili in banche dati genetiche pubbliche. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il fumo di tabacco costituisce fattore di rischio per numerose malattie e la mortalità per patologie fumo-correlate è in progressivo aumento in molti Paesi in via di sviluppo. E' stato stimato che nel 2000 quasi 5 milioni di morti premature sono state causate dal fumo di tabacco, e di queste quasi 2 milioni sono dovute a broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) o tumore polmonare (1).
Si prevede che nei decenni futuri la loro prevalenza e mortalità aumenteranno ulteriormente (2). Il fumo di tabacco è in grado di causare infiammazione e rimodellamento nei tessuti polmonari dei fumatori (3), fenomeni che sono dovuti, almeno in parte, ad un meccanismo di stress ossidativo, sia direttamente dagli ossidanti contenuti nel fumo di sigaretta stesso sia indirettamente attraverso la risposta infiammatoria (4). Infatti, il fumo di sigaretta contiene una grande quantità di potenti ossidanti ed è in grado di aumentare la produzione endogena di specie reattive all'ossigeno (ROS) da parte delle cellule delle vie respiratorie, tra cui i macrofagi alveolari ed i neutrofili (5) che rappresentano le 2 fonti principali di ROS. Il risultato finale di tale cascata di eventi è la generazione di circoli viziosi che, attraverso meccanismi paracrini e/o autocrini mantengono ed amplificano i processi infiammatori associati alla BPCO. Il fumo di sigaretta, che come detto costituisce il maggiore fattore di rischio per la BPCO, è una delle cause più importanti dello squilibrio ossidanti/antiossidanti nei tessuti polmonari in senso pro-ossidativo. Il sovraccarico ossidativo presente nei pazienti con BPCO è di tali dimensioni che può essere utilizzato in clinica mediante il monitoraggio di diversi marcatori di stress ossidativo quali l'8-isoprostano e la 4-idrossi-2-nonenale (4-HNE). Interessante notare, ai fini del presente progetto, che lo stress ossidativo gioca un ruolo, probabilmente fondamentale, anche nella eziopatogenesi del tumore polmonare (6).
Il reclutamento di cellule infiammatorie nelle vie aeree è l'evento critico che stimola e sostiene i processi fisiopatologici responsabili dello sviluppo della BPCO (7). E' stato dimostrato che sia le cellule epiteliali delle vie aeree che i macrofagi alveolari sono in grado di produrre numerose chemochine, in particolare dopo esposizione a fumo (8). Una più approfondita conoscenza delle chemochine e dei recettori coinvolti direttamente nel reclutamento dei leucociti nelle vie aeree appare cruciale per capire come questo fenomeno sia modulato dal fumo di sigaretta. Inoltre essa è un passaggio necessario per lo sviluppo di inibitori per chemochine da usarsi per la terapia delle patologie infiammatorie delle vie aeree (9).
Nei pazienti con BPCO esiste una amplificazione della normale risposta infiammatoria al fumo di sigaretta (10), e l'amplificata risposta infiammazione cronica causata dal fumo di sigaretta è stata associata ad un aumentato rischio di tumori polmonari (11). I rapporti fra i processi degenerativi cronici (infiammazione) e quelli proliferativi (neoplasia) indotti nel polmone dal fumo di tabacco riguardano molteplici categorie di processi fisiopatologici.
Ad esempio, e' stato ipotizzato che le cellule neuroendocrine (NE) possano rivestire un ruolo importante nel determinare se un fumatore svilupperà, nel corso della sua vita, una ostruzione cronica delle vie aeree o altre malattie fumo-correlate, come il tumore del polmone (12). Le cellule NE aumentano di numero in risposta a diverse patologie polmonari sia di tipo restrittivo, come la bronchiolite respiratoria e la polmonite interstiziale, che di tipo ostruttivo, quali l'enfisema polmonare e la bronchite cronica. E' nota poi l'esistenza di tumori di origine neuroendocrina di alto grado fortemente correlati al fumo di tabacco.
Il fumo di tabacco è in grado di attivare le cellule residenti (macrofagi, cellule epiteliali e cellule dendritiche) che richiamano dal torrente circolatorio altre cellule, quali neutrofili, monociti e linfociti T. Queste cellule rilasciano mediatori dell'infiammazione, proteasi e radicali liberi che, a loro volta, svolgono un importante ruolo patogenetico nella malattia.
Lo stress ossidativo può anche determinare apoptosi nelle cellule epiteliali ed endoteliali. L'apoptosi dei pneumociti di tipo I può contribuire allo sviluppo dell'enfisema (13). Le alterazioni dell'attività apoptotica delle cellule giocano un ruolo importante anche nello sviluppo del tumore e nella risposta tumorale ai farmaci antitumorali.
Il processo apoptotico comprende una molteplice serie di fenomeni che coinvolgono numerosissime molecole. Ad esempio, la clusterina (detta anche APOJ o SGP-2) è una glicoproteina eterodimerica, presente nella maggior parte dei tessuti e liquidi corporei che viene secreta da diversi tipi di cellule. La sua espressione risulta in generale modificata in seguito a diverse perturbazioni della fisiologia cellulare tra cui sono compresi processi infiammatori, trasformazione neoplastica e progressione del tumore in vivo (14). L'eterogeneità dei risultati descritti finora su questa proteina possono essere spiegati sulla base dell'esistenza di diverse isoforme della clusterina. Una di esse, una forma glicosilata secreta dalle cellule (70-80 kDa), manifesta proprietà anti-apoptotiche che le conferiscono un'azione citoprotettiva e la fanno risultare favorevole alla crescita tumorale. Un'altra isoforma non glicosilata (55 kDa) risulta a localizzazione nucleare, manifesta attività anti-apoptotica e sarebbe in grado di inibire la crescita della cellula tumorale (14). Non è noto, a tutt'oggi, il ruolo di questa molecola nei processi infiammatori cronici e neoplastici del polmone.
Il processo apoptotico può anche risultare dalla interazione fra diversi tipi cellulari. Ad esempio, è stata dimostrata un'associazione tra i linfociti CD8+ e l'apoptosi delle cellule dell'epitelio alveolare nei pazienti enfisematosi. Se il ruolo delle cellule CD8+ nella patogenesi della BPCO è ormai consolidato (15), è interessante notare come esso possa entrare in gioco anche nella cancerogenesi polmonare. Ad esempio, nell'ambito delle cellule CD8+ ad attività soppressiva, si possono identificare tre diverse sotto-popolazioni, tutte in grado di inibire significativamente la proliferazione di cloni T antigene specifici (16). Le prime 2 sono caratterizzati fenotipicamente dalla mancata espressione del CD28 (CD8+CD28-), mentre non vi sono al momento informazioni certe sulla caratterizzazione del fenotipo della terza sottopopolazione. Le cellule soppressorie di tipo 1 agiscono modulando in senso inibitorio l'espressione di molecole di co-stimolazione da parte delle APC, attività per la quale è indispensabile un contatto intercellulare diretto. Le cellule di tipo 2, invece, esercitano la loro azione soppressiva mediante la produzione di due citochine: interferone-gamma ed interleuchina-6, e non necessitano di un contatto diretto con il bersaglio. Ciò suggerisce un possibile ruolo patogenetico di tali effettori linfocitari nella progressione della malattia neoplastica.
Pur se il fumo di tabacco costituisce senza dubbio il principale fattore di rischio sia per la BPCO che per il tumore del polmone, è oggi noto che entrambe queste patologie originano dalla interazione fra fattori endogeni (genetici) ed ambientali (fumo di sigaretta, inquinamento) (17, 18). Nei soggetti geneticamente suscettibili, il livello di esposizione ai singoli fattori ambientali o alle loro combinazioni determina il tipo e l'intensità della risposta tissutale responsabile dello sviluppo della malattia. Nel caso della BPCO oltre al fumo di sigaretta, anche l'inquinamento ambientale e le infezioni, specie se di origine virale e se contratte in età infantile, possono giocare un ruolo causale o concausale. Ad esempio, è stato dimostrato che le particelle delle emissioni diesel, costituenti importanti dell'inquinamento ambientale, inducono una risposta infiammatoria da parte delle cellule dell'epitelio bronchiale umano e una aumentata espressione del citocromo P4501A1 responsabile della attivazione degli idrocarburi policiclici aromatici (19). L'induzione degli enzimi attivanti i cancerogeni del fumo di sigaretta nel polmone umano da parte del fumo stesso è particolarmente marcata nei soggetti con tumore polmonare (20), a sostegno di una suscettibilità genetica per questa neoplasia.
I virus organotropici per il polmone (adenovirus, virus respiratorio sinciziale, rinovirus) oltre a possedere un probabile ruolo etiopatogenetico sono pure spesso responsabili delle riacutizzazioni di malattia, specialmente nei soggetti anziani. L'infezione virale induce una marcata risposta infiammatoria nelle cellule bronchiali umane, in parte legata a meccanismi di stress ossidativo. E' inoltre possibile che i vari fattori esogeni interagiscano fra loro nel determinare l'effetto dannoso nel singolo individuo. Ad esempio, è stato dimostrato che l'esposizione al particolato di emissioni diesel aumenta la risposta infiammatoria delle cellule bronchiali alle infezioni virali (21). Al ruolo conosciuto della deficienza di alfa1-antitripsina nella insorgenza dell'enfisema nei soggetti fumatori, nella patogenesi della BPCO si sono aggiunti col passare degli anni numerosi altri geni i cui prodotti appartengono a diverse classi di effettori fisiopatologici: proteasi, enzimi di attivazione o detossificazione dei tossici inalati, antiossidanti, mediatori pro-infiammatori, regolatori della clearance muco-ciliare (22). Inoltre, è stato osservato che l'espressione genica nel tessuto non tumorale di soggetti non fumatori con adenocarcinoma polmonare differisce da quella dei soggetti fumatori affetti dalla stessa neoplasia, suggerendo diverse vie di trasformazione cellulare (23). Un sottogruppo di fumatori sembra essere più suscettibile degli altri agli effetti deleteri del fumo di tabacco ed è possibile che questa diversa suscettibilità dipenda dal ruolo relativo delle diverse vie di trasformazione in differenti tipi cellulari (es. cellule di derivazione neuroendocrina). Ad esempio, nei tumori NE polmonari le alterazioni genetico-molecolari fondamentali finora riscontrate sono riconducibili ad anomalie di p53/Rb, anche se numerose altre vie autocrine e/o paracrine, caratterizzate dalla iper-espressione dei recettori protein-chinasici e dei rispettivi ligandi, sembrano intervenire attivamente nella regolazione della crescita, della differenziazione e della sopravvivenza delle cellule neoplastiche (24). La patogenesi della BPCO e del tumore polmonare indotti dal fumo di sigaretta appare quindi estremamente complessa e coinvolgente una molteplicità di effettori biologici e molecolari, ma la caratterizzazione complessiva di tali effettori è a tutt'oggi largamente incompleta.
L'importanza di tale caratterizzazione non risiede soltanto nell'ambito delle conoscenze biologiche ma ha anche potenzialmente dei corrispettivi clinici. Infatti, se i sintomi, le anomalie funzionali e le complicazioni della BPCO possono essere spiegate sulla base di una esagerata risposta infiammatoria e sulle modificazioni patologiche che essa determina, l'espressione fenotipica di tali anomalie può differire notevolmente da individuo a individuo. Già la limitazione cronica al flusso aereo, caratteristica della BPCO, risulta dalla variabile combinazione di alterazioni a carico delle vie aeree e del parenchima polmonare (25). L'infiammazione cronica delle vie aeree determina fibrosi e distorsione delle pareti delle vie aeree, formazione di tappi di muco e contrazione della muscolatura liscia, con conseguente riduzione del calibro delle vie aeree. La flogosi cronica del parenchima polmonare causa distruzione delle pareti alveolari e perdita degli attacchi alveolari con riduzione del ritorno elastico polmonare. Queste alterazioni riducono la pervietà delle vie aeree durante l'espirazione.
Questo catena di fenomeni non si riflette in una unica espressione clinica, ma, ad esempio, è stato recentemente dimostrato che soggetti con BPCO e prevalente enfisema polmonare presentavano una maggiore riduzione del FEV1, del rapporto FEV1/FVC e della capacità di diffusione alveolo-capillare rispetto ai soggetti BPCO e prevalente bronchite cronica. Nello stesso gruppo di soggetti il punteggio radiologico per l'enfisema era maggiore mentre era inferiore quello per la bronchite cronica. L'osservazione clinica non è disgiunta da correlati biologici: il numero di cellule linfocitarie nell'escreato è aumentato nei pazienti con enfisema (26) e l'aumento delle cellule linfocitarie nell'escreato di pazienti con predominante enfisema concorda con l'osservazione che i linfociti CD8+ hanno la capacità di causare citolisi ed apoptosi delle cellule dell'epitelio alveolare tramite il rilascio di mediatori quali perforine, granizime-B, e TNF-alfa. <<<