RICERCA ITALIANA     

Transcrittomica e proteomica dello scompenso cardiaco umano per l'individuazione di nuovi meccanismi patogenetici e biomarcatori: focus sui recettori purinergici P2

Università degli Studi di Siena

Abstract

Fattori neuroumorali e citochine infiammatorie hanno un ruolo patogenetico nello scompenso di cuore (CHF) che rimane una causa maggiore di morbidità nonostante le terapie disponibili. Nuovi bersagli farmacologici sono pertanto possibili. Le purine e le pirimidine extracellulari mediano importanti effetti biologici attraverso recettori cellulari: recettori adenosinici/P1 e P2, che riconoscono ATP, ADP, UTP e UDP. I recettori P2 sono suddivisi in recettori che regolano canali ionici (P2X) e in recettori accoppiati a proteina G (P2Y). Ad oggi sono stati identificati 7 recettori P2X e 9 recettori P2Y. Dati preliminari suggeriscono che nel cuore umano sono espressi diversi sottotipi recettoriali P2X e P2Y insieme a recettori "P2-like" ancora non caratterizzati e che alcuni di questi recettori vanno incontro a modificazioni in corso di CHF. Non esistono dati sull'espressione dei diversi recettori P2X e P2Y nelle cellule mononucleate ematiche (PBMC), né in soggetti sani, né in CHF. Il presente progetto ha l'obiettivo di 1)studiare nei cuori espiantati dei pazienti CHF sottoposti a trapianto la presenza e l'espressione di tutti i recettori P2 clonati, versus controlli. Sarà valutata anche l'espressione di alcuni recettori "P2-like"; 2)determinare la presenza di recettori P2 in strutture di membrana altamente specializzate (raft lipidiche o caveole), per stabilire come la disfunzione miocardica possa alterarne la distribuzione in specifici domini e quindi il loro stato funzionale; 3)determinare il ruolo funzionale dei recettori P2 più alterati in CHF attraverso la valutazione degli effetti di agonisti/antagonisti specifici di sottotipi recettoriali P2 sulla sopravvivenza/morte di fibroblasti isolati da cuori espiantati; 4)caratterizzare quale tipo(i) cellulare è responsabile dei cambiamenti nell'espressione dei recettori P2 attraverso la separazione di cellule da cuori espiantati con laser-capture e successiva real-time PCR; 4)studiare la presenza e l'espressione dei recettori P2 in PBMC di soggetti normali e con CHF per valutare se (i)esista una correlazione tra lo stato dei recettori P2 nel cuore scompensato e nei PBMC degli stessi soggetti; e (ii)se qualcuno dei recettori P2 espressi in PBMC possa essere utilizzato come biomarcatore di malattia. A questo scopo dopo avere stabilito se e quale dei recettori P2 espressi nei PBMC dei pazienti con CHF sia up- o down-regolato, verrà studiato il comportamento di tale recettore dopo trapianto cardiaco; 5)identificare proteine espresse in maniera differenziata nel tessuto cardiaco e nei PBMC di soggetti normali e CHF, mediante la costruzione di mappe elettroforetiche 2D e la identificazione di proteine con spettrometria di massa MALDI-TOF ed ESI-IonTrap; 6)avere informazioni sulla interazione proteina/proteina di recettori P2 specifici nel cuore scompensato. Mediante l'utilizzo di anticorpi verso i comuni epitopi presenti nella famiglia dei recettori P2 sarà possibile accertare la presenza( e le mdificazoni) di recettori "P2-like" ancora non identificati nel miocardio e nei PBMC di soggetti CHF.Per il nostro studio utilizzeremo anche un modello animale di scompenso: topi MLP-/-, per ottenere informazioni su: 1)presenza, modifiche funzionali e localizzazione in microdomini di membrana dei recettori P2 nel tessuto cardiaco in confronto a controlli in rapporto a parametri emodinamici; 2)proteomica del tessuto cardiaco dei cuori scompensati 3)effetto di agosti/antagonisti specifici P2, per via sistemica, sullo sviluppo e progressione di CHF. Globalmente i risultati forniranno informazioni del tutto nuove sul ruolo dei recettori P2 nella funzione miocardica e nello sviluppo di CHF e getteranno le basi per lo sviluppo di nuovi trattamenti farmacologici in vivo mirati sui recettori purinergici di potenziale interese terapeutico in CHF. A ciò si aggiungeranno informazioni riguardo a proteine differenzialmente espresse che possano costiuire marcatori di interesse diagnostico/prognostico. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Franco LAGHI PASINI Università degli Studi di SIENA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Parte dello studio sarà condotta su cellule mononucleate da sangue periferico (PBMC) di pazienti affetti da CHF(in confronto a soggetti normali), nonchè campioni di tessuto ventricolare sinistro derivante da miocardio di pazienti CHF cardiotrapiantati (in confronto a campioni di cuore di soggetti deceduti per cause non correlate a patologie cardiache). I campioni saranno forniti dall'Unità 1 Siena che provvederà alla selezione dei pazienti. Verranno arruolati 25 pazienti con CHF terminale (da cardiopatia ischemica o da cardiomiopatia dilatativa primitiva) consecutivamente valutati per l'inserimento in lista per trapianto di cuore.La ricerca si propone di:
- ANALIZZARE I CAMBIAMENTI DEL PROTEOMA CARDIACO CON SCOMPENSO. Saranno condotti studi di subproteomica in compartimenti cellulari specializzati del tessuto cardiaco per identificare modificazioni quantitative e qualitative che possano comparire durante lo sviluppo di CHF.
- DETERMINARE L'ESPRESSIONE DEI RECETTORI P2. Una mappa completa dei recettori P2X e P2Y cardiaci nel tessuto umano non è stata ancora delineata come pure sono lacunose le informazioni relative ad una loro eventuale alterata espressione durante CHF. Verrà quindi valutata l'espressione dei recettori P2 clonati, insieme a quella di alcuni recettori orfani a G-proteina correlati ai recettori P2Y. Per caratterizzare meglio quale tipo(i) cellulare sia responsabile dei cambiamenti nell'espressione del recettore P2, sarà effettuata la real-time PCR accoppiata a tecnica di microdissezione "laser-capture" sui cuori espiantati. Questo ci permetterà di chiarire se i cambiamenti nell'espressione del recettore P2 siano da attribuire ai cardiomiociti, alle cellule endoteliali, ai fibroblasti, o alle cellule muscolari liscie.
- DETERMINARE LA LOCALIZZAZIONE DEI RECETTORI P2 IN COMPARTIMENTI DI MEMBRANA SPECIALIZZATI.E' fondamentale individuare la localizzazione dei recettori che risultano espressi nel tessuto miocardico per poterne stabilire un ruolo funzionale. E' stato infatti dimostrato che numerosi recettori si concentrano in strutture di membrana altamente specializzate (lipid rafts o caveole) contenenti complessi proteici deputati alla trasduzione del segnale, suggerendo che la traslocazione dentro e fuori da tali compartimenti influenzi la capacità di risposta agli agonisti. La localizzazione dei recettori P2 in queste frazioni specializzate di membrane isolate da tessuto cardiaco di pazienti con CHF e di controlli potrebbe quindi fornire utili informazioni sullo stato funzionale di questi recettori in relazione con la patologia.
- DETERMINARE IL RUOLO FUNZIONALE DEI RECETTORI P2 ALTERATI in CHF Al fine di attribuire un significato funzionale alle variazioni riscontrate a carico dei recettori P2 nel tessuto cardiaco di pazienti con CHF ( e in particolare per valutare la loro influenza sulla sopravvivenza dei cardiomiociti) verranno utilizzate culture cellulari di fibroblasti cardiaci isolati da tessuto cardiaco. Queste cellule verranno incubate in presenza di agonisti/antagonisti dei recettori P2 per valutare il ruolo di tali recettori nella regolazione della vitalità cellulare. I dati verranno confermati anche mediante metodiche di RNA interference.
- DETERMINARE LE INTERAZIONI PROTEINA-PROTEINA DEI RECETTORI P2 NEL MIOCARDIO in CHF. Studi di proteomica, finalizzati ad individuare interazioni molecolari tra recettori e proteine specifiche del tessuto miocardico, saranno condotti su quei recettori P2 la cui espressione risulti alterata in CHF. L'utilizzo di anticorpi specifici permetterà di isolare ed immunoprecipitare i recettori selezionati con i complessi proteici ad essi associati da frazioni purificate di membrana e/o da caveole. L'identità e le modificazioni post-trasduzionali delle proteine che interagiscono con i recettori P2 saranno determinate mediante separazione in elettroforesi mono o bidimensionale associata a tecniche di spettrometria di massa MALDI-TOF .
- DETERMINARE L'ESPRESSIONE dei recettori P2 (e di alcuni oGPCRs) su PBMC di CHF. Cio' consentirà di verificare se esista una correlazione tra lo stato dei recettori nel cuore scompensato e nei PBMC e se alcuni recettori P2 espressi in periferia possano essere utilizzati come biomarcatori di malattia
- IDENTIFICAZIONE, medante analisi del proteoma, delle proteine differenzialmente espresse in PBMC di pazienti CHF e determinazione delle interazioni proteina-proteina di specifici recettori P2.
- STUDIO LONGITUDINALE. Dopo avere stabilito quale recettore(i) espresso nei PBMC di pazienti con CHF sia up- o down-regolato significativamente, si intende valutare il comportamento di tale recettore(i) a 6 e 24 settimane dopo il trapianto di cuore, in vista di una possibile normalizzazione di espressione.
La seconda parte dello studio si avvarrà di un modello animale di scompenso cardiaco allo scopo di:
- DETERMINARE SE E QUALI SOTTOTIPI DEI RECETTORI P2 SIANO ESPRESSI IN MANIERA ALTERATA IN CUORI scompensati utilizzando un modello animale ben definito di scompenso, cioè topi MLP-/-. Tali animali sviluppano spontaneamente una forma di cardiomiopatia dilatativa con scompenso cardiaco che assomiglia molto alla condizione clinica nell'uomo. In questo modello, sarà esaminata l'ipotesi che le alterazioni quantitative e/o qualitative nell'espressione del recettore P2 vadano di pari passo con il decorso della malattia. Tali alterazioni nell'espressione del recettore P2 saranno esaminate sia a livello del mRNA, che al livello della proteina a tempi e stadi diversi di malattia. Questi risultati "molecolari" saranno correlati con parametri morfologici ed emodinamici ottenuti dall'esame ecocardiografico utilizzando una sonda speciale per piccoli animali e dalle registrazioni delle curve pressione-volume, usando micro-cateteri appositamente progettati. La tecnica di microdissezione "laser-capture" sarà utilizzata anche in questo modello sperimentale per la caratterizzazione del tipo(i)cellulare coinvolto.
- ANALIZZARE LE MODIFICAZIONI del proteoma e le interazioni proteina/proteina dei recettori P2 nel cuore di ratti scompensati.
- DETERMINARE IL RUOLO FISIOPATOLOGICO DEI RECETTORI P2 NELLO SCOMPENSO CARDIACO. Per realizzare questo obiettivo, i topi MLP-/- saranno trattati cronicamente con differenti agonisti ed antagonisti dei recettori P2 per verificare se queste sostanze possano modificare il corso della malattia. I topi MLP-/- saranno sottoposti periodicamente ad esame ecocardiografico, come pure la mortalità sarà registrata e confrontata con quella che si verificherà in animali trattati con placebo.
Sulla base dei risultati della prima parte dello studio che evidenzi i cambiamenti dei sottotipi specifici del recettore P2 durante lo sviluppo di CHF, verranno selezionati i ligandi del recettore P2 da utilizzare in vivo nel modello murino MLP-/- di scompenso cardiaco. Numerosi agonisti ed antagonisti non selettivi e selettivi per i sottotipi del recettore P2 sono disponibili presso le diverse unità partecipanti al progetto. Questi includono gli antagonisti non selettivi PPADS e reactive Blue2 e gli antagonisti relativamente selettivi per i sottotipi TNT-ATP (P2X1, P2X3), Ip5Ï (P2X1), Kn-62 (P2X7), MRS2179 (P2Y1), Ar-c69931mx (P2Y12 e P2Y13). Fra gli agonisti, relativamente ai composti resistenti all'idrolisi che possono essere utili per gli studi in vivo sono inclusi il benzoile-ATP (recettori P2X), alfa e beta-metilenATP (P2X1, P2X3), ADPbetaS e 2MeSADP (P2Y1, P2Y12, P2Y13) e 5BrUTP (P2Y2). Se necessario, ligandi supplementari ed agonisti ed antagonisti saranno ottenuti attraverso la collaborazione già esistente dell'unità de Milano con i gruppi di ricerca nazionali e stranieri.
Infine si provvederà all'
- INSERIMENTO DEI RISULTATI OTTENUTI IN UNA BANCA DATI SPECIFICA: Si inseriranno le mappe bidimensionali, ottenute nel coro del progetto di ricerca nella banca dati SIENA-2D-PAGE (http://www.bio-mol.unisi.it/2d/2d.html) specifica per gel bidimensionali. <<<

Risultati parziali attesi

Alla fine della fase 1 i risultati attesi possono essere riassunti come segue:

a)Messa a punto da parte dell'Unità 1 di Siena delle tecniche di valutazione dell'espressione dei recettori P2 nei PBMC con la RT-PCR e con l'analisi western blot e, in un secondo tempo, per mezzo della real-time PCR. L'attenzione verrà focalizzata su quei recettori le cui modificazioni siano state dimostrate in omogenati cardiaci sulla base dei dati della Unità 2 di Milano;
b) Messa a punto da parte dell'Unità 2 di Milano dell'approccio metodologico allo studio della presenza e dell'espressione dei recettori P2 e degli oGPCR nelle caveolae isolate nei cuori umani e della tecnica per l'isolamento dei fibroblasti cardiaci da questo tessuto;
c)Messa a punto da parte dell'Unità 4 di Napoli della real-time PCR applicata allo studio dei recettori P2X e P2Y in singole cellule ottenute da cuori di topo con tecnica di microdissezione a cattura laser;
d) reclutamento di pazienti CHF in corso di valutazione per l'ingresso in lista per trapianto cardiaco; è ragionevole prevedere un numero di 4-5 pazienti arruolati nei primi quattro mesi;
e) in accordo con il punto d), 4-5 campioni di PBMC saranno conservati durante la prima fase;
f) conservazione di un certo numero di cuori espiantati da fornire alle altre Unità; sulla base del numero di trapianti cardiaci per anno a Siena (25-30), possiamo realisticamente prevedere che almeno 6-7 cuori espiantati saranno disponibili per la conservazione;
g) costruzione di alcune mappe elettroforetiche bidimensionali e identificazione preliminare di alcune specifiche proteine possibilmente soggette a modificazioni nel tessuto miocardico e nei PBMC di pazienti CHF e di soggetti di controllo;I risultati attesi possono essere così riassunti:
a) Mappa completa di tutti i recettori P2X e P2Y noti a livello miocardico (cuori sani e scompensati).Questa analisi sarà anche estesa ad alcuni selezionti oGPCR simil-P2Y presenti nel genoma umano, gettando quindi le basi per la loro de-orfanizzazione e per l'identificazione del loro ruolo nella fisiopatologia cardiaca
b) Evidenza di modificazioni dell'espressione recettoriale P2 e oGPCR nei PBMC quale possibile biomarcatore di scompenso cardiaco e di recupero funzionale nell'uomo, come dimostrato dalla possibile normalizzazione dopo trapianto di cuore;
c) Informazioni sull'influenza in vitro di specifici recettori P2 sulla vitalità cellulare e sulla suscettibilità alla morte cellulare indotta da agenti di cui si conosce il contributo nella progressione di CHF;
d) Informazioni sulla interazione proteina/proteina dei recettori P2 in cuori umani normali e patologici;
e) Possibile comprensione della sequenza di trasduzione del segnale recettoriale P2 (espressione,localizzazione in caveole e disponibilità alla attivazione del segnale) sia in condizioni fisiologiche che patologiche (CHF);
f) Impulso, allo sviluppo di un nuovo approccio farmacologico al CHF basato sulla modulazione purinergica, sulla base dei dati di fisiopatologia nell'uomo e degli effetti farmacologici di agonisti e/o antagonisti dei recettori purinergici nel modello animale di scompenso cardiaco;
g) Evidenza di modificazioni del proteoma o di subproteomi nel miocardio in fase di scompenso; eventuale dimostrazione dell'espressione di nuove proteine nel miocardio e in PBMC di pazienti CHF;
h) Inclusione dei gel bidimensionali di riferimento, ottenuti in questo lavoro, insieme alle proteine umane e di ratto identificate, nel database SIENA-2DPAGE (http//www.bio-mol.unisi.it/2d/2d.html) specifico per le immagini di gel bidimensionali, costruito ed aggiornato dall'Unità 3 di Siena ed accessibile via Internet.I risultati di questa fase consisteranno nella valutazione finale e nella organizzazione razionale di tutti i dati sperimentali per produrre pubblicazioni scientifiche. Comunque non può essere esclusa la possibilità che anche gli ultimi due mesi dello studio possano essere impiegati per completare l'acquisizione di dati sperimentali. In particolare è possibile che il periodo di follow-up dopo trapianto di alcuni (pochi) pazienti possa essere concluso in questa fase, ottenendo pertanto ulteriori dati sulla normalizzazione dell'espressione recettoriale P2 ed ulteriori informazioni di proteomica in parallelo con la normalizzazione dei parametri emodinamici dei pazienti. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

In questi ultimi anni, nel cuore di pazienti affetti da scompenso cardiaco (CHF) é stata identificata una ampia serie di alterazioni molecolari e cellulari (1-3). Si è così accumulata,tra l'altro, una vasta messe di dati sulle modificazioni funzionali di differenti famiglie di recettori di membrana, specialmente recettori adrenergici e recettori per l'angiotensina II(4-5). Comunque rimane ancora non chiarito l'eventuale nesso causale tra tali modificazioni ed il danno funzionale, la risposta al trattamento, la progressione di malattia ed il destino clinico dei pazienti.
Lo scompenso cardiaco è una patologia caratterizzata da una ridotta funzionalità sistolica, la cui eziopatogenesi rimane ancora parzialmente sconosciuta. Fattori neuro-ormonali (6) ed infiammatori (7-8) giocano un ruolo chiave sia nell'eziopatogenesi che nello sviluppo della disfunzione sistolica e quindi nella progressione della malattia. Le risposte biologiche che si instaurano nelle fasi iniziali della patologia agiscono dapprima come meccanismi compensatori ma possono, successivamente, compromettere definitivamente la funzionalità cardiaca. Sebbene gli agenti farmacologici attualmente impiegati, che hanno come bersaglio enzimi, recettori-canale o recettori accoppiati a proteine G, siano in grado di alleviare alcuni dei sintomi e di ridurre la mortalità, nella maggior parte dei casi non sono in grado comunque di arrestare il declino della funzionalità cardiaca, suggerendo che altri meccanismi possano essere coinvolti. Come abbiamo già accennato, in campioni di tessuto cardiaco umano ed in modelli sperimentali sono state identificate numerose anormalità funzionali e strutturali a carico di proteine cardiache coinvolte nella trasduzione del segnale e nei processi contrattili. Gli studi condotti fino ad ora si sono focalizzati principalmente su alterazioni di specifici candidati proteici o vie metaboliche. Un approccio basato sull'analisi delle modificazioni dell'intero proteoma cardiaco rappresenterebbe un reale avanzamento nella comprensione dei meccanismi patogenetici dello scompenso cardiaco con un notevole impatto sia a livello diagnostico che terapeutico. Il proteoma cellulare rappresenta quell'insieme di proteine espresse in un determinano momento che ne determinano il fenotipo; diversamente dall'informazione che deriva dall'analisi genomica, diversi processi trascrizionali, post-traslazionali o di splicing possono influenzare dinamicamente il proteoma cellulare (9). Un approccio proteomico fornisce gli strumenti per studiare il prodotto finale dell'espressione genica, consentendo di valutarne non solo l'identità e la quantità ma anche le eventuali modificazioni. La struttura e la funzionalità cardiaca sono influenzate da una collettività di proteomi appartenenti a diversi tipi cellulari cardiaci, (es. cardiomiociti, fibroblasti) ma anche da proteomi cellulari appartenenti ad altri organi (es. reni) che hanno un notevole impatto sulla fisiologia cardiaca. Sono stati gli studi pionieristici condotti negli anni novanta da Dunn (10) e Jungblut(11)che hanno permesso di creare i primi "databases" relativi a mappe di riferimento ottenute mediante l'elettroforesi bidimensionale (2D) di tessuto cardiaco umano, canino e murino. Fino ad ora sono stati condotti numerosi studi di proteomica in modelli animali di cardiomiopatie dilatative, in cui si è osservata una alterazione quantitativa di più di 40 proteine strutturali, proteine coinvolte nel metabolismo energetico, contrattile e nella sopravvivenza cellulare. Tuttavia, a fronte di questi studi basilari, solo una piccola percentuale del proteoma cardiaco è stata identificata in quanto un'analisi globale del tessuto cardiaco non permette di visualizzare quelle proteine che sono poco espresse e che inevitabilmente vengono mascherate da quelle costitutive più abbondanti. La maggior parte delle molecole responsabili della trasduzione del segnale sono presenti in quantità relativamente bassa ma concentrate in strutture di membrana altamente specializzate; sulla base di queste premesse l'analisi di un subproteoma di compartimenti cellulari permetterebbe di visualizzare quelle proteine che sono generalmente sottostimate in un'analisi globale di un omogenato crudo. Un esempio di compartimento cellulare altamente specializzato è rappresentato dalle caveolae, strutture di membrana in cui si concentrano selettivamente recettori e trasduttori del segnale ad esse associati. Numerosi recettori accoppiati a G proteine, che svolgono un ruolo importante per la funzionalità cardiaca (es recettori muscarinici, recettori adrenergici e adenosinici) (12), possono traslocare in caveoale in seguito a stimolazione, suggerendo quindi che queste strutture potrebbero contribuire in modo dinamico ad una rapida e selettiva attivazione/disattivazione dei meccanismi di trasduzione del segnale (13). Inoltre la recente introduzione in ricerca di topi knockout per la caveolina ha fornito un utile strumento di indagine per comprendere il ruolo fisio-patologico esplicato dalle caveolae. L'osservazione più interessante che è emersa dallo studio dei fenotipi dei topi knockout per caveolina1 e caveolina 3 è quella relativa alla comparsa di una grave cardiomiopatia accompagnata da ipertrofia e dilatazione del ventricolo sinistro (ibidem), suggerendo che modificazioni nella localizzazione di recettori in questi compartimenti possa contribuire all'insorgenza della patologia.
Tra i molteplici fattori che regolano la funzionalità cardiaca si possono annoverare anche i recettori purinergici P1 e P2 (14). I nucleotidi e nucleosidi purinici e pirimidinici extracellulari sono importanti molecole in grado di mediare effetti biologici diversi tramite appunto specifici recettori di superficie cellulare chiamati recettori purinergici (15-17). Sono riconosciute due famiglie di recettori purinergici, i recettori P1 responsivi all'adenosina e i P2, che riconoscono primariamente ATP, ADP, UTP e UDP. I recettori adenosinici P1 sono stati suddivisi nei sottotipi A1, A2A, A2B e A3, tutti accoppiati a proteine G. Sulla base delle differenze nella struttura molecolare e nei meccanismi di trasduzione del segnale, i recettori P2 sono invece suddivisi in due famiglie: recettori accoppiati a canali ionici "ligand-gated" e recettori accoppiati ad una proteina-G denominati rispettivamente recettori P2X e P2Y. In generale i recettori P2X sono implicati nei meccanismi di trasmissione neuroeccitatoria rapida, laddove i recettori P2Y sembrano mediare meccanismi modulatori di risposta più lenti.
Ad oggi sono stati caratterizzati e clonati diversi recettori P2X e P2Y. Sia i recettori P2X che i P2Y sono ampiamente rappresentati nel sistema cardiovascolare e sulle cellule infiammatorie (linfociti, monociti, neutrofili) e possono giocare un ruolo rilevante nella fisiopatologia del CHF.
In un recente studio (18) è stato osservato come nelle cellule del sangue periferico dei pazienti con CHF fosse notevolmente aumentato il numero, l'espressione e l'accoppiamento all'adenilciclasi (sistema di trasduzione tipico di questo recettore) del recettore adenosinico A2A rispetto a soggetti normali paragonabili per età. La "up-regolazione" dei recettori A2A è stata altresì osservata nei cuori espiantati degli stessi pazienti una volta sottoposti al trapianto cardiaco. Infine, nelle cellule di sangue periferico di un gruppo di pazienti seguiti longitudinalmente dopo il trapianto cardiaco, i parametri del recettore A2A periferico tendevano progressivamente a tornare a valori normali entro 6 mesi. Avendo quindi stbilita una diretta correlazione tra l'espressione dei recettori nelle cellule di sangue periferico e quella dei recettori miocardici, tali risultati potrebbero aprire la possibilità di utilizzare la misurazione di questi recettori purinergici come indice prognostico/diagnostico di malattia cardiaca e per la monitorizzazione delle modificazioni emodinamiche e dell'efficacia del trattamento farmacologico e non farmacologico nei pazienti con CHF. Questi risultati hanno inoltre suggerito per la prima volta che il modo di essere di questo recettore, sia nelle cellule di sangue periferico che in quelle miocardiche di pazienti affetti da CHF, possa essere indicativo del grado di attivazione delle cellule infiammatorie infiltranti il miocardio scompensato. Per quanto riguarda invece i recettori purinergici P2 abbiamo attualmente scarse infomazioni circa la loro presenza a livello cardiaco e circa le loro possibili modificazioni in corso di CHF. Fino ad oggi sono stati identificati sette recettori P2X (P2X1-7) e nove recettori P2Y (17,19-20), anche se il loro numero è destinato ad aumentare, dal momento che numerosi recettori a G-proteina "orfani" (circa 350 recettori clonati per i quali non è ancora stato identificato il ligando endogeno)(21 mostrano caratteristiche strutturali molto simili a quelle dei recettori P2Y, da questo puno di vista vedi la recente de-orfanizzazione del GPR80, attualente riconosciuto come P2Y15 (22).
Esiste in letteratura un certo grado di evidenza riguardo alle variazioni dell'espressione del recettore P2 in modelli sperimentali di scompenso di cuore ed in pazienti affetti da CHF. E' stata documentata una "down-regulation" dei recettori P2X1 nei vasi arteriosi di resistenza nei ratti con scompenso cardiaco successivo ad infarto miocardico sperimentale (23). In due pazienti con CHF dovuto a cardiomiopatia dilatativa sottoposti a trapianto di cuore, è stata osservata una "up-regulation" dei recettori P2X1 e P2Y2 nei cardiomiociti (24). Nello stesso lavoro, un simile atteggiamento nell'espressione dei recettori P2X e P2Y è stato dimostrato sia nel cuore di ratto che nel cuore umano. Dati preliminari di una delle Unità partecipanti a questo programma di ricerca (Unità 2 Milano) sembrerebbero indicare che nel cuore umano sono espressi distinti sottotipi recettoriali P2 (sia P2X che P2Y) e che alcuni di questi recettori potrebbero andare incontro ad "up-" o a "down-regulation" nel CHF,rafforzando ulteriormente la necessità di caratterizzare in maggior dettaglio il ruolo fisiopatologico dei recettori P2X e P2Y nello sviluppo e nella progressione del CHF. Sulla base di dati di letteratura che dimostrano come l'ATP abbia un effetto sul cronotropismo e sull'inotropismo cardiaci (vedi: Pelleg e Vassort, in Abbracchio MP e Williams M edit., Purinergic e pyrimidinergic signalling, Handbook of Experimental Pharmacology 151II, Springer 2001, pag. 73-90)(14), si può ipotizzare che i cambiamenti nella espressione e nella funzione dei recettori P2 possano rappresentare una risposta compensatoria mirata al potenziamento dell'inotropismo miocardico e alla riduzione della vasocostrizione periferica. Al momento non esistono dati riguardanti l'espressione di tutti i recettori clonati,P2X e P2Y, nelle cellule mononucleate di sangue periferico (PBMC), né in condizioni normali, né in corso di CHF
Come detto, l'ATP, a livello cardiaco, esercita effetti inotropi, cronotropi positivi e potenzialmente aritmogeni, influenzando anche numerose correnti ioniche (ibidem). Tuttavia, sulla base delle conoscenze attuali, non è ancora possibile attribuire le varie azioni esercitate dall'ATP a livello cardiaco all'attivazione di specifici sottotipi recettoriali o attribuire ai recettori P2 un ruolo nella patogenesi dello scompenso, sebbene alcuni recettori P2 siano coinvolti in processi di morte (es P2X7) o di protezione cellulare (es P2Y6). E' stato osservato che l'ATP è in grado di prevenire le modificazioni ipertrofiche indotte da fenilefrina, suggerendo un ruolo protettivo per questo nucleotide nello sviluppo della cardiomiopatia dilatativa (24). L'ampia eterogeneità di sottotipi recettoriali permette di ipotizzare l'esistenza di fenomeni di reclutamento e/o internalizzazione specifici per alcuni di essi a livello della membrana plasmatica o in microdomini specializzati che possono variare in relazione alla funzionalità cardiaca. Inoltre, alla luce del recente interesse per il ruolo di recettori "orfani" nel sistema cardiovascolare (25), altri recettori a G-proteina "orfani" correlati strutturalmente alla famiglia P2Y potrebbero giocare ruoli fondamentali nel mantenimento della funzionalità cardiaca. Sarebbe quindi interessante valutare la presenza di questi recettori nel cuore umano e definirne le possibili variazioni d'espressione di interazione proteina-proteina nello scompenso. Globalmente queste informazioni potrebbero essere d'ausilio per meglio delineare il ruolo dei recettori P2 nel sistema cardiovascolare. In cellule stabilmente trasfettate con il recettore P2X7, sono state recentemente individuate delle interazioni specifiche con proteine cardiache quali integrine, laminine, heat shock proteins e proteine del citoscheletro (26). Lo studio quindi di interazioni proteina-proteina potrebbe fornire le basi per la comprensione dell'architettura dei recettori P2 sia in condizioni fisiologiche che patologiche, permettendo di individuare bersagli farmacologici specifici per il trattamento dello scompenso cardiaco. <<<