RICERCA ITALIANA     

Identificazione di nuovi bersagli farmacologici per il controllo di patologie infiammatorie e autoimmuni

Università degli Studi di Brescia

Abstract

Questo progetto mira a promuovere le conoscenze sulle basi patogenetiche del processo infiammatorio e a individuare nuovi potenziali bersagli terapeutici per il controllo di questa risposta biologica. Per raggiungere questi obiettivi il progetto pone le sue basi sull'interazione di sette gruppi, ognuno dotato di conoscenze specifiche in settori diversi ma complementari; tutti caratterizzati da una riconosciuta competenza e autorevolezza a livello internazionale nel campo dell'immunopatologia della risposta infiammatoria. Il progetto si articola in sottoprogetti che mirano ad approfondire specifici aspetti molecolari e biologici di base con il fine di porli in stretta correlazione con situazioni cliniche. Saranno oggetto di questo studio citochine chemiotattiche e infiammatorie, molecole di adesione, enzimi responsabili della biosintesi dei prostanoidi e secondi messaggeri coinvolti nell'attivazione dei fagociti mononucleati, delle cellule NK, delle cellule dendritiche e delle cellule endoteliali. Le cellule dendritiche, con la loro peculiare abilità di innescare l'immunità specifica costituiranno un'area di interesse trasversale per molte delle unità operative. Un particolare interesse verrà rivolto alle cellule dendritiche plasmacitoidi, recentemente riconosciute come le principali cellule responsabili della produzione di interferone di tipo I nell'ambito di patologie autoimmuni quali il Lupus Eritematoso Sistemico. Questo progetto è animato da una forte tensione che mira a coniugare la ricerca di base con la ricerca applicata. Questa interazione è assicurata dalla presenza di due gruppi di particolare rilievo nell'ambito dell'immunologia clinica. La ricerca di base avrà il compito di stimolare e supportare la ricerca clinica. La ricerca clinica sarà diretta in larga misura alle patologie su base immunitaria che caratterizzano le malattie interstiziali del polmone, ai meccanismi immunitari alla base del rigetto di allo trapianto e a una patologia autoimmune caratterizzata da una particolare variabilità di espressione e tropismo d'organo quale il Lupus Eritematoso Sistemico. I gruppi clinici e i gruppi di base fungeranno da stimolo reciproco per lo sviluppo delle linee di ricerca e la successiva interpretazione dei risultati. Entrambi gli approcci, clinico e di base, saranno supportati dalla disponibilità di tecnologie avanzate quali l'analisi del trascrittoma cellulare mediante microarrays oligonucleotidici (Affimetrix) e la microdissezione tissutale con tecnologia laser. La consapevolezza dell'assoluta necessità di un approccio altamente integrato tra competenze di base e cliniche per il conseguimento di obiettivi avanzati nell'ambito della ricerca biomedica si trova qui rafforzata dall'intensa rete di collaborazioni che i gruppi coinvolti in questo progetto hanno sviluppato negli anni passati, e in particolare, nel corso dello scorso progetto biennale. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Silvano SOZZANI Università degli Studi di BRESCIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Questo programma di ricerca è la continuazione di un progetto precedentemente finanziato che ha permesso di creare una rete collaborativa tra gruppi che hanno una consolidata esperienza sui molteplici aspetti della fisiopatologia del processo infiammatorio. Il presente progetto si pone due obiettivi principali. Il primo, quello di contribuire in modo significativo a migliorare le attuali conoscenze sulla fisiopatologia dei processi infiammatori. Il secondo consiste invece nell'identificare nuovi possibili bersagli terapeutici per il controllo della risposta infiammatoria e immunitaria. Per perseguire questi obiettivi, è stata delineata una strategia basata sullo studio di patologie di tipo infiammatorio (sarcoidosi, fibrosi polmonari), autoimmune (Lupus Eritematoso Sistemico), immunitario (rigetto di allo trapianto di polmone). Il programma di ricerca si modella sulle attuali conoscenze dei meccanismi molecolari patogenetici dell'infiammazione, i quali definiscono questa risposta come uno spettro complesso di eventi distinti, ma intimamente coordinati. Il programma coinvolge sette Unità Operative (UO) che negli anni passati si sono distinte a livello internazionale per lo studio di specifici aspetti della biologia e della patologia della risposta infiammatoria. La presenza di UO che si collocano in ambito clinico servirà a garantire che le conoscenze sviluppate dai gruppi più strettamente di base possano essere interpretate e indirizzate verso obiettivi di chiara rilevanza per la fisiopatologia umana.
Le attuali conoscenze definiscono la risposta infiammatoria come uno degli aspetti più significativi di svariate situazioni patologiche, quali artriti, polmoniti, aterosclerosi, reazioni di tipo allergico (quali asma e dermatiti), autoimmune (quali artrite reumatoide, sclerosi multipla, lupus eritomatoso sistemico), infettive e tumorale. Il processo infiammatorio è regolato da una complessa rete di segnali di natura proteica e lipidica prodotti dai leucociti e dalle cellule di barriera (endoteli e epiteli) che ne determinano l'instaurarsi e ne condizionano l'evoluzione nel tempo. L'azione combinata di questi segnali ha il ruolo di indirizzare al focolaio infiammatorio, e successivamente di attivare, i leucociti. Questo compito è svolto mediante la produzione coordinata di proteine di membrana (come ad esempio molecole di adesione) e proteine secrete (fattori chemiotattici e citochine). Il corretto svolgimento di questa risposta è garantito dall'azione combinata di mediatori con attività pro-infiammatoria e anti-infiammatoria. I mediatori dell'infiammazione che caratterizzano le fasi iniziali della risposta svolgono anche un ruolo cruciale nell'istruire e nell'attivare l'immunità specifica. Cellule appartenenti al sistema immunitario, quali linfociti e macrofagi attivati, cellule dendritiche, polimorfonucleati neutrofili, eosinofili e mast-cellule e anche cellule di natura non strettamente immunologica quali i fibroblasti, le cellule epiteliali e le cellule endoteliali, partecipano a vario livello alle fasi dell'infiammazione. Un ruolo peculiare in questo processo è svolto dalle cellule che presentano l'antigene, quali i macrofagi e le cellule dendritiche. Queste cellule si collocano all'interfaccia tra l'immunità innata e l'immunità specifica e hanno il compito di captare l'antigene e di contribuire alle fasi iniziali dell'infiammazione mediante la produzione di citochine pro-infiammatorie. Successivamente, le stesse cellule avranno i compito di istruire i linfociti T e indirizzarli verso una risposta di tipo T helper 1 (Th1) o Th2 mediante la sintesi di proteine di superficie e la secrezione regolata di citochine (es. IL-12 e Interferone di tipo I). In virtù del ruolo unico e altamente specializzato che svolgono, le cellule dendritiche sono responsabili sia dell'attivazione, che della mancata attivazione (tolleranza), di una risposta immunitaria verso un determinato antigene. Un'altro tipo cellulare che interviene nella modulazione della risposta infiammatoria è rappresentato dalle cellule NK. Queste cellule si localizzano rapidamente nei siti infiammatori dove sono in grado di produrre una ampia varietà di citochine e chemochine nonché di mediatori pro infiammatori quali ossido nitrico e metaboliti dell'acido arachidonico. Per queste loro capacità le cellule NK possono sia modulare la funzione dei macrofagi e la maturazione delle cellule dendritiche sia contribuire al reclutamento di ulteriori effettori nel sito infiammatorio. Infine, la barriera dell'endotelio vascolare tramite il controllo delle sue proprietà adesive rappresenta un importante livello di regolazione del reclutamento tissutale.
L'insorgere della risposta infiammatoria e immunitaria è quindi determinato da una serie di circostanze distribuite temporalmente, ognuna delle quali in grado di condizionare in modo qualitativo e quantitativo quella successiva. La possibilità di intervenire in questa sequenza di eventi può permettere di controllare sia l'insorgere che il tipo di risposta. L'obiettivo di questo progetto è quello di individuare nuovi punti strategici per il controllo del processo infiammatorio. Per questo fine, quattro UO (3, 5-7), ognuna caratterizzata da specifiche competenze nell'ambito dei meccanismi molecolari del processo infiammatorio (chemochine, cellule dendritiche e NK, molecole di adesione e mediatori lipidici) si affiancheranno a due gruppi (UO 1 e 2) con riconosciute competenze nell'ambito della fisiopatologia dell'infiammazione del polmone e delle risposte autoimmuni. Sia le UO di base che quelle cliniche potranno avvalersi, nell'ambito di questo progetto, di tecnologie avanzate quali la tecnologia Affimetrix (micro array oligonucleotidici) per lo studio del profilo trascrizionale di selezionate popolazioni cellulari. Questa tecnica permette di studiare l'intero genoma umano mediante l'utilizzo combinato di due array non sovrapposti per un totale di oltre 30.000 geni. Questa tecnica è attualmente in uso da parte dell'UO 4 e verrà messa a disposizione di tutti i partecipanti a questo progetto. Ci si attende che questo approccio altamente integrato abbia una forte valenza sinergica per le singole UO e permetta di raggiungere gli obiettivi specifici prefissati, così come delineati nella sezione 2.5. <<<

Risultati parziali attesi

In generale, ci si attende che i risultati di questo progetto permettano di ottenere nuove informazioni sui meccanismi patogenetici alla base dello sviluppo delle malattie infiammatorie e autoimmuni. Ci si aspetta che questa indagine porti anche all'identificazione di nuovi markers dell'infiammazione che possano rappresentare il presupposto sperimentale di nuove strategie farmacologiche mirate a inibire o controllare un eccessiva attivazione della risposta infiammatoria. Sulla base dei progetti dettagliati nei vari modelli B si possono riassumere schematicamente i seguenti risultati attesi:

UO #1
- Caratterizzazione delle chemiochine prodotte in diverse patologie polmonari (infiammatorie, allergiche, autoimmuni, rigetto di allotrapianto) e correlazione con il tipo di risposta immunologica Th1 (alveolite/granuloma) o Th2 (fibrosi)
- Identificazione del possibile ruolo attivatorio di sPLA2 su cellule del BAL ottenute durante le varie fasi della malattia interstiziale polmonare
- Caratterizzazione dell'espressione di ChemR23 e di HCR in patologie infiammatorie polmonari
- Caratterizzazione dell'espressione di RAGE in pazienti con alveolite, granulomi e in corso di fibrosi polmonare

UO #2
- Identificazione quantitativa e fenotipica delle cellule dendritiche plasmacitoidi in biopsie da pazienti affetti da LES
- Identificazione quantitativa e fenotipica delle cellule dendritiche plasmacitoidi in biopsie da pazienti affetti da malattia di Kikuchi-Fujimoto
- Caratterizzazione funzionale delle cellule dendritiche plasmacitoidi purificate da sangue periferico di pazienti con LES
- Caratterizzazione delle interazioni funzionali delle cellule dendritiche plasmacitoidi con altre cellule presenti nel microambiente LES/MKF
- Caratterizzazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi nel modello murino di LES

UO #3
- Identificazione di elementi chiave della trasduzione del segnale attivata dal crosslinking di integrine in cellule NK
- Identificazione dei meccanismi di regolazione della migrazione e trasmigrazione di cellule NK da parte dei recettori per MHC di classe I
- Identificazione della capacità delle integrine di modulare l'espressione di citochine, chemochine e recettori per chemochine su cellule NK

UO #4
- Caratterizzazione del profilo trascrizionale indotto da chemochine Th1 e Th2 in monociti umani
- Caratterizzazione del profilo trascrizionale associato all'attivazione e polarizzazione macrofagica
- Caratterizzazione del profilo trascrizionale presente in macrofagi alveolari di soggetti sani e di pazienti con patologie infiammatorie polmonari
- Supporto teorico e pratico per l'analisi del profilo trascrizionale nelle diverse condizioni sperimentali così come definite dalle altre UO

UO#5
- Identificazione dei meccanismi di sintesi del PAF in monociti, macrofagi e cellule dendritiche
- Indagine sulla possibilità di interferire nei meccanismi di adesione di leucociti di origine mieloidi all'endotelio attraverso il controllo delle diverse vie metaboliche del PAF
- Analisi del ruolo degli inibitori selettivi per le varie forme di PLA2 secretoria nell'adesione cellulare

UO #6
- Caratterizzazione dell'espressione di ChemR23 in cellule dendritiche in vitro e in vivo
- Caratterizzazione dell'espressione e funzione di L-CCR da parte di cellule dendritiche in vitro e in vivo
- Identificazione del profilo trascrizionale di chemerina su cellule dendritiche e macrofagiche
- Identificazione del ruolo biologico di L-CCR in modelli di patologie infiammatorie e autoimmuni nel topo ko per questo recettore
- Identificazione del ruolo regolatorio di PLA2 secretorie su cellule dendritiche umane

UO #7
- Identificazione delle isoforme di PLA2 in cellule (monociti, eosinofili, macrofagi polmonari e cellule dendritiche) stimolate in vitro con chemochine
- Identificazione dei meccanismi molecolari di regolazione del recettore M per le PLA2 secretorie in cellule di origine mieloidi
- Identificazione del ruolo di cPLA2 e sPLA2 sulla sintesi di citochine e chemochine in cellule di origine mieloide <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Questo progetto trae le proprie basi dalle recenti scoperte che hanno evidenziato come il processo infiammatorio sia alla base della patogenesi di molte malattie sia di origine strettamente infiammatoria/immunitaria che di natura diversa. Le principali cause di questo fenomeno sono da ricercarsi nel danno tissutale associato al reclutamento e all'attivazione leucocitiria ad opera di citochine e mediatori lipidici prodotti al sito infiammatorio. Le citochine pro infiammatorie, quali IL-1 e TNF, rappresentano segnali importanti che innescano la cascata delle citochine infiammatorie e determinano la produzione delle chemochine e dei mediatori dell'infiammazione. La produzione locale di mediatori lipidici quali il PAF (platelet activating factor) e le fosfolipasi A2 (PLA2) e l'attivazione delle molecole di adesione, presenti sia sui leucociti che sull'endotelio, rappresentano importanti circuiti di amplificazione dell'attivazione leucocitaria. (1).

Nel corso degli anni passati, le UO che appartengono a questo progetto, hanno fornito contributi di rilievo scientifico internazionale a vari aspetti della fisiopatologia della risposta infiammatoria. Alcuni di questi risultati sono stati ottenuti nell'ambito dello scorso "Progetto COFIN". Infatti, i gruppi di questa rete collaborativa hanno prodotto nel biennio 2002-2003 ottanta lavori scientifici pubblicati su riviste internazionali, che includono Nature Medicine, J. Exp. Medicine, Proceeding of National Academy of Science, Trends in Immunology, Blood e J. ofImmunology. L'UO 6 ha clonato e successivamente caratterizzato nuove chemochine (MDC/CCL22 e MIP-3alfa/CCL20) (2, 3) e nuovi recettori per fattori chemiotattici (CCR6 e ChemR23) che svolgono una funzione importante nella migrazione delle cellule dendritiche immature (4, 5). Il ruolo principale delle chemochine è quello di indurre la trasmigrazione dei leucociti attraverso la barriera endoteliale e di indirizzarli verso il sito infiammatorio. Il microambiente infiammatorio, costituito di citochine, prodotti del complemento e mediatori lipidici è in grado sia di inibire che di stimolare l'infiltrato cellulare. Ad esempio, le UO 4 e 6 hanno dimostrato che il PAF (platelet activating factor) agisce in modo sinergico con le chemochine per promuovere il processo chemiotattico (6, 7). L'UO 5 ha contribuito a definire i meccanismi biochimici attraverso cui l'endotelio vascolare produce il PAF (8). Una delle vie che portano alla produzione di PAF dipende dall'attivazione della PLA2, una classe di enzimi che idrolizzano gli acidi grassi in posizione sn-2 dei fosfolipidi. Nel corso dell'ultimo decennio sono stati identificati dodici gruppi principali di PLA2 (gruppo I-XII). Alcune PLA2 sono ad alto peso molecolare e si trovano localizzate a livello citosolico (cPLA2), mentre altre sono proteine a basso peso molecolare, localizzate generalmente all'interno di granuli e rapidamente secrete in risposta a stimoli di natura diversa (sPLA2). Le UO 4 e 6 hanno dimostrato, attraverso l'utilizzo di oligonucleotidi antisenso, che la cPLA2 svolge un ruolo essenziale nella risposta chemiotattica dei monociti umani a chemochine (9). Tale studi sembrano avere una valenza terapeutica alla luce dell'efficace utilizzo di inibitori specifici della cPLA2 in vivo in un modello di sepsi polmonare (10). Studi recenti condotti dall`UO 7 hanno profondamente modificato le attuali conoscenze sul coinvolgimento delle PLA2 nell'ambito della risposta infiammatoria. Infatti il ruolo delle PLA2 nell'infiammazione non si esaurisce con l'idrolisi dell'acido arachidonico e con l'inizio della via biosintetica dei mediatori lipidici, ma si estende ad altri meccanismi di attivazione e regolazione cellulare. L'UO 7 ha dimostrato che le sPLA2 sono potenti induttrici della sintesi e del rilascio di IL-6, di TNF e di chemochine (IL-8, MIP-1alfa, MIP-1beta e MCP-1) da parte di monociti e da macrofagi polmonari umani (11, 12). Queste azioni sono indipendenti dalla loro attività enzimatica e sono mediate dall'interazione con recettori specifici di membrana (11, 12). Dall'insieme di queste osservazioni appare evidente che le PLA2 svolgono un ruolo importante in diverse fasi del processo infiammatorio. Questo ruolo è confermato dalla presenza di elevati livelli di PLA2 nel plasma di pazienti con malattie infiammatorie e autoimmuni sistemiche, quali ARDS e artrite reumatoide (13), nei siti di infiammazione locale (lavaggio bronchiale di pazienti con asma e di pazienti con morbo di Crohn) (14, 15) e dall'aumentata espressione di questi enzimi in diversi tipi di neoplasia (16, 17).
Studi recenti hanno dimostrato che il ruolo delle chemochine nel processo infiammatorio va ben oltre l'azione di stimolo chemiotattico. Infatti, l'UO 4 ha dimostrato come le chemochine siano in grado di modulare le proprietà funzionali delle cellule bersaglio inducendo un programma genico peculiare e distinto da quello indotto dall'azione di agenti infiammatori classici, quali l'endotossina batterica. Questi dati sono stati ottenuti studiando il profilo trascrizionale di monociti umani stimolati con RANTES, una chemochina che attiva i recettori CCR1 e CCR5 e utilizzando un approccio tecnologico estremamente avanzato basato sull'utilizzo di microarrays oligonucleotidici (Affimetrix) (18). I risultati ottenuti evidenziano che RANTES è in grado di indurre la trascrizione di geni per chemochine, per recettori di chemochine e per proteasi. Le chemochine quindi non solo promuovono la migrazione cellulare, ma provvedono a "equipaggiare" il leucocita con gli strumenti necessari per svolgere al meglio la risposta chemiotattica. Le potenzialità di questo approccio tecnologico sono enormi e saranno di grande importanza per il lavoro condotto da tutte le UO facenti parte di questo progetto.
I recettori per stimoli chemiotattici sono responsabili dell'attivazione delle integrine leucocitarie e di promuovere l'adesione dei leucociti all'endotelio vascolare (19). L'interazione delle integrine leucocitarie con i controrecettori presenti sulle cellule endoteliali genera un complesso spettro di segnali di attivazione. L`UO 3 ha descritto che l'ingaggio di integrine della famiglia beta 1 e beta 2 stimola la produzione di fattori chemiotattici (IL-8) e di citochine (interferone gamma) che sono in grado di regolare la risposta immunitaria (20). L'attivazione di integrine beta 1 svolge anche un compito regolatorio, rappresentando un segnale di feedback negativo attraverso l'inibizione della secrezione di sPLA2 e dell'attivazione della fosfolipasi D (21). I segnali biochimici attivati dalla integrine beta 2 e coinvolti nella migrazione cellulare sono stati recentemente identificati dall'UO 3 nelle proteine PyK2 e RAC (22). Lo sviluppo di strategie in grado di interferire con l'attivazione delle molecole di adesione o di alcune loro vie di trasduzione potrebbe quindi fornire nuove importanti indicazioni per il controllo delle fasi precoci della risposta infiammatoria.
La rilevanza dell'espressione di chemochine nell'accumulo leucocitario presente in situazioni patologiche è ormai ampiamente dimostrato (23, 24). L'UO 1 ha descritto il ruolo cruciale svolto da IP-10/CXCL10 nel reclutare linfociti Th1 nell'ambito delle patologie interstiziali polmonari, nella sarcoidosi (25-27) e nel corso del rigetto di allotrapianto polmonare (28). Attualmente per spegnere i processi infiammatori che caraterrizzano le fasi iniziali delle malattie interstiziali si utilizzano farmaci antinfiammatori e/o immunosoppressivi. La possibilità di identificare in dettaglio i segnali coinvolti nel reclutamento cellulare in queste situazioni patologiche potrebbe fornire nuovi strumenti per il controllo della risposta infiammatoria.
L'espressione dei recettori per chemochine è di particolare importanza per la funzione delle cellule dendritiche. L'UO 6 ha descritto negli anni passati i meccanismi che regolano il drammatico cambiamento del repertorio dei recettori per chemochine espressi dalle cellule dendritiche a diversi stadi maturativi e funzionali (4, 29) e in diverse sottopopolazioni di cellule dendritiche (30). Recentemente, l'UO 6 ha identificato un nuovo recettore per chemochine, ChemR23, che sembra giocare un ruolo importante nella localizzazione delle cellule dendritiche ai siti infiammatori. L'UO 2 ha contribuito in modo fondamentale nel definire il concetto di eterogeneità delle cellule dendritiche. La descrizione, da parte di questo gruppo, delle cellule plasmacitoidi che risale alla fine degli anni ottanta (31) ha precorso le attuali conoscenze sull'esistenza di questa sottopopolazione di cellule dendritiche caratterizzata da "markers fenotipici" peculiari, quali l'espressione di CD31, CD36 e CD123, la catena alfa del recettore di IL-3, nell'uomo, (32), e un nuova proteina di membrana riconosciuta dall'anticorpo mab440c, nel topo (33). Le cellule dendritiche plasmacitoidi sono osservabili prevalentemente nel sangue e negli organi linfoidi secondari. Le U O 6 e 2 hanno per prime caratterizzato i segnali chemiotattici responsabili per la selettiva migrazione, in vitro e in vivo, delle cellule dendritiche plasmocitoidi (30, 34, 35). Queste cellule sono specializzate nella produzione di alti livelli di interferone di tipo I (IFN-I) (34). L' IFN-I induce la polarizzazione dei linfociti Th1 e svolge un ruolo protettivo nel corso delle infezioni virali. È importante notare che la produzione di IFN-I da parte delle cellule dendritiche plasmacitoidi contribuisce a malattie autoimmuni quali il LES (36, 37). Le cellule dendritiche plasmacitoidi esprimono alcune peculiari strutture di membrana coinvolte nella captazione degli agenti patogeni e nella loro interazione con i linfociti T. L'UO 2 ha contribuito in modo rilevante alla caratterizzazione di una di queste proteine: BDCA-2 (38). BDCA-2 è proteina a struttura lectinica, espressa esclusivamente dalle cellule dendritiche plasmacitoidi la cui attivazione provoca l'inibizione della secrezione di IFN-I (38). Da questo quadro deriva un forte interesse per BDCA-2 come nuovo possibile strumento farmacologico.
La migliore conoscenza del processo del reclutamento cellulare per le diverse popolazioni leucocitarie e dei segnali intracellulari (e extracellulari) coinvolti nella loro attivazione rappresenta certamente un terreno molto promettente per l'individuazione di nuovi strumenti terapeutici che mirino al controllo selettivo di vari aspetti della risposta immunitaria. Le potenzialità di questo progetto sono ulteriormente avvalorate dalla qualità scientifica dei lavori prodotti da tutte le UO nel corso degli ultimi anni e dall'intensa attività di collaborazioni già presente all'interno di questo gruppo e testimoniata da una ampia serie di pubblicazioni scientifiche congiunte. <<<