RICERCA ITALIANA     

FATTORI PREDISPONENTI L'INFIAMMAZIONE CRONICA DELL'INTESTINO:BATTERI,VIRUS,PERMEABILITA' INTESTINALE E PREDISPOSIZIONE GENETICA

Università degli Studi di Palermo

Abstract

L'infiammazione cronica dell'intestino è caratteristica della colite ulcerosa e della malattia di Crohn. L'etiologia di queste due malattie non è nota. L'ipotesi più accreditata è che antigeni esterni (batterici ? virali ? altro ?)in un terreno geneticamente predisposto determini un attivazione del sistema immune con conseguente infiammazione cronica.
Scopo del presente progetto interdisciplinare è lo studio del ruolo di alcuni fattori predisponenti l'infiammazione cronica nelle malattie infiammatorie croniche dell'intestino (MICI)(colite ulcerosa, pouchite, malattia di Crohn)
Verrano studiati:
a) ruolo della flora batterica nello sviluppo della pouchite , relazione con il pattern genetico e con la permeabilità intestinale
b) ruolo del Citomegalovirus nella patogenesi e nella riattivazione delle MICI e nella pouchite,c) ruolo della permeabilità intestinale nella predisposizione alla diffusione del citomegalovirus e nella risposta alla terapia con Infliximab
d) rapporto tra funzione di barriera intestinale, recettori attivati da proteasi(PAR, molecole costimolatorie e riparazione epiteliale
d) ruolo della predisposizione genetica,mediante studio della
mutazione NOD2 dei geni che codificano le citochine interleukina(IL)-1 e IL-10 ed i TLR
Le 4 unità coinvolte contribuiranno allo svolgimento del progetto scambiando le loro competenze.
L'unità di Bologna (1) valuterà la possibile implicazione dei diversi geni nella insorgenza di pouchite in un gruppo definito di pazienti; valutando eventuali differenze genetiche alla base del diverso comportamento in 3 gruppi di pazienti (pazienti senza pouchite,pazienti con un solo episodio di pouchite e pazienti con pouchite cronica). Saranno studiati i poliformismi del TLR CD14, ed in collaborazione con l'unità 2, i poliformismi di Card15/NOD2.
L'unità di Palermo negli ultimi anni ha analizzato la prevalenza dell'infezione da Citomegalovirus nelle MICI. La prevalenza del virus verrà studiata mediante PCR su biopsie intestinali di pazienti con MICI, trattati o non trattati con immunosoppressori(azatioprina ed infliximab), in pazienti con patologia ematologica sottoposti a trapianto di midollo ed in pazienti di controllo. Verrà inoltre studiata la prevalenza del virus nella pouchite su biopsie fornite dall'unità di Bologna (1). Verrano infine studiati alcuni tra i meccanismi di evasione immunologica del virus; in particolare saranno analizzati i pathway di trasduzione del segnale dell' IFN-alpha e gamma, valutando l'espressione di Jak-1,Jak2,Stat-1,Stat-2 mediante PCR, Western blot ed EMSA su omogenati di biopsie endoscopiche. Verrà infine studiata a Messina(3) e Padova (4) la permeabilità intestinale in questi pazienti per valutare l'eventuale predisposizione al virus.
L'unità di Padova (4) studierà nell'uomo ed in modelli sperimentali(topi transgenici e colture di cellule di epitelio intestinale) la relazione tra la funzione di barriera dell'epitelio intestinale e l'espressione/attivazione dei recettori proteasi attivabili (PAR) e del recettore attivante la proliferazione dei perossisomi gamma (PPAR-gamma) anche in relazione a componenti della flora batterica. Sarà, inoltre, valutato se l'aumento della permeabilità intestinale nei pazienti con IBD favorisca l'infezione da Citomegalovirus. La funzione di barriera , determinata nelle Ussing chambers o medinate misure delle resistenze transepeiteliali, flusso dell'HRP ed espressione delle proteine giunzionali occludina ZO e 7H6, sarà studiata anche in relazione all'espressione di molecole di co-stimolazione e dei processi di riparazione epiteliale.
L'Unità di Messina(003) valuterà la permeabilità intestinale prima e dopo trattamento con Infliximab nella malattia di Crohn sia in pazienti con altre malattie. La stessa unità studierà la permeabilità nell'animale con colite indotta da DNB/etanolo. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Mario COTTONE Università degli Studi di PALERMO

Obiettivo del Programma di Ricerca

Obbiettivo generale del programma è di valutare le interazioni tra antigeni esterni(batterici,virali),permeabilità intestinale,immunosoppressione e predisposizione genetica nelle MICI. I progetti si integrano per la competenza specifica dei diversi centri partecipanti.



Pouchite

Questo studio vuole valutare la possibile implicazione dei diversi geni nella insorgenza di pouchite in un gruppo ben-definito di pazienti con IPAA per colite ulcerosa. Vogliamo studiare se esistono differenze genetiche alla base del diverso comportamento in 3 gruppi di pazienti, uno costituito da pazienti che non hanno mai sviluppato un episodio di pouchite, uno costituito da pazienti che hanno presentato solo un episodio sporadico di pouchite ed un terzo costituito da pazienti con pouchite cronica. Sarà studiato un gruppo di controlli sani come confronto.
I geni di suscettibilità da studiare sono i polimorfismi nei geni che codificano le citochine ed i polimorfismi nei geni che codificano le molecole coinvolte nell'immunità innata
I geni di suscettibilità coinvolti nella immunità innata da studiare sono diversi polimorfismi di Toll-like receptor, CD14 e in collaborazione con unità de ricerca 01 diversi polimorfismi di CARD15/NOD2.
Inoltre, saranno studiati i polimorfismi dei geni che codificano le citochine interleuchina (IL)-1 e IL-10 poichè è stato dimostrato che lo sbilanciamento fra l'espressione della citochina pro-infiammatoria IL-1beta e il suo regolatore negativo IL-1 recettore antagonista ha un ruolo nell'infiammazione cronica. l'IL-10 gioca un ruolo importante nell'individuazione e nel mantenimento dell'omeostasi intestinale.

Cytomegalovirus
1. valutare la prevalenza del citomegalovirus con il metodo di laboratorio più sensibile (PCR) nelle malattie infiammatorie croniche dell'intestino(pazienti immunosoppressi(azatioprina ed Infliximab),in una popolazione di controllo e nei pazienti con patologia ematologica che richiede il trapianto autologo o l'allotrapianto prima e dopo la procedura e
2. valutare la prevalenza nei pazienti con pouchite( biopsie prevalentemente fornite da Bologna)
3. studiare la permeabilità intestinale di questi pazienti per valutare se alterazioni di questo parametro aumenti la predisposizione a questa infezione (valutazione eseguita da Messina e Padova)
4.studiare un meccanismo di evasione immunitaria del virus:il blocco della risposta interferonica mediante un alterazione a multipli livelli del pathway di trasduzione del segnale

Permeabilità e risposta all'infliximab

Scopi dello studio
1. Valutare la permeabilità gastro-intestinale prima e dopo trattamento con anti-TNF a diversi time-points sia in pazienti con malattia di Crohn sia in pazienti con artrite reumatica/spondilite anchilosante (un altro gruppo di patologie con note alterazioni di barriera intestinale);
2. Correlare la permeabilità G-I con indici di flogosi e cito- e chemochine circolanti che potenzialmente possono interferire con l'integrità della barriera epiteliale dell'intestino;
3. Correlare la permeabilità G-I con polimorfismi del NOD2/CARD15 o del TLR4 (toll like receptor-4)(valutazione dei polimorfismi eseguita a Palermo)
II PARTE
Scopi dello studio
Valutare la permeabilità gastro-intestinale nel animale da esperimento (ratto) in corso di colite sperimentale indotta da DNB/etanolo
a. trattamento con anti-TNF (Infliximab, talidomide);
b. trattamento con inibitore del nuclear factor kappaB (curcumina, triptolide);
c. trattamento con inibitori della nitric oxide synthase inducibile L-N6-(-1iminoethyl)lisina (L-NIL).


Permabilità intestinale e recettori attivati

Il presente progetto vuole contribuire a chiarire i meccanismi fisiopatologici dell'infiammazione cronica intestinale mediante la caratterizzazione dei rapporti tra funzione di barriera intestinale ed i recettori attivati da proteasi (PAR), le molecole di co-stimolazione antigenica (CD40, CD40L, B7-1, B7-2, CD28) ed il recettore attivante la proliferazione dei perossisomi g (PPAR-g).
Saranno inoltre valutati gli effetti della manipolazione della flora batterica intestinale e dell'applicazione di fattori trofici per l'epitelio intestinale in relazione alla funzione di barriera intestinale. Studio nell'uomo ed in linee cellulari di epitelio intestinale umano della relazione tra l'espressione dei recettori proteasi attivabili (PAR) e funzione di barriera epiteliale intestinale
Studio nell'uomo della relazione tra espressione di molecole co-stimolatorie e funzione di barriera intestinale
Lo studio sarà condotto sugli stessi pazienti inclusi nello studio sui PAR.
Studio nell'uomo dei rapporti di permeabilità intestinale ed infezione da cytomegalovirus (lo studio sarà condotta presso l'unità di Palermo su campioni prelevati dagli stessi pazienti inclusi nello studio PAR.
Studio dell'interazione tra flora batterica intestinale ed espressione del recettore attivante la proliferazione dei perossisomi gamma (PPAR-gamma) in relazione alla funzione di barriera intestinale in modelli sperimentali e nell'uomo
Studio in vitro
1)Verificare i livelli di TLR2, TLR4 e PPAR-gamma in monostrati di cellule epiteliali intestinali co-coltivate con vari componenti della flora batterica intestinale, inclusi i prodotti di derivazione della parete batterica (LPS, LTA, peptidoglicano), e probiotici
2)Valutare l'effetto della supplementazione di probiotici sulla funzione di barriera mediante misura delle resistenze transepiteliali, del flusso dell'HRP. L'espressione delle proteine (occludina, ZO e 7H6) sui monostrati di cellule epiteliali sarà valutata mediante immunoistochimica e PCR
3)Attraverso esperimenti di gene reporter, verificare i meccanismi molecolari che portano all'attivazione di PPAR-gamma
4)Identificare i meccanismi molecolari coinvolti nella regolazione dell'espressione/attivazione di PPAR-gamma in risposta a probiotici mediante l'attivazione di TLR2, TLR4, TLR9 o rilascio di citochine
Studio nel modello animale
1)Verificare il ruolo di TLR4 sulla regolazione di PPAR-gamma mucosale utilizzando topi geneticamente deficienti per TLR4 (C3H/HeJ)
2)Studiare l'effetto della supplementazione dietetica con probiotici sui livelli di espressione di PPAR-gamma nella mucosa colica. Verranno condotti studi su topi la cui dieta verrà supplementata con probiotici e/o prebiotici ed i livelli di PPAR-gamma determinati su campioni di mucosa attraverso RT-PCR quantitativa (Real-time) ed immunoistochimica
Studio nell'uomo
In pazienti affetti da IBD e pazienti con colonscopia negativa per patologia organica valutare, mediante PCR, la variazione dei livelli di TLR2, TLR4, PPAR-gamma nella mucosa intestinale, correlandola alla variazione della flora microbica intestinale ed ai livelli di citochine mucosali, dopo supplementazione dietetica con probiotici.
Studio dell'effetto di nutrienti sui meccanismi di riparazione epiteliali
Valutare l'effetto a livello molecolare della supplementazione con fattori di crescita e nutrienti sull'interazione cellula matrice e sulle vie di segnale coinvolte nei processi di restituzione dopo danno.
Verrà studiato l'effetto della supplementazione a concentrazioni e per tempi diversi di fattori di crescita (EGF, TGF-a, KGF), acidi grassi a catena corta e di zinco su
1.espressione e la localizzazione di subunità integriniche
2.fosforilazione della chinasi di adesione focale
3.modulazione dei complessi giunzionali intercellulari
in modelli in vitro mediante tecniche di immunoistochimica, western blotting e PCR.
L'adesione alle diverse componenti della matrice e la migrazione cellulare verranno studiati in vitro mediante test precedentemente utilizzati <<<

Risultati parziali attesi

Poiche i risultati di questo studio sono in funzione dei pazienti arruolati. Solo un numero adeguato di pazienti potrà dare dei risultati valutabili e per ogni unità è previsto un arruolamento che solo dopo 2 anni raggiungerà il numero di pazienti soddisfacente.
la stima attesa dei risultati è quella descritta nella seconda fase.

STUDIO PERMEABILITA'
UNITA' 4 (Padova)
Si ipotizza di dimostrare 1) la relazione tra espressione/stimolazione dei PAR e la funzione di barriera intestinale e che tali eventi siano in relazione all'espressione delle molecole di co-stimolazione; 2) l'attivazione dei PPAR-gamma in maniera indipendente dai TLR4 (studio nei topi KO); 3) l'alterazione della funzione di barriera dopo stimolazione dei PAR e il suo mantenimento/ripristino dopo stimolazione dei PPAR-gamma; 4) la stimolazione delle molecole di adesione dopo applicazione di fattori di crescita e nutrienti agli enterocitiStudio di Palermo sul citomegalovirus

Per quanto riguarda i risultati attesi sulla frequenza del citomegalovirus sono difficilmente calcolabili perchè poche dati vi sono in letteratura concernenti la frequenza del virus in queste diverse popolazione di pazienti.
Ci attendiamo una prevalenza alta (80-90%) nei pazienti immunosoppressi (colite severa in trattamento con alte dosi di steroidi,pazienti sottoposti a trapianto di midollo)uan prevalenza intermedia nei pazienti con pouchite (20-50 5) mentre ci attendiamo una prevalenza bassa nei pazienti con colite moderata,nei controlli e nei pazienti che devono essere sottoposti a trapianto di midollo.
Per quanto riguarda i meccansimi di evasione immunitaria ci attendiamo di trovarli alterati più frequentemente nei pazienti immunosoppressi che nel resto dei pazienti.
Per quanto riguarda la permeabilità ci attendiamo possa essere alterata più frequentemente nei pazienti che vanno incontro all'infezione con citomegalovirus.

Nella Pouchite ci attendiamo che vi siano differenze nella frequenza dei vari polimorfismi tra le 3 popolazioni di pazienti inclusi(pouchite acuta,pouchite cronica e controlli)

Unità di Messina
Parte I (Infliximab e permeabilità intestinale in pazienti con malattia di Crohn)
Se l'ipotesi di partenza è valida si dovrebbe costatare una rapida normalizzazione della permeabilità intestinale dopo la somministrazione dell'Infliximab. Tale normalizzazione dovrebbe andare in parallelo alla riduzione/scomparsa dei livelli circolanti del TNF-alpha. Qualora ritardasse la normalizzazione del parametro permeabilità verrebbe a meno l'importanza del TNF-alpha nell'induzione delle alterazioni.


Parte II (caratterizzazione del meccanismo dell'apertura delle giunzioni strette nell'animale da esperimento)
I risultati della parte sperimentale sul ratto contribuisce a caratterizzare alcuni meccanismi implicati nelle alterazioni di permeabilità indotte dai mediatori di flogosi. L'obiettivo secondario di questa parte del progetto è l'identificazione di possibili approcci terapeutici per la normalizzazione della barriera intestinale, le cui alterazioni sono ritenute un passaggio importante nella patogenesi della malattia di Crohn


Unità di Padova
L'identificazione di meccanismi coinvolti nella regolazione e nel mantenimento della funzione di barriera permetterà di fornire nuove prospettive terapeutiche per il trattamento dei pazienti con MICI. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

In condizioni normali, la mucosa intestinale presenta un quadro di "infiammazione cronica fisiologica" legata alla costante azione di "drive" antigenico della flora microbica che costituisce il contenuto luminale e alla risposta del sistema immunitario della parete intestinale che è, tuttavia, proporzionato allo stimolo. La perdita di tale equilibrio costituisce la base fisiopatologica delle Malattie infiammatorie croniche dell'inetestino. Le teorie eziologiche oggi più accreditate sono la presenza di infezione intestinale persistente, un difetto di permeabilità dell'epitelio mucosale ed un'alterata risposta immunitaria verso antigeni ubiquitari.
Rimane quindi da stabilire se l'infiammazione cronica ricorrente sia il risultato di una adeguata risposta ad uno stimolo anormale persistente o se, invece, rappresenti una risposta prolungata ed abnormemente aggressiva ad uno stimolo normale. In entrambi i casi, comunque, i componenti della microflora intestinale rappresentano un drive antigenico persistente in grado di indurre la flogosi intestinale. Un altro importante fattore è la predisposizione genetica di questi pazienti a sviluppare MICI. Vi sono diverse evidenze scientifiche a favore di un possibile ruolo di fattori genetici nell'insorgenza delle MICI. Sono in corso molti studi che cercano di individuare i geni rilevanti nella patogenesi delle MICI. Un primo gruppo di geni potenzialmente implicati in questo modo è quello codificante le citochine. Le citochine hanno un ruolo chiave nell'iniziare e modulare la risposta immunitaria che nelle MICI sembra essere eccessiva e rivolta contro la microflora endoluminale. Un secondo gruppo di geni studiati è quello codificante i cosiddetti ‘pattern recognition receptors' (PRRs), molecole importanti nel riconoscimento di prodotti microbici. Queste molecole sono espresse da cellule immunitarie e funzionano come recettori in grado di riconoscere frazioni proteiche di microrganismi ben conservate nella scala evolutiva. Ne sono un esempio la famiglia recettoriale Toll-like (TLR) e NOD2/CARD15.

POUCHITE
L'etiologia della pouchite è sconosciuta ma la sovracrescita batterica e lo sbilanciamento nella composizione batterica endoluminale hanno un ruolo chiave. Il possibile ruolo dei batteri nella patogenesi della pouchite è dimostrato dalla risposta ai probiotici. Non è chiaro perche solo alcuni pazienti(30%) sviluppano la pouchite. Un fattore importante potrebbe essere la predisposizione genetica. I Toll like receptors sono importanti nel riconoscere gli antigeni esterni.Il gene NOD2 sembra rilevante nella risposta ai polisaccaridi batterici. Pertanto un pattern genetico potrebbe condizionare la risposta.

CYTOMEGALOVIRUS AND IBD
Il ruolo dei batteri è fortemente supportato da evidenze di laboratorio e cliniche mentre meno chiaro è il ruolo dei virus. i virus più frequentemente implicati como possibili fattori predisponenti sono gli adenovirus,gli herpes virus (Citomegalovirus,Epstein Barr).
In particolare negli ultimi anni particolare attenzione è stata data al Cytomegalovirus. In relazione ai metodi usati per la ricerca del virus diversi tassi di prevalenza sono stati riportati: dal 11%(nelle biopsie rettali con ematossilina eosina)( ) al 92/100%(nelle biopsie con la PCR). Fino ad oggi non è chiaro quale è il ruolo del virus nel decorso clinico della malattia. le ipotesi sono: a)il virus è un normale commensale nell'intestino dei pazienti con IBD per particolari condizioni immunologiche che si determinano e non è determinante nella riattivazione della malattia e non è responsabile delle manifestazioni di malattia. b)il virus è direttamente o indirettamente(attraverso un attivazione immunologica) patogenico e pertanto è responsabile dell'infiammazione acuta. Non vi sono attualmente elementi per propendere per l'una o per l'altra ipotesi.
Il citomegalo è un virus molto diffuso nelle popolazione generale. E' stato valutato che nel 80 % della popolazione generale vi è stato un contatto con il virus (come dimostrato dagli anticorpi IGG).Tuttavia nelle biopsie intestinali di pazienti senza patologia infiammatoria il virus non è identificato mentre è presente nelle biopsie intestinali di pazienti con infiammazione cronica. Il motivo per cui il virus è presente ove è l'infiammazione non è chiaro. L'immunodepressione potrebbe essere un fattore predisponente.
Conoscere la prevalenza del virus (adoperando il metodo più sensibile di diagnosi cioè la PCR) nei pazienti con infiammazione (
Malattie infiammatorie croniche dell'intestino MICI) ma non immunosoppressi,nei pazienti con MICI immunosoppressi,nei pazienti senza infiammazione (pazienti con malattia ematologica che devono essere sottoposti a trapianto di midollo)e negli stessi pazienti che sviluppano una GVH potrebbe dare un indicazione del rapporto tra il virus,l'infiammazione e l'immunosoppressione.
La pouchite è un modello particolare di infiammazione cronica dell'intestino in cui sembrano giocare un ruolo la flora batterica.
Non vi sono dati sulla possibile sovrapposizione del citomegalo in questa condizione. Lo studio pertanto di prevalenza del virus in questa particolare condizione infiammatoria potrebbe aggiungere ul ulteriore informazione sul rapporti tra il virus ed il tipo di infiammazione.Il citomegalovirus ha dei meccansimi di evasione immunitaria tra i quali la risposta dell'interferone alfa attraverso l'alterazione dei pathways di trasduzione del segnale. E' stato segnalato che la permeabilità intestinale aumenta la probabilità di infezione del citomegalovirus . Pertanto lo studio della permeabilità intestinale potrebbe aggiungere ulteriori informazioni ai fattori predisponenti alla infezione con il citomegalovirus. *

PERMEABILITA'
La permeabilità intestinale è aumentata nei pazienti con malattia infiammatoria cronica intestinale.
Il mantenimento o il ripristino della funzione di barriera dell'epitelio sono fondamentali per l'omeostasi immunologica della mucosa intestinale. L'epitelio intestinale è la struttura principe deputata a regolare il passaggio degli antigeni ed altre sostanze potenzialmente patogene contenute nel lume intestinale. Questa funzione, però, non è di pura barriera fisica: l'induzione della tolleranza antigenica ed il mantenimento della sua omeostasi, infatti, indicano come ci sia una continua e regolare stimolazione del sistema immune. L'epitelio intestinale è, quindi, fisiologicamente permeabile. Le sostanze endoluminali possono penetrare l'epitelio tramite la via paracellulare, costituita dagli spazi intercellulari, il cui accesso è modulato dalle giunzioni serrate, e quella transcellulare, attraverso la quale molecole vengono inglobate nelle cellule per mezzo di endosomi.
I recettori proteasi-attivabili (PAR) sono una famiglia di recettori associati alla proteina G attivati da proteasi quali trombina, tripsina e triptasi. La presenza dei PAR sull'epitelio intestinale ed il fatto che le cellule epiteliali intestinali siano in contatto con numerose proteasi ha fatto ipotizzare che l'attivazione di tali recettori fosse coinvolta nel mantenimento della omeostasi della mucosa intestinale e, quindi, anche della funzione di barriera epiteliale. In effetti, è stato dimostrato che l'attivazione dei PAR provoca l'alterazione della permeabilità in colture di linee cellulari di epitelio intestinale umano ed in modello animale. Inoltre la tripsina, uno dei più importanti enzimi digestivi, attivando il PAR2 su cellule epiteliali intestinali stimola la produzione di inositoltrifosfato, acido arachidonico e prostaglandine E e F, sostanze in grado di modulare le funzioni della mucosa. Inoltre, in vitro l'azione degli antagonisti dei PAR viene potenziata da molecole pro-infiammatorie e prodotti batterici. Tuttavia, nell'uomo il ruolo effettivo dei PAR della mucosa intestinale ed i fattori che possono aumentarne l'espressione od interferire con la loro attivazione non sono ben caratterizzati.
Il lume intestinale è la sede del nostro organismo con il più alto contenuto antigenico.
La molecola di superficie CD40 ed il suo ligando (CD40L) sono due costimolatori espressi rispettivamente dalle cellule presentanti l'antigene (APC) e dai linfociti T e svolgono un ruolo determinante nella regolazione dell'attività immunologica. Il legame tra queste due molecole è necessario, all'atto della presentazione dell'antigene al linfocita T, per l'attivazione della cascata immune. In assenza di una od entrambe tali molecole si verifica uno stato di tolleranza nei confronti dell'antigene. Quando l'APC è il linfocita B, dopo l'interazione tra il CD40 ed il suo ligando, si verifica un'attivazione anche di questa cellula, che aumenta l'espressione di un altro costimolatore di superficie, il B7 e di numerose interleuchine (IL-1b, IL6, IL10, TNFa, GM-CSF). Nel tessuto intestinale normale, il CD40 ed il CD40L vengono espressi, oltre che nei follicoli linfatici, anche, in quantità modesta, dai linfociti della lamina propria, probabilmente in risposta a stimoli di origine luminale. Nelle IBD, anche durante la remissione della malattia, le cellule CD40+ e CD40L+ sono aumentate sia nello strato sub-epiteliale che più in profondità. Tale evento e l'aumentata espressione di anticorpi dirette verso batteri commensali indicano la perdita dello stato di tolleranza verso gli antigeni endoluminali. Se tale evento sia in relazione con la perdita della funzione della barriera epiteliale o se invece si tratti di un'alterazione primaria dell'omeostasi immunologica, non è noto.
L'interazione tra l'epitelio intestinale ed il contenuto luminale è continua e dinamica. I componenti della microflora intestinale (batteri residenti e loro prodotti) possono direttamente (es. secrezione di tossine, produzione di metaboliti trofici per gli enterociti, etc) o indirettamente (rilascio di fattori stimolanti le cellule immuni della mucosa, etc) influenzare la permeabilità intestinale. I toll like receptor (TLR) costituiscono una famiglia di proteine transmembrana coinvolte nell'induzione dell'immunità innata. In particolare il TLR4 e' il recettore di segnale per l'LPS, componente della parete dei batteri Gram negativi. L'interazione dei TLR con il loro ligando induce l'attivazione del fattore di trascrizione nucleare NFkB con conseguente produzione di citochine pro-infiammatorie quali IL-1, IL-6 e TNF-alfa. A seguito dell'attivazione di TLR4 si osserva anche un'aumentata espressione ed attività del recettore attivante la proliferazione dei perossisomi gamma (PPAR-gamma). Studi in vitro hanno dimostrato che l'attivazione di PPAR-gamma è anch'essa coinvolta nella regolazione di processi infiammatori. Ligandi naturali e farmacologici di PPAR-gamma riducono l'infiammazione influenzando la produzione di citochine e chemochine da parte delle cellule mieloidi ed epiteliali. Il PPAR-gamma è espresso soprattutto nel tessuto adiposo ma più recentemente la sua espressione è stata rilevata anche nell'epitelio colico dove, tuttavia, non è chiaro il ruolo svolto. Di recente è stato osservata una diminuita espressione di PPAR-gamma nell'intestino di pazienti affetti da IBD. Inoltre, il butirrato, prodotto del metabolismo batterico, aumenta l'espressione e stimola l'attività di PPAR-gamma, con miglioramento della permeabilità epiteliale. E' possibile, quindi, che la manipolazione della flora batterica in corso di infiammazione possa influenzare la funzione di barriera intestinale agendo direttamente od indirettamente sul PPAR-gamma.
L'epitelio della mucosa intestinale è costituito da uno strato di cellule ad alto turnover capace di rispondere prontamente ad una vasta gamma di noxae. La perdita di continuità e di funzione di barriera comportano un'alterazione della capacità secretiva ed assorbitiva della mucosa intestinale rendendo l'epitelio più sensibile ai microrganismi residenti e/o patogeni ed ai loro prodotti. In condizioni normali, le lesioni di continuità più superficiali sono rapidamente riparate dal processo di restituzione, con migrazione di cellule dall'area perilesionale. Se la lesione è profonda, a questo processo può seguire una fase di proliferazione e di differenziazione, che consente di ricostituire l'architettura e la struttura della mucosa danneggiata. La restituzione cellulare è regolata da una varietà di citochine e da fattori di crescita (IL-4, IL-15, EGF, TGF-a, KGF) prodotti dalle cellule epiteliali e dalle altre cellule della mucosa ed è dipendente dall'adesione alla matrice extracellulare. Il rapporto tra cellule e matrice è modulato dalle integrine, strutture complesse materialmente connesse con alcune proteine del citoscheletro (a-actinina, talina e vinculina), capaci di modulare processi quali la proliferazione, la migrazione e l'apoptosi cellulari. In corso di infiammazione, la funzione di barriera epiteliale è alterata e si verifica uno squilibrio della produzione locale dei fattori che modulano la risposta infiammatoria. Tali eventi possono contribuire al perpetuarsi del danno mucoso, impedendo il ripristino funzionale ed anatomico dell'epitelio intestinale. L'applicazione di fattori di crescita, di molecole non proteiche e di oligoelementi attivi sull'epitelio potrebbe costituire un approccio alternativo per il controllo dell'infiammazione intestinale.Tornando al concetto dell'alterazione primitiva della barriera intestinale si offrono diverse ipotesi. Una prima parte dal presupposto di un'alterazione anatomica delle strutture giunzionali intercellulari. Sono state descritte in pazienti con MC alterazioni degli strands delle zonulae occludentes (ZO) in porzioni intestinali esenti da malattia infiammatoria . A livello molecolare questi strands sono costituiti da proteine transmembrana, occludina e la famiglia delle claudine. Più in profondità nel complesso giunzionale è collocata la N-caderina la cui assenza induce nell'animale da esperimento un quadro di infiammazione intestinale molto simile alla MC . Questi pochi dati comunque indicano che l'associazione tra alterazione anatomica delle giunzioni e malattia infiammatoria cronica dell'intestino è ipotizzabile. Accanto a questo difetto strutturale dei complessi giunzionali va tenuta presente l'ipotesi di un'iperreattività di queste strutture. Dati confermati hanno dimostrato che i mediatori della flogosi sono in grado di indurre l'apertura delle ZO. Recentemente, in pazienti con MC, sono state identificate alcune mutazioni a carico del NOD2/CARD15 , gene implicato nel contesto dell'immunità innata, e del gene del tumor necrosis factor-alpha e del suo recettore . Fino ad ora comunque mancano dati che colleghino queste alterazioni a difetti di barriera.
Recentemente è stata segnalata la normalizzazione del parametro permeabilità in pazienti con MC sottoposti a trattamento con Infliximab, un anticorpo chimerico umano/murino anti-TNF . Gli autori imputano l'effetto alla sola inibizione del TNF-alpha, però va tenuto presente che un trattamento con prednisone risulta anch'esso in grado di normalizzare la permeabilità intestinale verosimilmente tramite l'inibizione del fattore nucleare kappaB (NF kappaB) . Il meccanismo che coinvolge l'attivazione del NF-kappaB è stato indagato recentemente in vitro in cellule epiteliali incubati con TNF-alpha . Quest'ultimi autori hanno dimostrato che l'inibizione del NF kappaB preveniva le alterazioni (immunohistochimiche ed espressione proteica) della ZO-1, proteina giunzionale intracitoplasmatica. Nel modello sperimentale da endotossinemia invece un altro gruppo è potuto dimostrare che alterazioni giunzionali erano prevenibili con l'inibizione della nitric oxide sintetasi inducibile (iNOS) . Da questi dati emerge che, sebbene importante nella cascata degli eventi che comportano l'apertura delle giunzioni serrate, il TNF-alpha non è il fattore determinante. Appare piuttosto che altri fattori, quali il NF kappaB o l'iNOS, giocano un ruolo altrettanto importante a valle. <<<