RICERCA ITALIANA     

Geni di resistenza nei microrganismi patogeni Gram-positivi e Gram-negativi: caratterizzazione molecolare, funzionale e loro trasferimento orizzontale.

Università degli Studi di Catania

Abstract

La nostra proposta di studio ha l'obiettivo principale di sviluppare le conoscenze dei meccanismi molecolari delle resistenze e della loro diffusione. Questo approccio è in parte alternativo a quello generalmente finanziato dalle industrie farmaceutiche, dove viene valutata esclusivamente la presenza di geni della resistenza ed eventualmente la loro epidemiologia. In questo studio verranno utilizzati approcci tecnologici molecolari e di genetica funzionale, inoltre verranno utilizzati strumenti piu' raffinati come la real Time PCR ed il sequenziamento per MLST. Il problema dell'antibiotico-resistenza, pur partendo da solide basi epidemiologiche, verrà studiato sia dal punto di vista dei geni, degli elementi mobili assieme agli aspetti di genetica di popolazione (la parte relativa alla diffusione;), sia alla caratterizzazione dei markers di resistenza (la parte relativa allo studio antimicrobico) in senso stretto. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Giuseppe NICOLETTI Universita' degli Studi di CATANIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Questa proposta ha l'obiettivo di studiare: i) la caratterizzazione di geni della resistenza a livello molecolare e funzionale; ii) gli elementi genetici che veicolano questi geni; iii) la caratterizzazione della struttura di popolazioni dei patogeni resistenti. Mentre sono ben conosciuti molti meccanismi molecolari di resistenza, i meccanismi mediante i quali questi microrganismi diffondono sono molto meno conosciuti. Un approccio comprensivo a livello molecolare degli aspetti responsabili della mobilità degli elementi genetici che veicolano determinanti di resistenza, al di là degli aspetti epidemiologici, potrà provvedere un significativo avanzamento nel combattere i patogeni resistenti agli antibiotici, chiarendo la dinamica e i patterns di distribuzione dei vari elementi mobili. Studiare l'epidemiologia dei microrganismi resistenti nonché degli elementi mobili invece che soltanto dei geni, permetterà la scoperta di nuovi determinanti di resistenza.

Obiettivi specifici del progetto:
Epidemiologia:
1) Screening di patogeni resistenti rilevanti dal punto di vista clinico e provenienti da diverse aree geografiche italiane; screening della localizzazione dei determinanti di resistenza .
2) Caratterizzazione dei geni e degli elementi genetici nei vari patogeni;
3) Identificazione dei ceppi a livello di specie e subspecie, mediante tests biochimici e molecolari
Analisi dei geni e degli elementi genetici:
4) Caratterizzazione delle i) resistenze a livello molecolare e funzionale; ii) degli elementi genetici; iii) dei siti target di integrazione; iv) degli intermedi di mobilità; v) della loro evoluzione
Analisi della genetica di popolazione:
5) Tra i microrganismi è possibile definire due vie principali pe rla diffusione delle resistenze: il primo è che quando la resistenza si sviluppa in un clone, questo clone diventa predominante in tutti gli ambienti e la sua alta prevalenza è dovuta alla sua diffusione clonale. Il secondo è interamente dovuto al trasferimento orizzontale di geni veicolati da elementi mobili. Il diverso grado di mobilità è alla base del dinamismo delle resistenze e, spesso, delle differenze geografiche che si possono riscontrare.

Oltre a quanto detto, la complementarietà scientifica dei partecipanti al progetto è avvalorata dalle diverse ma sinergiche esperienze che ogni gruppo di ricerca possiede, che permetterà di affrontare lo studio dal punti di vista avanzati sia tecnicamente che scientificamente.
I prodotti dello studio includono: i) nuove informazioni sulla diffusione dei geni della resistenza, degli elementi genetici, e dei meccanismi di trasferimento; ii) nuove tecniche per studi di epidemiologia molecolare; iii) nuove informazioni sui meccanismi di resistenza a livello molecolare e funzionale; iv) schemi teorici per la previsione della diffusione di determinanti di resistenza a specifici antibiotici. <<<

Risultati parziali attesi

Nella prima parte del progetto, verrà definito il problema clinico ed epidemiologico delle resistenze. Gli isolati resistenti verranno caratterizzati a livello biochimico e molecolare. I background genetici ottenuti potranno consentire le prime analisi di genetica di popolazione.
Verranno valutate le frequenze di trasferimento orizzontale di alcuni determinanti di resistenza in studio.Risultati e a spetti innovativi del progetto
Diversi aspetti della proposta possono mostrare tutto il loro potenziale di innovatività.
1) Studi di genetica di popolazione mettono in evidenza la diffusione della resistenza mediata da “cloni” o da “geni”;
2) Studio sugli elementi genetici e non soltanto sui geni che è certamente un metodo innovativo di studio delle resistenze.
3) Caratterizzazione dei determinanti di resistenza a livello molecolare e funzionale. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La resistenza agli antibiotici rimane uno dei problemi clinici e di salute pubblica maggiori, nonostante la disponibilità di sempre nuovi potenti antibiotici. Di contro, i microrganismi, sottoposti alla loro pressione selettiva per più di 60 anni, hanno risposto con la diffusione di una progenie microbica non più sensibile alla loro azione. Diverse classi di antibiotici sono diventate, con l’andare del tempo, sempre meno efficaci proprio in relazione all’incremento di antibiotico-resistenza. Tra le resistenze emergenti più importanti e più preoccupanti, sono da annoverare quelle relative alla meticillino-resistenza negli stafilococchi, alla penicillina e ai macrolidi negli streptococchi, ai glicopeptidi negli enterococchi (e eventualmente la tanto temuta acquisizione di questa resistenza da parte degli stafilococchi) nonché a numerose altre classi di antibiotici quali aminoglucosidi, fluorochinoloni, cefalosporine di terza generazione e carbapenemici nelle Enterobacteriaceae, in Pseudomonas aeruginosa e in altri Gram-negativi quali Haemophilus influenzae.
Oltre ai questi microrganismi, sono stati identificati nuovi patogeni opportunisti che posseggono patterns di resistenza multipli, quasi a dimostrare che l’acquisizione di determinanti di resistenza non sia altro che una sorta di “scalata” dallo stato di “non patogeno” a quello di “patogeno”. Questa osservazione diventa fortemente evidente nei pazienti immunocompromessi o cronicamente debilitati, pazienti questi che stanno aumentando numericamente di giorno in giorno.

La prevenzione della resistenza agli antibiotici è uno dei gol più importanti in ogni tipo di infezione ed è obiettivo primario in tutte le azioni riguardanti le indicazioni sulla salvaguardia della salute. Nelle comunicazioni ufficiali provenienti dalle Commissioni del Parlamento Europeo, dai Comitati etici e dai Comitati regionali intitolati “Biotecnologie delle Scienze della Vita- Una strategia per l’Europa” (COM 2002), ci sono specifiche richieste per nuove soluzioni nel campo della resistenza agli antimicrobici. In uno dei paragrafi è espressamente detto che la resistenza ai trattamenti antibiotici sta diventando un problema globale di salute pubblica.

Mentre è assolutamente chiaro che gli antibiotici sono il cardine della selezione di resistenza batterica, il meccanismo di diffusione di geni della resistenza o di microrganismi resistenti può dar luogo a risultati epidemiologicamente molto diversi tra loro. Il DNA mobile può dare una enorme contributo alla diffusione di resistenza, quest’ultimo, fungendo da “raccoglitore” di diversi geni nei batteri patogeni può facilitare lo scambio orizzontale fra popolazioni microbiche anche diverse tra loro. Benché l’acquisizione di nuovi geni della resistenza sia un fattore molto importante nell’aumento della incidenza di microrganismi resistenti, la natura degli elementi genetici che veicolano e trasferiscono questi determinanti è stata chiarita soltanto in pochissimi casi, e poco è conosciuto riguardo la loro epidemiologia molecolare. Inoltre una caratteristica critica ma spesso sottostimata di questi elementi mobili è che, una volta integrati nell’ospite esso sono mantenuti stabilmente anche senza pressione selettiva antibiotica, dimostrando che la resistenza può anche essere molto difficile da eliminare. Questo aspetto della stabilità dei determinanti di resistenza può spigare, almeno in parte, la diffusione delle resistenze anche in ambito comunitario.
Chiarendo la dinamica e i patterns di diffusione dei vari elementi mobili, al di là della epidemiologia delle resistenze, si potranno osservare notevoli miglioramenti nel combattere le resistenze. Inoltre queste conoscenze potranno essere utilizzate per la identificazione di nuovi target per la terapia antimicrobica.
L’importanza di dati epidemiologici

In questo contesto, è di primaria importanza il possedimento di dati epidemiologici per identificare eventuali emergenze di determinanti di resistenza ed adattare l’uso locale degli antibiotici per limitare il più possibile i fallimenti terapeutici. L’accumulo di dati riguardanti la natura e la potenziale mobilità, così come la conoscenza delle percentuali di resistenza totale, sarà di grande utilità per preservare il più possibile gli agenti antimicrobici esistenti. Il tentativo di effettuare studi di epidemiologia molecolare delle resistenze includendo la mobilità degli elementi che veicolano geni della resistenza, può essere di cruciale importanza nell’identificazione di nuovi determinanti di resistenza.

L’importanza di caratterizzare le beta-lattamasi a spettro esteso di classe A e B e le classi C, a livello molecolare e funzionale.
Tra i batteri Gram-negativi, l’emergenza di resistenza mediata da beta-lattamasi è di importanza primaria. Ad oggi, sono state studiate e caratterizzate circa 250 beta-lattamasi, le quali sono state raggruppate in quattro distinti gruppi (A, B, C, D) in base alla classificazione funzionale di Ambler. I membri di ogni classe sono distinti per il meccanismo catalitico. Le beta-lattamasi a spettro esteso sono state identificate all’interno delle classi A e D (enzimi a sito catalitico a serina) e all’interno della classe B ( enzimi zinco-dipendenti). Gli enzimi della classe A sono certamente quelli più rappresentati all’interno del mondo microbico perché trasferibili orizzontalmente. Gli enzimi della classe B, benché inizialmente considerati una mera curiosità scientifica, sono oggi frequentemente isolati da diversi patogeni, spesso associati ad altre classi di beta-lattamasi. Questi enzimi sono in grado di idrolizzare un numero ampio di molecole, includendo i carbapenemici, quest’ultimo aspetto di notevole gravità. Negli anni più recenti, altri enzimi si stanno diffondendo tra i patogeni, diventando un problema clinico sempre più importante. Accanto agli enzimi sopra descritti, nuovi aspetti sono stati messi in evidenza anche nel caso dei microrganismi Amp-C produttori. Oltre a ceppi con localizzazione cromosomica del determinante, sono stati isolati ceppi con localizzazione plasmidica di questo gene, facendo intuire un repentino cambiamento della diffusione epidemiologia di questa resistenza in un prossimo futuro.

L’importanza dei trasposoni coniugativi nella diffusione della resistenza

L’incremento di resistenza ai macrolidi in anni recenti, soprattutto in microrganismi quali S.pneumoniae e S.pyogenes è stato un avvento di grande rilevanza clinica. In queste due specie è stato isolato e caratterizzato un nuovo meccanismo di resistenza ad efflusso e di questo gene, definito come appartenente alla classe mef(A), si è dimostrata la localizzazione su un elemento mobile di dimensioni di circa 50kb. Dal momento della comparsa di questo nuovo determinante di resistenza (1996) ad oggi, circa il 35% dei ceppi di S.pyogenes ed il 46% dei ceppi di S.pneumoniae posseggono questo gene, dimostrando come la trasmissione orizzontale sia un potente mezzo di trasmissione. Un gruppo di ricerca partecipante a questo studio ha dato un forte contributo alla conoscenza di questo elemento genetico e ulteriori studi saranno in grado di vedere l’evoluzione di queste unità genetiche, che tendono ad albergare altri determinanti quali quelli della resistenza alla tetraciclina, cloramfenicolo, eritromicina, aminoglucosidi e glicopeptidi.

L’importanza della clonalità e della trasmissione orizzontale nella diffusione di ceppi resistenti

La disponibilità di informazioni di genomica microbica e la generazione di grandi quantità di dati sulla genetica di popolazioni microbiche ha permesso, in anni recenti, la quantificazione dell’importanza del trasferimento orizzontale di geni sulla variabilità microbica. E’ sempre più chiaro che il trasferimento orizzontale è pervasivo attraverso diverse lineages microbici e può avvenire anche tra microrganismi filogeneticamente molto distanti: in qualche modo tutti i microrganismi sembrano essere delle “chimere”. Questi geni spesso importati come “isole di patogenicità” possono conferire alle cellule nuove capacità metaboliche, includendo l’acquisizione di resistenza o di virulenza. Il contributo della ricombinazione, così come le mutazioni, nel generare nuovi genotipi, varia tra differenti popolazioni e quando aumenta, fa diminuire conseguentemente la clonalità. In conseguenza a quanto detto, esistono spettri di popolazioni, dalle specie definite strettamente clonali a quelle definite non clonali o panmittiche. <<<