RICERCA ITALIANA     

INDAGINI SULLA PATOGENESI DELLE ALTERAZIONI CONNETTIVALI NELLO PSEUDOXANTHOMA ELASTICUM (PXE)

Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia

Abstract

Mutazioni nel gene ABCC6, che codifica per il trasportatore di membrana MRP6, causano la malattia genetica Pseudoxanthoma elasticum (PXE) (Le Saux et al., 2000). Il ruolo fisiologico di MRP6 è ancora sconosciuto, tuttavia la sua deficienza funzionale induce molte alterazioni metaboliche e comportamentali dei fibroblasti dermici in coltura suggerendo che il metabolismo dei fibroblasti è pesantemente coinvolto nella deficienza genetica di MRP6 (Passi et al., 1996; Quaglino et al., 2000; Boraldi et al., 2003c). Infatti, le manifestazioni cliniche del PXE coinvolgono i tessuti connettivi lassi (Neldner and Struk, 2002) di tutti gli organi (Gheduzzi et al., 2003). La deficienza di MRP6 induce mineralizzazione e frammentazione delle fibre elastiche, formazione di abnormi fibrille collagene e deposizione di aggregati di costituenti della matrice negli spazi extracellulari (Pasquali Ronchetti et al., 1981; 1986). I danni maggiori sono a carico di retina, vasi e cute. Tali alterazioni suggeriscono che l'ambiente extracellulare è profondamente modificato nel PXE. E' pertanto ragionevole ipotizzare che le manifestazioni cliniche siano il risultato di un metabolismo sbagliato dei fibroblasti per quanto riguarda la sintesi, secrezione e, probabilmente, la degradazione di costituenti della matrice. Il progetto si prefigge l'analisi della espressione genica, della produzione e della degradazione dei principali costituenti della matrice extracellulare da parte di fibroblasti PXE in coltura. Particolare attenzione sarà posta a proteine, glicoproteine e proteoglicani data la loro importanza nella formazione della matrice stessa e nella sua omeostasi. Lo scopo è di comprendere meglio le basi molecolari responsabili i) della precipitazione di sali minerali nella fibra elastica; ii) dell'abnorme accumulo di costituenti della matrice extracellulare; iii) delle alterazioni della fibrillogenesi collagene. La espressione delle proteine della matrice verrà saggiata tramite microarrays a cDNA e RT-PCR(unità 2); le proteine e le glicoproteine dei fibroblasti in vitro saranno isolate e successivamente identificate mediante 2-D gel elettroforesi ed analisi tramite banche dati e tramite spettrometria MALDI TOF e massa/massa, secondo procedure già messe a punto (Boraldi et al., 2003a; 2003b) (unità 2); ciò permetterà di ottenere il profilo proteomico dei fibroblasti PXE. I proteoglicani e i glicosaminoglicani verranno quantificati ed identificati mediante metodologie chimiche, cromatografiche ed elettroforetiche (unità 3) e saranno confrontati con quelli presenti nel plasma dei pazienti mediante HPLC ed elettroforesi capillare, tramite metodologia già a punto (unità 3). I prodotti di degradazione della matrice saranno valutati tramite gel elettroforesi capillare (unità 1) e saggi di attività proteasiche utilizzando specifici substrati e peptidi sintetici, con metodiche già disponibili (unità 1).
Boraldi et al., Electrophor., 24:1292-1310, 2003a; Boraldi et al., Proteomics 3:917-929, 2003b; Boraldi et al. Matrix Biol.. 22:491-500,2003c;Gheduzzi et al., Ultrastr. Pathol., 27:1-11, 2003 ; Le Saux et al., Nature Genetics 25: 223-227, 2000; Neldner and Struk Pseudoxanthoma elasticum. In: Connective Tissue and Its Heritable Disorders. Molecular, Genetic and Medical Aspects. Royce PM, Steinmann B, Eds., Wiley-Liss & Sons, 561-583, 2002; Pasquali Ronchetti et al., Dermatologica 163:307-326, 1981; Pasquali Ronchetti et al., Arch. Dermatol. Res., 278: 386-392, 1986; Passi et al., Cell Biochem Funct., 14:111-120, 1996; Quaglino et al., Biochim. Biophys. Acta 1501:51-62, 2000 <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Ivonne RONCHETTI Università degli Studi di MODENA e REGGIO EMILIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

L’obiettivo del programma è quello di chiarire la patogenesi delle alterazioni della matrice connettivale nello pseudoxanthoma elasticum (PXE). Il PXE è una malattia genetica causata da mutazioni nel gene ABCC6, il quale codifica per il trasportatore di membrana MRP6. Tale trasportatore appartiene alla famiglia delle Multidrug Resistance Proteins (MRPs), un gruppo di trasportatori di membrana implicati nella extrusione attiva dalle cellule di metaboliti o di specifici prodotti cellulari dopo essere stati glucuronati o glutationati (Borst et al., 1999). Sono ancora sconosciute le molecole fisiologicamente trasportate da MRP6 (Ilias et al., 2002). Inoltre, è impossibile al momento delineare una relazione fra deficiente attività di tale trasportatore e le alterazioni della matrice connettivale, ed in particolare della fibra elastica, caratteristiche del PXE. Infatti, il PXE è una patologia del tessuto connettivo lasso di ogni organo (Gheduzzi et al., 2003) e colpisce prevalentemente la cute ed il sistema cardiocircolatorio (Neldner and Struk, 2002). Bisogna pertanto ammettere che le alterazioni connettivali nel PXE siano la conseguenza indiretta di alterazioni metaboliche cellulari causate a loro volta dalla deficienza funzionale del trasportatore MRP6. Tali alterazioni metaboliche sembrano causare profonde modificazioni per quanto concerne la deposizione della matrice extracellulare. Osservazioni sporadiche di vari gruppi di ricerca, compreso il nostro, hanno mostrato alterazioni nel comportamento sintetico e degradativo dei fibroblasti dermici isolati da soggetti con PXE. I fibroblasti PXE hanno mostrato avere minori interazioni con la matrice e una capacità moltiplicativa più efficiente rispetto ai controlli (Quaglino et al., 2000). Sempre su fibroblasti dermici in vitro è stato documentato come le cellule da PXE producano enzimi proteolitici per la matrice (Gordon et al., 1978; 1985) e proteoglicani di alto peso molecolare e con caratteristiche chimico-fisiche diverse dalla norma (Passi et al., 2001; Tiozzo et al., 1986). Tutto questo induce a pensare che la perturbazione nel metabolismo dei fibroblasti indotta da mutazioni del gene ABCC6 sia molto complessa e che solo uno studio integrato sulla sintesi e degradazione delle varie molecole della matrice possa portare a dati utili per la comprensione della sequenza di eventi che portano alle alterazioni strutturali e cliniche dei tessuti connettivi.
Tale studio ora è possibile. Innanzi tutto, il coordinatore del progetto ha raccolto negli ultimi 6 anni fibroblasti di soggetti affetti da PXE da più di 60 famiglie (DNA da più di 100 famiglie), ed ha proceduto alla identificazione del difetto genico nella maggior parte di essi. Ciò permette di potere selezionare ed utilizzare cloni cellulari con le stesse mutazioni o con mutazioni ben definite; inoltre, permetterà, una volta individuati parametri biochimici di riferimento, di effettuare correlazioni molecolari fra genotipo e fenotipo.
In secondo luogo, gli avanzamenti tecnologici degli ultimi anni danno la possibilità di indagare ad ampio spettro, in modo molto accurato ed in contemporanea, la espressione genica, la sintesi ed escrezione e la eventuale degradazione di una serie di molecole sia cellulari che della matrice. Tale approccio integrato è fondamentale per la comprensione delle anomalie metaboliche nel PXE. In particolare, le tre unità che fanno parte del progetto hanno le competenze scientifiche e metodologiche per potere affrontare tale studio per quanto riguarda la componente proteica (unità 2), la componente proteoglicanica e glicosaminoglicanica (unità 3) e per uno studio sia delle attività enzimatiche in vivo ed in vitro sia dei prodotti della degradazione nei mezzi di coltura e nei liquidi biologici (unità 1). Per quanto riguarda le proteine, le attuali tecniche della proteomica con relative mappe di riferimento, spettrometria di massa, associate a western blotting, permetteranno di verificare eventuali differenze qualitative e quantitative oltre che modificazioni posttraduzionali fra fibroblasti di controllo e PXE, sfruttando le conoscenze già acquisite dalla unità stessa sui fibroblasti umani normali in coltura (Boraldi et al., Electrophoresis, 2003a; Boraldi et al., Proteomics, 2003b). Inoltre, eventuali proteine che per ragioni tecniche non potessero essere indagate con le metodiche della proteomica verranno saggiate a livello di mRNA utilizzando metodiche di microarrays a cDNA in grado di riconoscere un gran numero delle molecole di interesse, come il DermArray (Integriderm) e il Cardiovascular Array (Clontech), seguite da RT-PCR. Il progetto prevede anche lo studio e la caratterizzazione dei proteoglicani e dei glicosaminoglicani presenti nel derma e nei fluidi biologici dei pazienti e prodotti dai fibroblasti in vitro allo scopo di verificare la possibilità che tali molecole anormali, una volta secrete, siano in grado di modificare la organizzazione della matrice ed abbiano, in particolare, la capacità di legarsi alle molecole di elastina e di favorire la precipitazione minerale. Infine, non è da escludere che le alterazioni nella organizzazione e stabilità della matrice extracellulare nel PXE siano da imputare ad una sua facile degradazione (o alla degradazione di una delle componenti) per effetto di una eccessiva produzione di enzimi o carente qualità e/o quantità di inibitori enzimatici specifici. La unità che indagherà questo aspetto ha esperienza nel settore ed ha recentemente messo a punto metodiche per dosaggi anche di minime quantità di prodotti di degradazione della elastina in liquidi biologici e di coltura (Iadarola et al., J.Liquid Chromat.Rel.Technol.,25:1919-45,2002). L'obiettivo finale è quello di capire come eventuali anomalie nella sintesi e degradazione delle molecole della matrice possano essere correlate con una carente funzione del trasportatore MRP6. E' noto che la sintesi/degradazione proteica e proteoglicanica sono stimolate o depresse da una serie di fattori e di condizioni metaboliche cellulari. Il/i substrato/ i fisiologico/i di MRP6 potrebbero essere fra questi. Infine, è ragionevole pensare che una deficiente funzione di MRP6 comporti l'accumulo intracellulare di prodotti del metabolismo la cui produzione potrebbe essere modificata dall’esterno alleviando o rallentando nel tempo la comparsa delle alterazioni metaboliche per quanto riguarda le molecole della matrice e, quindi, le manifestazioni cliniche. <<<

Risultati parziali attesi

Le metodiche da utilizzare così come la strumentazione necessaria per i saggi proposti sono tutte a disposizione dei singoli gruppi di ricerca. Ciò potrà permettere di ottenere risultati abbastanza rapidamente.
I risultati che ci si augura di potere ottenere nella prima fase possono essere così riassunti:
- individuazione nel derma, nel plasma e/o nelle urine dei pazienti di prodotti di sintesi e/o di degradazione del metabolismo connettivale tali da indirizzare allo studio delle tappe patogenetiche di tali alterazioni. L’attenzione è posta sui proteoglicani, sui glicosaminoglicani e sui loro derivati, come pure sui prodotti della degradazione della elastina. Verrà anche valutata la possibilità di utilizzare tali parametri a scopo diagnostico e/o prognostico.
- avviare la individuazione su fibroblasti in vitro di anomalie sintetiche e degradative che possano dare ragione delle alterazioni osservate in vivo.
- misurare la quantità delle proteine prodotte o legate allo strato cellulare da parte di fibroblasti PXE in vitro in confronto a fibroblasti normali.
- valutazione del metabolismo del collagene, una delle componenti della matrice che subisce modificazioni nel PXE, mediante incorporazione di prolina marcata ed esperimenti di pulse and chase sui fibroblasti PXE e sui controlli
- individuazione di proteine anomale sia per quantità che per qualità prodotte da fibroblasti PXE identificate mediante gel elettroforesi bidimensionale e confronto con banche dati e mediante spettrometria di massa.I risultati attesi sono i seguenti:
- Il confronto fra i costituenti della matrice trovati nei liquidi biologici (prima fase) con quelli prodotti dai fibroblasti in vitro può delineare il ruolo dei fibroblasti come tali nella patogenesi delle manifestazioni cliniche del PXE. Ciò è importante per chiarire se le manifestazioni cliniche siano da imputare alla influenza della deficienza del trasportatore di membrana MRP6 sul metabolismo dei fibroblasti o di altri tipi cellulari diversi da questi. E’ stato recentemente suggerito che siano i fibroblasti i reali responsabili delle manifestazioni cliniche nel PXE (Boraldi et al., 2003c).
- Conferma della validità dei parametri umorali come elementi caratteristici del PXE (in quanto trovati anche nelle cellule in coltura) e loro possibile utilizzo nella diagnosi di PXE, e, più ancora, nel monitoraggio della progressione della malattia. Verrà tentata, infatti, anche una correlazione fra deviazione dalla norma di determinati parametri e gravità clinica del PXE in quel particolare paziente.
- Individuazione dei prodotti dei fibroblasti e/o della loro degradazione, per quanto concerne le componenti della matrice extracellulare, che potrebbero essere implicati nella patogenesi delle alterazioni connettivali nel PXE ed in particolare della mineralizzazione delle fibre elastiche.
- Lo studio della organizzazione della matrice connettivale prodotta dai fibroblasti dermici in coltura nell’arco di 5-10 giorni potrà dare informazioni sulla capacità di tale matrice di organizzarsi o meno in modo anomalo. Anche in questo caso verrà posta particolare attenzione alla deposizione delle componenti proteiche e glicoproteiche che partecipano alla formazione delle fibre elastiche ed alla interazione fra elastina e proteoglicani e fra elastina e specie glicosaminoglicaniche.
- Individuazione delle alterazioni del metabolismo dei fibroblasti associate a e/o provocate da mutazioni del gene ABCC6 che possano fare comprendere in quale modo la deficienza funzionale di un trasportatore di membrana della famiglia delle Multidrug Resistance Protein (MRP) possa modificare un determinato processo metabolico e come questo ultimo possa orientare sulla natura delle molecole fisiologicamente trasportate da MRP6. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Lo Pseudoxanthoma elasticum (PXE) è una patologia del tessuto connettivo con elastoressi generalizzata e deposizione di calcio nel derma, nei vasi sanguigni e nella membrana di Bruch della retina (Lebwohl et al., 1994; Neldner and Struk, 2002). Nella maggior parte dei casi, questa patologia è ereditata come carattere autosomico recessivo, colpisce le donne in proporzione doppia rispetto agli uomini e presenta una età media di insorgenza intorno ai 13 anni. Le lesioni cutanee appaiono come papule giallastre di circa 1-3 mm oppure come delle placche lineari o irregolari specialmente nelle aree flessurali della cute (piega del gomito, del ginocchio, del collo, dell'ascella, aree inguinali, e periombelicali). E'stato descritto anche un interessamento della mucosa orale, vaginale o rettale. La lassità cutanea può portare alla formazione di pieghe cadenti in particolare sul collo, sulle ascelle e nelle aree inguinali con gravi problemi estetici (Neldner e Struk, 2002). I problemi maggiori sono a carico di occhi e vasi. Le tipiche alterazioni oculari sono rappresentate da strie angioidi che irradiano dalla pupilla, un generale aspetto a buccia d’arancia , pigmentazioni irregolari , episodi emorragici specialmente nell’area della macula e cicatrici a carico della corioidea. In alcuni casi sono state osservate aree depigmentate alla periferia della retina. Le emorragie retiniche iniziano generalmente nella seconda-terza decade di vita. I pazienti con PXE presentano una perdita della visione periferica e circa un terzo di essi, oltre i 40 anni di età, sono considerati non vedenti. L’occlusione ed il restringimento vascolare sono dovute a calcificazioni della lamina elastica interna e possono essere responsabili di angina, ipertensione, infarto del miocardio, zoppicamento intermittente. Una insufficienza mitralica e/o aortica, aneurismi, ed emorragie intracerebrali sono stati descritti in diversi casi, mentre il coinvolgimento gastrointestinale può solo in rari casi essere fatale per emorragia improvvisa (Neldner and Struk, 2002).
Nel PXE le fibre elastiche appaiono di grandi dimensioni, estremamente polimorfiche con un contorno che sembra ricordare un gomitolo srotolato e sfilacciato, e di aspetto granulare dovuto alla deposizione di sali di calcio (McKee, 1996). L’abbondante calcificazione e la formazione di strutture tipo granulomi da corpo estraneo possono portare a perforazioni intrafollicolari o transpidermiche. L’utilizzo di colorazioni istologiche specifiche permette di visualizzare il tessuto elastico, mentre le calcificazioni sono identificate con il metodo di von Kossa (McKee, 1996). La colorazione con alcian blu, invece, permette di rivelare la presenza di mucopolisaccaridi in quantità elevata (Neldner and Struk, 2002). La positività al von Kossa delle fibre elastiche, in frammenti di cute patologica, rappresenta il test di elezione per la diagnosi di PXE. L’esame ultrastrutturale conferma e caratterizza meglio le alterazioni delle fibre elastiche. La maggior parte delle fibre elastiche va incontro ad una massiccia mineralizzazione (Danielsen, 1971), ma si possono osservare anche strie elettron-dense che si intersecano in ampie aree occupate da precipitati elettrondensi (Pasquali Ronchetti et al., 1981). Aggregati di microfilamenti positivi all’indentificazione per i glicosaminoglicani e per altri costituenti della matrice sono stati frequentemente evidenziati in associazione alle fibre elastiche (Baccarani et al., 1994b; Baccarani et al., 1996; Martinez-Hernandez and Huffer, 1974; Pasquali Ronchetti et al., 1986). In conclusione, il PXE è una patologia che interessa le diverse componenti dei tessuti connettivi e recenti dati indicano che le alterazioni descritte a livello cutaneo sono in realtà diffuse a tutti gli organi dei pazienti (Gheduzzi et al., 2001; Gheduzzi et al., 2003).
Nel 2000 il gene ABCC6 è stato identificato come il gene responsabile del PXE (Bergen et al., 2000; Le Saux et al., 2000; Rigfield et al., 2000). Esso è localizzato sulla regione p13.1 del cromosoma 16 e codifica per la proteina MRP6. Numerose mutazioni causative del PXE sono state recentemente descritte (Le Saux et al., 2001). Attualmente il laboratorio dell'Unità di Modena è impegnato nella identificazione di mutazioni nei pazienti italiani affetti da PXE e fino ad oggi sono state analizzate 41 famiglie italiane ed identificate 13 nuove mutazioni (Gheduzzi et al., inviato).
Negli ultimi 5 anni, sono stati contattati più di 100 pazienti italiani con PXE che hanno acconsentito a donare sangue e campioni di tessuto dermico per studi di biologia cellulare e molecolare. Ad oggi il laboratorio diretto da Pasquali Ronchetti possiede la più ampia collezione di DNA e fibroblasti in Italia e probabilmente in Europa.
Il gene del PXE (ABCC6) fa parte della famiglia dei trasportatori di membrana ABC che appartengono al sistema delle proteine che conferiscono resistenza ai farmaci (Klein et al., 1999). Il gene ABCC6 presenta un'elevata omologia con il vicino gene ABCC1 che codifica per il trasportatore MRP1, responsabile delle chemioresistenza in molti tipi di cellule tumorali (Borst et al., 1999). Il ruolo fisiologico di MRP6 è ancora ignoto. Sono stati effettuati studi per identificare il substrato trasportato da MRP6 (Madon et al., 2000; Ilias et al, 2002), e per valutare l'espressione di MRP6 nei diversi tessuti umani (Scheffer et al., 2002), tuttavia i risultati sono ancora lontani dall'averne definito sia il/i substrato/i che la funzione per la cellula. Attualmente, i dati più interessanti vengono da indagini su vescicole ricostituite transfettate con MRP6 in grado di trasportare molecole glutationate tra cui il leucotriene C4 e la N-etilmaleimide-S-glutationata (Ilias et al., 2002). L'MRP6 è risultata sovraespressa in alcune linee tumorali, ma solo in associazione ad una aumentata espressione di MRP1 (Kool et al., 1999). Nei tessuti normali, MRP6 è espresso in numerosi tessuti, in particolare negli epatociti e nelle cellule renali (Scheffer et al., 1999). E' opportuno sottolineare, a questo proposito, che nei pazienti con PXE, i parametri biochimici e la funzionalità epatica e renale sono nella norma e che, pertanto, in questi organi il ruolo di MRP6 potrebbe non essere così importante e/o potrebbe essere sostituito da altri trasportatori. Inoltre, le alterazioni nel PXE sono confinate ai tessuti connettivi, dove la mineralizzazione delle fibre elastiche e le alterazioni della matrice extracellulare portano alle manifestazioni cliniche tipiche della malattia. La espressione di MRP6 a livello dermico non è elevata, tuttavia è stato da noi recentemente dimostrato che l’MRP6 è espresso ed attivo nei fibroblasti dermici coltivati in vitro (Boraldi et al., 2003c). Mediante microscopia confocale, l’MRP6 è stato dimostrato essere espresso nel citoplasma di fibroblasti dermici, mentre i fibroblasti da pazienti con PXE, omozigoti per la mutazione stop codon R1141X, mostrano una positività alla marcatura con un anticorpo anti-MRP6 nulla o molto debole. Inoltre, i fibroblasti da pazienti con PXE sono meno efficienti, rispetto ai fibroblasti di individui di controllo, nell’estrudere la calceina fluorescente, un marcatore utilizzato per valutare la funzionalità dei trasportatori di membrana (Hollo, 1994). Questa osservazione è una chiara dimostrazione che i fibroblasti PXE hanno alterazioni nei sistemi di trasporto e che l’MRP6 nei fibroblasti potrebbe avere un ruolo nel veicolare substrati fisiologici. Inoltre, confrontando la differente sensibilità dei fibroblasti di controllo e PXE a inibitori/competitori del trasporto di calceina (vinblastina, clorambucile, benzbromarone, indometacina, MK577), abbiamo dimostrato che l’MRP6 si comporta in maniera diversa rispetto al suo omologo MRP1 e che non è inibito da MK571, mentre è efficiente nell’estrusione dell’indometacina (Boraldi et al., 2003c). Questi dati suggeriscono che il ruolo dell’MRP6 sia probabilmente differente da quello dell’MRP1 e che, almeno nei fibroblasti dermici, non possa essere vicariato nel caso di mutazioni del gene ABCC6. Questa ipotesi è stata confermata dall’osservazione che l’espressione dell’MRP1 e della Pgp non è modificata nelle cellule di PXE in confronto alle cellule di controllo. Pertanto, la mancanza di MRP6 non è sostituita da una aumentata espressione di altri trasportatori. Questi dati suggeriscono ulteriormente che i fibroblasti sono primariamente coinvolti nelle alterazioni dei tessuti connettivi associate alle manifestazioni cliniche tipiche del PXE. Attualmente, tuttavia, risulta ancora abbastanza difficile correlare il difetto a carico di un trasportatore di membrana con le alterazioni della matrice extracellulare tipiche del PXE. Recentemente, è stato osservato, su membrane ricostituite, che l’MRP6 trasporta molecole glutationate (Ilias et al., 2002); pertanto l’MRP6 potrebbe avere un ruolo nel trasporto di prodotti glutationati del metabolismo cellulare da un compartimento cellulare all’altro o dalle cellule all’ambiente extracellulare. Nel PXE questa funzione è annullata o fortemente compromessa e ciò è responsabile di gravi alterazioni nei meccanismi che controllano la produzione, la secrezione e probabilmente la degradazione di specifiche molecole della matrice extracellulare. Precedenti lavori effettuati nel nostro laboratorio hanno dimostrato che i fibroblasti PXE in vitro mostrano diverse anomalie rispetto ai fibroblasti di controllo dimostrando che la carenza di MRP6 influenza non solo il comportamento ma anche il metabolismo dei fibroblasti (Passi et al., 1996; Quaglino et al., 2000). Oltre trenta anni fa, è stato osservato che il processo di mineralizzazione è associato ad una anomala deposizione di proteoglicani nello spazio extracellulare del derma di pazienti con PXE (Martinez-Hernandez and Huffer, 1974). In seguito, digestioni enzimatiche su sezioni di tessuto hanno evidenziato un anomalo contenuto di glicosaminoglicani e di altri costituenti della matrice depositati nell’ambiente extracellulare del derma dei pazienti con PXE (Pasquali Ronchetti et al., 1986; Baccarani et al., 1994b; Baccarani et al., 1996). In una serie di studi tendenti a definire la qualità e le proprietà fisico-chimiche di questi polianioni, è stato osservato che i fibroblasti PXE producono e secernono proteoglicani e glicosaminoglicani con una grande tendenza ad aggregare e con un grado di solfatazione molto più elevato rispetto alle cellule di controllo (Tiozzo et al., 1988; Passi et al., 1996). Inoltre, attività proteasiche anomale sono state descritte a carico di fibroblasti PXE coltivati in vitro (Gordon et al., 1978; 1983). Pertanto, dati della letteratura indicano che i fibroblasti PXE presentano peculiari attività sintetiche e degradative. Una deregolazione nei meccanismi che controllano la sintesi e/o la degradazione dei costituenti della matrice extracellullare sono probabilmente alla base della deposizione di una matrice connettivale instabile e con tendenza a mineralizzare. E’ noto che l’equilibrio tra la sintesi e la degradazione della matrice ed un corretto rapporto quantitativo tra le diverse molecole è indispensabile per mantenere una adeguata impalcatura connettivale (Fornieri et al., 1999; Quaglino et al., 1993; 1996b; Pasquali Ronchetti et al., 1993; Pasquali Ronchetti et al., 1984b). In una serie di precedenti indagini è stato dimostrato che le fibre elastiche, uno dei costituenti della matrice maggiormente interessati dal processo patologico, ha una composizione estremamente complessa e che le sue componenti cambiano con l’età e in diverse patologie (Baccarani et al., 1990; 1994a; Quaglino et al., 1996a ; Quaglino e Pasquali Ronchetti, 2002; Pasquali Ronchetti et al., 1984a; Pasquali Ronchetti et al., 1995; Pasquali Ronchetti e Baccarani Contri, 1997). Pertanto, la mineralizzazione nel PXE potrebbe essere il risultato di un accumulo, nell’ambiente extracellulare, e nelle fibre elastiche in particolare, di prodotti dei fibroblasti secreti come tali e/o sottoposti ad attività proteolitiche.
Scopo del presente progetto è quello di identificare e caratterizzare i costituenti della matrice prodotti da fibroblasti di controllo e di pazienti affetti da PXE traendo vantaggio dalle moderne metodologie come i microarray a DNA, la RT-PCR, l’elettroforesi capillare, l’elettroforesi bidimensionale e la spettrometria di massa, unitamente a metodiche recentemente messe a punto per misurare i prodotti di degradazione della matrice extracellulare e per caratterizzare la struttura molecolare dei glicosaminoglicani tessutali e prodotti da fibroblasti in coltura. <<<