RICERCA ITALIANA     

Analisi della capacita' dei Toll-like receptors (TLR) di modulare le funzioni effettrici e regolatorie delle cellule dell'immunita' innata

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

Le diverse popolazioni dell'immunita' innata partecipano in maniera coordinata alla fase precoce della risposta contro i patogeni. Principali componenti della risposta naturale sono i monocito-macrofagi e le popolazioni linfocitarie delle cellule Natural Killer (NK) e dei linfociti T gamma/delta. Oltre a svolgere una funzione antimicrobica diretta, e contribuire cosi' alla limitazione della diffusione del patogeno nelle fasi iniziali dell'infezione, essi sono anche in grado, attraverso la rapida secrezione di citochine e chemiochine, e in seguito a una vasta gamma di interazioni cellulari, di modificare l'ambiente del sito infiammatorio, e di indurre l'attivazione ed il reclutamento di altre popolazioni a valle. Molteplici circuiti immunoregolatori vengono infatti attivati nelle fasi precoci d'infezione, ed hanno il risultato di indurre, potenziare e sostenere l'attivazione coordinata delle diverse popolazioni della risposta innata, e di dettare l'ambiente citochinico responsabile dell'istruzione della risposta adattativa.
La famiglia dei TLR, recettori identificati recentemente, capaci di riconoscere profili molecolari microbici altamente conservati (denominati PAMP, componenti molecolari dei patogeni), assume un ruolo particolarmente rilevante nel mediare l'interazione delle popolazioni dell'immunita' innata con i costituenti molecolari dei patogeni. Le funzioni scatenate dai TLR, attraverso vie di segnalazione non ancora completamente chiarite, portano alla rapida produzione di citochine proinfiammatorie, promuovono la maturazione delle cellule dendritiche e favoriscono una risposta orientata verso un profilo di tipo T helper 1; essi inoltre possono direttamente influenzare le funzioni antimicrobiche. I recettori intracellulari TLR3 e TLR9, in particolare, sono specifici per l'RNA a doppia elica (dsRNA) e per oligodeossinucleotidi ricchi in sequenze CpG non metilate (CpG ODN), prodotti comuni del metabolismo di diversi agenti microbici. I meccanismi molecolari alla base della capacita' di TLR3 e TLR9 di modulare le funzioni cellulari sono ancora poco noti, in particolare, nei linfociti della risposta innata.
Per la loro capacita' di attivare potentemente le cellule dell'immunita' innata, e' stato recentemente proposto il possibile utilizzo dei ligandi dei TLR come adiuvanti vaccinali in strategie terapeutiche di immunostimolazione. La cooperazione fra i diversi effettori dell'immunita' naturale (eventualmente potenziata dall'uso immunoterapeutico dei ligandi dei TLR) potrebbe essere anche efficace nel superare le strategie di evasione dei patogeni. Lo stretto legame esistente fra l'immunita' innata e quella adattativa ha delle implicazioni rilevanti per la progettazione di strategie vaccinali ed immunoterapeutiche. Una conoscenza piu' approfondita dei circuiti regolatori dell'immunita' innata ed il loro impatto sui partecipanti alla risposta adattativa e' quindi necessaria per una progettazione razionale di nuove strategie immunomodulatrici.
Questo progetto di ricerca e' teso a caratterizzare la capacita' dei ligandi di TLR3 e TLR9 di modulare le funzioni (attivita' anti-microbiche, citotossicita', secrezione di citochine, e sopravvivenza) di diverse popolazioni dell'immunita' naturale (macrofagi, linfociti T gamma/delta, cellule NK), con particolare attenzione al ruolo svolto nell'influenzare i circuiti regolatori fra le diverse popolazioni cellulari. Le informazioni ottenute da questo studio aiuteranno a definire le basi molecolari attraverso le quali componenti microbici, prodotti nel corso dell'infezione, o somministrati all'interno di una immunoterapia adiuvante, possono influenzare l'attivazione, la proliferazione e la persistenza delle diverse cellule della risposta naturale nel sito d'infezione, e rappresenteranno una base razionale per la progettazione di strategie di immunomodulazione tese a potenziare o ripristinare le loro funzioni in un ampio spettro di patologie infettive. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Gabriella PALMIERI Universita' degli Studi di ROMA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Le diverse cellule dell'immunita' naturale (che includono macrofagi, cellule dendritiche, linfociti T gamma/delta e cellule Natural Killer (NK)) svolgono un ruolo essenziale nella risposta innata alle infezioni e nell'istruzione e polarizzazione della risposta adattativa. La loro capacita' di provocare l'uccisione del patogeno e/o della cellula infettata e' determinante per limitare la diffusione dell'infezione; la loro attivita' immunoregolatoria si basa sulla rapida produzione di citochine e chemiochine, che inducono l'attivazione ed il reclutamento al sito infiammatorio di altre popolazioni cellulari, e su interazioni cellula-cellula, mediate da recettori di membrana a funzione diversa (attivatoria, costimolatoria, inibitoria). Le funzioni delle popolazioni dell'immunita' innata sono regolate finemente dall'interazione con i costituenti molecolari dei patogeni. In quest'ambito, la famiglia dei recettori di tipo Toll (Toll-like receptors, TLR), recentemente identificati, assume un ruolo centrale, perche' permette il riconoscimento di profili molecolari microbici altamente conservati (denominati PAMP, componenti molecolari dei patogeni), e determina l'attivazione funzionale, la differenziazione e la sopravvivenza cellulare. In particolare, TLR3 e TLR9, a localizzazione intracellulare, sono in grado di riconoscere rispettivamente l'RNA a doppia elica (dsRNA) e oligodeossinucleotidi ricchi in sequenze CpG non metilate (CpG ODN). Per la loro capacita' di attivare potentemente le cellule dell'immunita' innata, si e' prospettato l'impiego dei loro ligandi come molecole "adiuvanti" in strategie terapeutiche di immunostimolazione. La maggior parte delle informazioni disponibili sulla biologia di questi recettori sono state ottenute pero' in sistemi eterologhi di espressione, e necessitano di una validazione in cellule fisiologicamente esprimenti i due recettori.
Questo progetto di ricerca e' teso a caratterizzare la capacita' di TLR3 e TLR9 di modulare le funzioni effettrici e regolatorie di diverse popolazioni dell'immunita' naturale (macrofagi, linfociti T gamma/delta, cellule NK), con particolare attenzione al ruolo svolto nella sopravvivenza e nella regolazione del "cross-talk" fra le diverse popolazioni cellulari. I risultati di questo programma di ricerca porteranno ad una migliore definizione delle basi molecolari attraverso le quali componenti microbici quali dsRNA e CpG ODN, prodotti nel corso dell'infezione, o somministrati all'interno di una immunoterapia adiuvante, possono influenzare l'attivazione, la proliferazione le funzioni e la persistenza delle diverse cellule della risposta naturale nel sito d'infezione, e rappresenteranno una base razionale per la progettazione di strategie di immunomodulazione tese a potenziare o ripristinare le loro funzioni in un ampio spettro di patologie infettive.
Questa proposta che si articolera' nel corso di due anni, intende raggiungere i seguenti obiettivi:
1. Studio dell'espressione, della modulazione e delle funzioni innescate da TLR3 e TLR9 in diverse popolazioni dell'immunita' innata.
Le Unita' coordinate di questo progetto si propongono di chiarire i meccanismi che regolano la responsivita' di macrofagi, cellule NK e linfociti T gamma/delta ad acidi nucleici di origine microbica, e di elucidare il ruolo dei ligandi per TLR3 e TLR9 nella regolazione delle funzioni effettrici di queste cellule. Nell'ambito del raggiungimento di questo obiettivo:
L'Unita' Dieli determinera' l'espressione e la modulazione di TLR3 e TLR9 su differenti subset di linfociti Vgamma9/Vdelta2, valutando anche la distribuzione sucellulare dei diversi TLR (in collaborazione con l'Unita' Palmieri); questa Unita' analizzera' inoltre la capacita' dei ligandi di TLR3 e TLR9 di modulare la proliferazione, la produzione di citochine e chemiochine, l'attivita' citotossica, e la differenziazione da linfocita memory a cellula effettrice terminalmente differenziata in linfociti Vgamma9/Vdelta2;
L'Unita' Fraziano esplorera' il potenziale di TLR3 e TLR9, espressi su macrofagi umani, di incrementare le difese naturali dell'ospite verso l'infezione tubercolare; in particolare, valutera' se molecole di dsRNA (ligandi di TLR3), analogamente a quanto avviene per i ligandi di altri TLR, sono in grado di indurre attivita' microbicida in macrofagi umani;
L'Unita' Palmieri analizzera' l'espressione, la modulazione e la compartimentalizzazione di TLR3 e TLR9 in cellule NK; studiera' inoltre l'effetto dei ligandi specifici sulle funzioni delle cellule NK (citotossicita' naturale e ADCC, produzione di citochine e chemiochine) e sull'espressione di molecole coinvolte nell'interazione cellula-cellula.
2. Analisi degli eventi di segnalazione iniziati da TLR3 e TLR9 in diverse cellule dell'immunita' innata.
Le evidenze sperimentali riguardanti le vie di trasduzione del segnale iniziate dai diversi TLR sono ancora incomplete, e spesso ottenute attraverso l'uso di sistemi cellulari eterologhi. Le Unita' coinvolte sono interessate ad ottenere una migliore comprensione delle basi molecolari che regolano la capacita' segnalatoria dei TLR in cellule diverse dell'immunita' innata. A questo scopo:
l'Unita' Fraziano, che ha recentemente dimostrato la capacita' di CpG ODN di attivare la fosfolipasi D macrofagica, studiera' l'attivazione delle fosfolipasi D, C e A2 e della NADPH ossidasi da parte del dsRNA e di CpG ODN;
l'Unita' Palmieri analizzera' la capacita' dei ligandi specifici di TLR3 e TLR9 di indurre l'attivazione dei diversi membri della famiglia MAPK, e dei fattori trascrizionali NFkappaB e IRF3, ed identifichera' gli eventi prossimali al recettore responsabili di questa attivazione. In collaborazione con l'Unita' Fraziano, l'attivazione delle MAPK, dei fattori trascrizionali NFkappaB e IRF3, e delle diverse fosfolipasi sara' estesa anche ai macrofagi.
3. Analisi del ruolo di TLR3 e TLR9 nel modulare le funzioni effettrici, antimicrobiche e regolatorie delle cellule dell'immunita' innata.
Le Unita' proponenti identificheranno le modalita' attraverso le quali la stimolazione di macrofagi, linfociti T gamma/delta e cellule NK con i ligandi specifici dei TLR potenzia l'uccisione del patogeno e/o della cellula infettata, modifica il programma apoptotico e la sopravvivenza cellulare, nonche' come essa possa modulare le interazioni cellula-cellula fra i diversi partecipanti alla risposta immune, con particolare attenzione al ruolo giocato dal recettore attivatorio NKG2D e dai suoi ligandi. Nell'ambito di questo obiettivo:
L'Unita' Dieli analizzera' la capacita' di ligandi per TLR9 di indurre l'espressione dei ligandi per NKG2D su macrofagi o cellule dendritiche, ed attivare in tal modo i linfociti Vgamma9/Vdelta2; l'Unita' analizzera' inoltre il ruolo di questa coppia recettore:ligando nelle differenti funzioni effettrici dei linfociti Vgamma9/Vdelta2 e nella loro interazione con macrofagi e cellule NK (in collaborazione con le Unita' Fraziano e Palmieri);
l'Unita' Fraziano studiera' il coinvolgimento delle diverse fosfolipasi, e della NADPH ossidasi, attivate dai ligandi di TLR3 e TLR9 e dei loro prodotti sia nell'attivita' micobattericida dei macrofagi infettati da M. tuberculosis, che nella biogenesi e nella maturazione del fagolisosoma. In collaborazione con le Unita' Dieli e Palmieri, saggera' l'attivita' antimicobatterica esercitata da linee cellulari T gamma/delta e da cellule NK, stimolate dai ligandi di TLR3 e TLR9, nei confronti di macrofagi infettati da M. tuberculosis;
l'Unita' Palmieri studiera' il ruolo dei diversi eventi di segnalazione nelle funzioni attivate dai TLR in cellule NK umane. In collaborazione con l'Unita' Fraziano, analizzera' il ruolo dei ligandi per il recettore attivatorio NKG2D nell'interazione fra cellule NK e macrofagi infettati da M. tuberculosis e/o stimolati con i ligandi di TLR3 e TLR9. Essa accertera' anche se la stimolazione con ligandi dei TLR modula l'apoptosi attivazione-dipendente delle cellule NK. <<<

Risultati parziali attesi

I risultati attesi alla fine della prima fase di questo progetto di ricerca consistono nella:
- comprensione dei meccanismi che regolano l'espressione e la modulazione di TLR3 e TLR9 sulle cellule dell'immunita' innata;
- caratterizzazione degli effetti dei ligandi di TLR3 e TLR9 sull'attivazione, le funzioni e la differenziazione di macrofagi, cellule NK e linfociti gamma/delta;
- identificazione delle principali vie di trasduzione del segnale iniziate da TLR3 e TLR9 in diverse cellule dell'immunita' innata.I risultati attesi alla fine della seconda fase di questo progetto di ricerca consistono nella:
- valutazione del ruolo di ligandi di TLR3 e TLR9 nel modificare, direttamente e indirettamente, le interazioni e la regolazione funzionale delle diverse popolazioni dell'immunita' innata;
- identificazione degli eventi di segnalazione TLR-mediati coinvolti nella biogenesi e maturazione del fagolisosoma macrofagico, e nelle attivita' funzionali delle cellule NK;
- definizione del ruolo dell'ambiente cellulare nella capacita' segnalatoria di TLR3 e TLR9;
- identificazione del ruolo di ligandi per TLR nel modulare la sopravvivenza delle cellule NK. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Alla fase precoce della risposta contro i patogeni, partecipano in maniera coordinata le diverse popolazioni dell'immunita' innata. I monocito-macrofagi e le popolazioni linfocitarie delle cellule Natural Killer (NK) e dei linfociti T gamma/delta sono importanti effettori della resistenza naturale contro le infezioni da parte di molti patogeni intracellulari. Sebbene inizialmente caratterizzate per la funzione antimicrobica diretta, queste popolazioni cellulari sono anche in grado, attraverso la rapida secrezione di citochine e chemiochine, di modificare l'ambiente del sito infiammatorio, e di indurre l'attivazione ed il reclutamento di altre popolazioni a valle, contribuendo cosi' all'istruzione della risposta adattativa.
I macrofagi residenti nei tessuti, e i monociti che vengono rapidamente reclutati nel sito infiammatorio, rappresentano un sistema precoce di rilevamento delle infezioni, funzionando sia da sentinella, che da prima linea di difesa contro i patogeni. Oltre a effettuare l'uccisione intracellulare di una varieta' di patogeni, sono in grado di produrre una vastissima gamma di mediatori biologici, fra i quali citochine e chemiochine, che portano al reclutamento e all'attivazione coordinata di altre cellule deputate all'eliminazione dell'infezione (1); essi inoltre partecipano all'istruzione e alla polarizzazione della risposta adattativa per la loro capacita' di presentare l'antigene ai linfociti T. Le funzioni effettrici anti-microbiche dei macrofagi nonche' la loro attivita' immunoregolatoria sono finemente regolate da fattori solubili e da recettori responsabili dell'interazione con il patogeno o con gli altri partecipanti alla risposta immunitaria.
I linfociti T con recettore (TCR) di tipo gamma/delta rappresentano una piccola popolazione (circa il 5%) di linfociti T nel sangue periferico, ma rappresentano la popolazione linfocitaria predominante negli epiteli. La maggior parte dei linfociti T gamma/delta nel sangue periferico esprime un recettore di tipo Vgamma9/Vdelta2 e riconosce molecole non proteiche con residui critici di fosfato che, pertanto, vengono chiamati fosfoantigeni. Questi ligandi a basso peso molecolare possono essere di derivazione microbica, o metaboliti ubiquitari o, ancora, molecole non caratterizzate presenti su cellule tumorali (2). A differenza dei linfociti alfa/beta, il riconoscimento dei fosfoantigeni da parte dei linfociti T Vgamma9/Vdelta2 non richiede nè il processamento intracellulare, nè la loro presentazione in associazione a molecole MHC (2). I linfociti Vgamma9/Vdelta2 svolgono attivita' citotossica verso un gran numero di linee tumorali e sono inoltre in grado di uccidere sia macrofagi infettati da Mycobacterium tuberculosis che il patogeno intracellulare, attraverso un meccanismo che coinvolge il rilascio, dai granuli, di perforina e granulisina (3, 4). Evidenze recenti hanno ipotizzato che esista un'eterogeneita' funzionale nei linfociti Vgamma9/Vdelta2; in particolare, l'Unita' Dieli ha dimostrato la presenza nel sangue periferico di quattro differenti subsets di linfociti con differente fenotipo, proprieta' funzionali e localizzazione (5). Benche' sembra evidente una progressione da cellule "naive" verso cellule terminalmente differenziate, i fattori responsabili di questo processo sono poco noti ed e' possibile che il mantenimento e/o l'espansione di cellule di tipo "memory" e la loro differenziazione verso cellule effettrici e terminalmente differenziate possa essere indotta non soltanto dai fosfoantigeni, ma anche da citochine ed altri stimoli policlonali.
Le cellule Natural Killer (NK) costituiscono una piccola sottopopolazione di linfociti nel sangue periferico ed in alcuni organi linfoidi e non linfoidi (6). Esse infiltrano rapidamente i siti d'infezione, dove possono svolgere la loro funzione citotossica, sia di di tipo "naturale", che anticorpo-dipendente (ADCC), grazie alla presenza, sulla quasi totalita' delle NK, del CD16, il recettore a bassa affinita' per il frammento Fc delle IgG, FcgammaRIII (7). Le loro attivita' sono strettamente regolate dal bilanciamento di segnali positivi (provenienti da un'ampia gamma di recettori attivatori) e negativi (innescati da recettori inibitori, specifici per le molecole MHC di classe I), in seguito all'interazione con le cellule bersaglio e con gli altri componenti della risposta immunitaria (8-12). Il recettore attivatorio NKG2D, in particolare, e' specifico per ligandi cellulari che sono prontamente indotti dalle infezioni in diversi tipi cellulari (MIC-A and B, ULBPs) (8, 9). Le funzioni delle cellule NK dipendono da molteplici vie di segnalazione che, come elucidato anche dall'Unita' Palmieri, vedono la partecipazione di tirosino- e serintreonino-chinasi, chinasi lipidiche (PI3-K), GTPasi (delle famiglie rho/rac e ras), fosfolipasi, e chinasi attivate da mitogeni (MAPK); gli effettori ultimi di queste cascate organizzano e coordinano la risposta funzionale (13-17). L'ampiezza e la dinamica delle risposte NK in vivo, e la persistenza di queste cellule nel sito d'infezione, sono strettamente regolate da un'ampia varieta' di citochine, sia della risposta innata che adattativa, da sostanze eterogenee, i "modificatori della risposta biologica" (BRM) (6, 18), e da interazioni cellula-cellula; a questo proposito, e' stato dimostrato che il CD16 e' in grado di indurre l'apoptosi di cellule NK attivate da IL-2, mediante le vie regolate dal ligando di Fas (FASL) e dal TNF (19, 20).
Recentemente, e' stata identificata una famiglia di recettori di membrana evolutivamente conservati, i recettori Toll-like (TLR), responsabili del riconoscimento di componenti molecolari dei patogeni (Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMP) (21, 22). Essi rappresentano un rapido ed efficiente sistema di sorveglianza dell'immunita' innata, in grado di guidare ed attivare le successive risposte antigene-specifiche dell'immunita' adattativa (21-23). Ad oggi sono stati identificati 10 membri appartenenti a questa famiglia, ognuno dei quali riconosce profili molecolari distinti. Alcuni TLR sono diretti contro acidi nucleici derivanti da patogeni: TLR3 e' infatti specifico per polimeri di RNA a doppia elica (dsRNA), intermedi del ciclo replicativo di molti virus (24), e TLR9 interagisce con molecole di DNA ricche in sequenze CpG non metilate (CpG ODN), che sono abbondantemente rappresentate nel DNA di origine batterica (25); evidenze molto recenti indicano che TLR7 e TLR8 sono in grado di riconoscere molecole di RNA a singola elica (26, 27). Questo gruppo di TLR mostra una distribuzione peculiare all'interno della cellula: diverse evidenze in letteratura, infatti, hanno dimostrato che TLR9 si localizza in un compartimento intracellulare di tipo lisosomiale, la cui integrita' e' necessaria per la capacita' funzionale del recettore; questa caratteristica sembra condivisa anche da TLR3, in dipendenza dal tipo cellulare preso in esame (28, 29). La capacita' dei diversi TLR di riconoscere un repertorio di profili molecolari microbici, la loro localizzazione sulla superficie cellulare o sulle membrane fagosomiali e le loro potenti vie di segnalazione rendono la famiglia dei TLR un sistema eccellente per il riconoscimento dei patogeni.
L'espressione e la funzione dei TLR per acidi nucleici (TLR3 e TLR9) all'interno del compartimento emopoietico e' stata inizialmente descritta principalmente in cellule dendritiche e monocito-macrofagiche, dove i rispettivi ligandi inducono la produzione di citochine proinfiammatorie ad attivita' antimicrobica, quali IFN di tipo I, IL-12, IL-6, TNF, promuovono la maturazione delle cellule dendritiche e favoriscono una risposta orientata verso un profilo di tipo T helper 1 (21-23); non e' ancora noto se i ligandi di questi TLR, in maniera simile a quanto proposti per altri TLR (30), possano modulare la sopravvivenza cellulare.
Oltre a controllare lo sviluppo dell'immunita' adattativa, l'attivazione di TLR3 e TLR9 sulle cellule della risposta innata puo' essere anche direttamente coinvolta nell'attivita' antimicrobica (23, 31). In particolare, l'attivita' microbicida di macrofagi murini e umani nei confronti di diversi patogeni intracellulari e' aumentata dalla stimolazione con CpG ODN, attraverso meccanismi ancora non delucidati completamente, come dimostrato anche da ricerche dell'Unita' Fraziano (32-35). L'evidenza che alcuni ligandi di TLR siano in grado di indurre attivita' antimicobatterica nel macrofago e' rilevante, considerando che solo poche molecole sono state fino ad oggi descritte indurre inequivocabilmente tale attivita' (36-38). Infine, un ruolo chiave nell'induzione di tali meccanismi microbicidi è svolto dalla fosfolipasi D macrofagica (35, 38).
L'espressione e la funzione dei TLR rimane ancora molto poco studiata nei linfociti della risposta innata: le informazioni riguardanti l'espressione e la modulazione di TLR3 e TLR9 in cellule NK sono molto scarse, e la capacita' di queste cellule di riconoscere direttamente molecole di dsRNA o CpG ODN e' ancora controversa (28, 39-42); d'altra parte, e' noto da molti anni che la stimolazione in vivo con RNA virali o con l'acido poliinosinico-policitidilico (poly I:C), un dsRNA sintetico, induce il rapido aumento dell'attivita' NK (18, 43, 44). I risultati ottenuti dall'Unita' Palmieri dimostrano l'espressione dell'mRNA per TLR3 in cellule NK umane, sia fresche che attivate a breve termine in vitro, ed in un pannello di linee tumorali a fenotipo NK; essi indicano inoltre che la stimolazione di cellule NK umane altamente purificate con il dsRNA sintetico poly I:C potenzia l'attivita' citotossica sia di tipo naturale che CD16-mediata, ed induce la produzione della chemiochina CXCL10 (IP10) (Pisegna e Palmieri, manoscritto in preparazione). Benche' l'espressione di TLR sui linfociti Vgamma9/Vdelta2 umani non sia finora stata studiata, recenti studi nel topo indicano che alcuni subsets di linfociti gamma/delta esprimono costitutivamente certi TLR (45) che, in seguito ad interazione con i loro ligandi, ne determinano l'attivazione.
I meccanismi molecolari alla base della capacita' dei TLR di modulare le funzioni cellulari sono ancora in buona parte sconosciuti. La capacita' di segnalazione dei TLR dipende in maniera cruciale da proteine con funzione adattatrice, come MyD88 (associato a diversi TLR, fra i quali TLR9), e TRIF/TICAM-1 (selettivamente associato a TLR3) (46), che conferiscono selettivita' agli eventi funzionali scatenati dai diversi TLR. Questi adattatori promuovono l'associazione di complessi multimolecolari, identificati ancora solo parzialmente, con la regione intracellulare del recettore, che avviano cascate enzimatiche che portano all'attivazione dei fattori trascrizionali NFkappaB e IRF3 e delle MAPK (le chinasi ERK, JNK e p38) (21, 22, 46), coinvolti nella sintesi di citochine, chemiochine e molecole costimolatorie. A questo proposito, l'Unita' Palmieri ha recentemente dimostrato che la stimolazione con dsRNA induce l'attivazione della MAPK p38 in cellule NK umane (Pisegna e Palmieri, manoscritto in preparazione), e i risultati ottenuti dall'Unita' Fraziano indicano la capacita' di CpG ODN di indurre l'attivazione della fosfolipasi D in macrofagi infettati da M. tuberculosis, ed analizzano il ruolo di questa attivita' enzimatica nella funzione microbicida (35).
Da quanto detto finora, risulta chiaro che le funzioni delle diverse popolazioni dell'immunita' innata possono essere potentemente regolate da componenti molecolari dei patogeni. I circuiti immunoregolatori che coinvolgono le diverse popolazioni dalla risposta naturale, mediati sia da componenti solubili (citochine e chemiochine), che da recettori di membrana, sono responsabili sia del potenziamento delle risposte effettrici, che dell'istruzione della risposta adattativa. Ad esempio, i linfociti Vgamma9/Vdelta2 e cellule NK producono rapidamente TNF alfa ed IFN gamma, che hanno un ruolo fondamentale nella maturazione di cellule dendritiche, nel potenziamento delle funzioni microbicide dei macrofagi (6, 18, 43, 47), e nell'attivazione di linfociti T classici e delle cellule NK stesse; inoltre, essi producono, in seguito a stimolazione, elevate quantita' di chemiochine quali CXCL8, CCL3, CCL4, CCL5, XCL1 (6, 18, 48-50), particolarmente attive nel reclutamento di macrofagi, cellule NK e linfociti T attivati nel sito di flogosi (43, 51); i macrofagi attivati, a loro volta, producono IL-12, che potenzia la secrezione di IFN gamma da parte delle cellule NK. La prevalenza di profili citochinici e chemiochinici diversi puo' giocare un ruolo importante nella polarizzazione Th1/Th2 della risposta adattativa nelle infezioni.
Le funzioni dei partecipanti alla risposta innata sono anche finemente regolate da interazioni cellula-cellula; ad esempio, l'attivazione dei linfociti Vgamma9/Vdelta2 da parte dei fosfoantigeni e' notevolmente potenziata dalla presenza di cellule macrofagiche o di cellule dendritiche (52), suggerendo il coinvolgimento di molecole costimolatorie nell'attivazione di tali linfociti. Il recettore NKG2D, in particolare, espresso costitutivamente sia sulle cellule NK (8, 9), che sui linfociti Vgamma9/Vdelta2 (53), potrebbe rappresentare un importante componente nelle interazioni fra effettori diversi nel sito d'infezione; infatti, oltre ad essere coinvolto nel riconoscimento NK di cellule bersaglio infettate da diversi tipi di patogeni (8, 9, 50), e' stato dimostrato che l'interazione tra NKG2D e MIC-A, espresso sia da cellule epiteliali stressate, che da macrofagi e cellule dendritiche infettate con Mycobacterium tuberculosis, potenzia notevolmente l'attivazione dei linfociti Vgamma9/Vdelta2 indotta da fosfoantigeni (53). E' stato recentemente dimostrato, inoltre, che la stimolazione di macrofagi murini tramite TLR induce l'espressione di ligandi per NKG2D (54).
Molteplici circuiti immunoregolatori vengono quindi attivati nelle fasi precoci d'infezione, ed hanno il risultato di indurre, potenziare e sostenere l'attivazione coordinata delle diverse popolazioni della risposta innata, e di dettare l'ambiente citochinico responsabile dell'istruzione della risposta adattativa. Queste interazioni possono essere potentemente modulate dal riconoscimento di componenti molecolari dei patogeni da parte dei TLR.
Su questa base razionale e' stato recentemente proposto il possibile utilizzo dei ligandi dei TLR come adiuvanti vaccinali di nuova formulazione (55). In questo contesto, l'immunizzazione mucosale con virus inattivati o con loro componenti in associazione a CpG ODN, come adiuvante, e' stato dimostrato indurre una forte immunita' protettiva di tipo mucosale e sistemico in modelli di infezione in vivo con HSV-2 ed HIV (56, 57). <<<