RICERCA ITALIANA     

Glomerulonefrite membranosa: ricerca di fattori prognostici molecolari predittivi dell'efficacia del trattamento per mezzo di analisi proteomica applicata alle urine e ai preparati bioptici renali.

Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia

Abstract

La glomerulonefrite membranosa (GNM) è la prima causa di sindrome nefrosica dell'adulto nella popolazione caucasica [1]. Nei paesi occidentali l'eziologia è sconosciuta (idiopatica) nel 77% dei casi (GNMi) [2]. Sebbene il ruolo della nefropatia membranosa come causa di sindrome nefrosica sia ben documentato, l'impatto nel determinare uremia terminale è stato sorprendentemente poco studiato. Mancano studi comparativi che valutino non solo la prevalenza, ma anche le terapie attuate e la mortalità dopo l'avvio del trattamento sostitutivo (dialisi o trapianto renale). Per tale motivo ci proponiamo di analizzare il ruolo della glomerulonefrite membranosa come causa di uremia in un'ampia area italiana con caratteri di sostanziale omogeneità territoriale. Parallelamente alla puntualizzazione dei parametri clinici implicati nell'evoluzione e prognosi di questa condizione patologica siamo interessati ad individuare marcatori prognostici di tipo biologico per mezzo di tecniche proteomiche. Come in altre glomerulonefriti anche nella GNMi l'entità della proteinuria è correlata alla prognosi [3-5] ed è stato dimostrato che la terapia immunosoppressiva è in grado di indurre la remissione clinica della malattia in una buona percentuale di casi (55,3 % al termine del trattamento immunosoppressivo) migliorandone significativamente la sopravvivenza [6,7]. E' importante individuare marcatori predittivi del risultato del trattamento al quale non tutti i pazienti sono sensibili e che non è privo di effetti collaterali. In questo studio ci proponiamo di identificare nelle urine dei pazienti marcatori proteici specifici della GNMi e marcatori proteici predittivi della risposta terapeutica. Questi marcatori saranno ricercati per mezzo di cromatografia liquida accoppiata ad analisi di spettrometria di massa [8-13]. I dati molecolari saranno interpretati sulla base dell'efficacia della terapia immunosoppressiva in termini di riduzione della proteinuria alla fine di un ciclo terapeutico a base di cortisone e ciclofosfamide della durata di sei mesi (il trattamento è lo stesso nei tre centri di reclutamento). Marcatori predittivi dell'efficacia del trattamento saranno ricercati con analoghe metodologie analitiche nel materiale bioptico renale processato per mezzo di microdissezione laser. Parallelamente i dati molecolari saranno correlati ad indici istologici (glomeruloslerosi, fibrosi interstiziale, infiltrato interstiziale ecc.) e a valutazioni immunoistochimiche di caratterizzazione dell'infiltrato infiammatorio [14-16]. Lo studio clinico e molecolare permetterà una definizione prognostica più corretta e permetterà quindi una più consapevole gestione clinica del paziente. L'approfondimento molecolare delle alterazioni proteinuriche in GNMi dischiude nuovi possibili scenari patogenetici in una patologia per molti aspetti ancora misteriosa. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Alberto ALBERTAZZI Università degli Studi di MODENA e REGGIO EMILIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Questo studio si propone di individuare marcatori che caratterizzino in modo specifico la GNMi rispetto ad altre glomerulonefriti ad esordio nefrosico e di definire marcatori predittivi dell'efficacia del trattamento immunosoppressivo. Questa ricerca ha una finalità prognostica, tentando di ottimizzare la strategia terapeutica ed uno scopo nosologico, definendo sottogruppi omogenei nella eterogeneità eziologica della GNMi. La natura idiopatica della patologia raccoglie verosimilmente una notevole eterogeneità eziologica alla quale corrisponde variabilità nella storia naturale e nella risposta terapeutica. Saranno confrontati i profili proteomici dei pazienti responsivi alla terapia immunosoppressiva rispetto ai pazienti resistenti alla stessa per individuare marcatori predittivi della risposta terapeutica; saranno confrontati i profili dei pazienti prima e dopo il trattamento immunosoppressivo per verificare la presenza di marcatori specifici di sensibilità al trattamento. La caratterizzazione proteomica dei soggetti sarà effettuata sia sulle proteine urinarie sia su tessuto renale ottenuto attraverso biopsia renale previa processazione per microdissezione laser. Parallelamente saranno raccolti dati clinici, morfologici e immunoistochimici nel tessuto renale che permetteranno una valutazione multivariata degli outcome clinici. <<<

Risultati parziali attesi

Al termine della prima fase si attendono i seguenti risultati:
- completezza e disponibilità dei dati aggiornati del Registro Regionale Piemontese di Dialisi e Trapianto
- reclutamento di circa 50 casi di GNMi. Per ciascuno di tali pazienti saranno disponibili: follow up clinico, proteine urinarie purificate, proteine purificate derivate dalla processazione in microdissezione laser della biopsia renale, preparati immunoistochimici dell'infiltrato infiammatorio
- tutti i dati relativi al follow up clinico, alle valutazioni istologiche ed immunoistochimiche saranno raccolte centralmente in forma di database elettronico liberamente consultabile da tutte le unità di ricerca.Al termine della seconda fase si attendono i seguenti risultati:
- disponibilità di un database contenente tutti i profili proteomici dei pazienti analizzati relativi alle proteine urinarie e alle proteine derivate dalla microdissezione laser delle biopsie renali
- interfacciamento dei tre database: 1) database clinico dei pazienti arruolati; 2) database istologico ed immunoistochimico delle caratteristiche morfologiche delle biopsie renali; 3) database molecolare contenente i profili proteomici
- valutazione statistica multivariata dei parametri disponibili nei database disponibili per estrapolare i fattori predittivi dell'evoluzione clinica e della risposta clinica al trattamento immunosoppressivo. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La glomerulonefrite membranosa (GNM) rappresenta la prima causa di sindrome nefrosica nell'adulto (25% dei pazienti con età inferiore a 50 anni e 35% dei pazienti con età superiore [1]). Il passaggio, prolungato nel tempo, di proteine in quantità elevata attraverso il glomerulo ed il tubulo renale è stato più volte messo in relazione causale con l'induzione di un danno renale quantità-dipendente e con progressivo deterioramento della funzionalità renale fino al possibile sviluppo di uremia terminale. La sindrome nefrosica comporta inoltre l'insorgenza di numerose alterazioni di tipo biochimico ed emodinamico. Tali alterazioni espongono l'organismo al potenziale sviluppo di gravi complicanze con elevato rischio di mortalità indipendentemente dal peggioramento della funzione renale. E' stato calcolato, in una casistica di adulti americani che, in pazienti con sindrome nefrosica persistente, il rischio di morte è aumentato 11 volte ed il rischio di malattia coronarica è di 4.3 volte superiore rispetto a controlli di pari età e sesso [17]. Sebbene il ruolo della nefropatia membranosa come causa di sindrome nefrosica sia ben documentato, il suo "peso" come causa di uremia terminale è stato, quasi sorprendentemente, poco studiato e, soprattutto, mancano studi comparativi che valutino non solo la prevalenza, ma anche i criteri di riferimento nefrologico, le terapie eseguite e la mortalità dopo l'avvio del trattamento sostitutivo (dialisi o trapianto renale) al momento attuale e nel corso degli ultimi decenni [4,18,19]. Se il peso, in termini di mortalità, della microalbuminuria, è ben noto, meno si sa sul ruolo di sindromi nefrosiche aggressive e protratte, il cui effetto in termini di accelerazione del danno cardiovascolare è stato studiato da un punto di vista fisiopatologico ed a breve termine, ma i cui effetti a distanza sono meno conosciuti. In particolare, l'importanza di una sindrome nefrosica nella genesi di una sorta di "invecchiamento accelerato" che caratterizza la storia naturale dei nostri pazienti dopo l'inizio della dialisi, non è chiarita. I suoi effetti potrebbero rendersi evidenti anche a distanza di decadi, combinandosi con i danni a lungo termine della dialisi o del trapianto di rene. Nei paesi occidentali l'eziologia della GNM è sconosciuta in circa il 77% dei casi (GNM idiopatica, GNMi) ed il riscontro di sindrome nefrosica è valutabile in una percentuale pari a circa l'80% dei casi [3]. La storia naturale di questa nefropatia è stata documentata in diversi studi con una discreta variabilità. Una recente analisi combinata per 32 diversi studi ha stimato una sopravvivenza renale a 10 anni compresa tra il 65% e il 75% [18]. Come per altre glomerulopatie causa di sindrome nefrosica, l'entità della proteinuria risulta direttamente correlata alla prognosi [3-5]. La terapia immunosoppressiva si è dimostrata in grado di poter indurre in una buona percentuale di pazienti la completa o parziale remissione della proteinuria (53.1% dei casi al termine del trattamento) e di poter migliorare significativamente la sopravvivenza renale [6,7]. Ciononostante la risposta terapeutica non è costante. Una quota di pazienti non risponde al trattamento, altri recidivano ed alcuni infine sviluppano insufficienza renale (25-35% dei casi in 10 anni). Quest'eterogeneità nei risultati terapeutici rispecchia una sottostante eterogeneità eziologica. Per tale motivo sono necessari strumenti che possano definire queste diversità e guidare la scelta terapeutica.
Negli ultimi anni si è osservato un crescente interesse nella esplorazione del proteoma umano. Col termine proteomica si intende l'insieme di tecnologie dirette all'analisi sistematica delle proteine in grado di rivelarne identità, quantità e funzione [20]. Differisce essenzialmente dalle tecniche biochimiche classiche di analisi delle proteine per l'approccio estensivo che tende ad analizzare in parallelo tutta l'espressione proteica del sistema biologico e non a caratterizzare una proteina per volta. Le tecniche di proteomica costituiscono una emanazione ed un superamento delle tecnologie genomiche. L'analisi del DNA e di espressione dell'RNA affrontate con le tecnologie ‘microarray' soffrono della incapacità di predire correttamente il comportamento delle unità funzionali biologiche finali, ovvero le proteine. Se si è interessati allo studio fisiologico o patofisiologico di un sistema biologico è più razionale valutare le proteine che costituiscono i mediatori principali della funzione biologica. Al contrario l'analisi della trascrizione messageriale presenta dei limiti, tale inadeguatezza è insita in fenomeni di controllo e modificazioni che si realizzano dalla trascrizione alla traduzione proteica, dalle influenze epigenetiche e dalle numerose modificazioni post-traduzionali quali glicosilazioni, fosforilazioni etc. In questo senso l'analisi proteomica, indagando direttamente gli effettori ultimi della attività biologica è un approccio analitico preferibile a quello del trascrittoma [21,22].
La possibilità tecnica di identificare e quantificare le proteine espresse anche in quantità non abbondanti è uno strumento promettente per lo studio della patofisiologia renale e per l'individuazione di marcatori biologici. L'urina è il liquido biologico più accessibile e facilmente analizzabile dell'organismo. Per ovvi motivi è il liquido biologico maggiormente informativo dei processi fisiologici e patologici del rene. Molte patologie renali ed in particolare le patologie glomerulari modificano pesantemente le caratteristiche di barriera molecolare (‘sieving effect') proprie del glomerulo. L'analisi delle alterazioni del contenuto proteico dell'urina può fornire specifiche indicazioni sulle cause glomerulari di tali alterazioni. Sono disponibili tecnologie in grado di generare mappe delle proteine urinarie, tali tecnologie si basano essenzialmente sulle metodiche di elettroforesi proteica bidimensionale e di cromatografia liquida. Questi strumenti analitici sono stati recentemente accoppiati alle tecnologie di spettrometria di massa che permettono una estensiva identificazione delle proteine urinarie con elevata sensibilità. Utilizzando queste strategie è possibile la comparazione della espressione delle proteine urinarie presenti tra gruppi diversi di soggetti ed è possibile individuare caratteristiche distintive. Nello specifico è possibile raccogliere i dati provenienti tra gruppi di soggetti sani e confrontarli con gruppi di pazienti con specifici stati patologici, o ancora confrontare gruppi di pazienti distinti sulla base della risposta alla terapia, etc. Esperimenti condotti su urina normale di soggetti maschi utilizzando una tecnica di cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa hanno identificato 124 diversi prodotti genici [8,9]. Un diverso gruppo di ricercatori ha applicato due tecniche di isolamento delle proteine urinarie (precipitazione e ultracentrifugazione) in soggetti normali ed analizzato l'estratto proteico per mezzo di elettroforesi bidimensionale (2D-PAGE) e analisi spettrometrica di massa attraverso'matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight' (MALDI-TOF). L'analisi ha individuato 47 prodotti proteici presenti nelle urine dei soggetti esaminati [10].
Possiamo ipotizzare che in condizioni patologiche come la GNM il pull di prodotti proteici identificabili nelle urine si modifichi in modo significativo e in particolare si arricchisca di elementi che possono essere riconosciuti come specifici della patologia sottostante e che possano agire come marker biologico in senso prognostico. Nello stesso senso è possibile che sotto la comune definizione di GNMi si raccolgano realtà eterogenee. Possiamo ipotizzare che tale eterogeneità eziologica può manifestarsi in una diversa espressione di marcatori urinari, il riconoscimento differenziale di questi marcatori può avere un significato predittivo in termine di risposta alla terapia immunosoppressiva.
Un lavoro preliminare basato sull'analisi proteomica urinaria di 8 pazienti affetti da GNM messi a confronto con 8 soggetti sani è stato recentemente pubblicato [12]. In questo studio vengono identificati 200 possibili marcatori specifici per GNM. Questa analisi preliminare conferma la potenziale efficacia delle metodiche proteomiche nell'identificare marcatori peptidici nelle urine. Un altro recente esempio di applicazione nefrologica delle metodiche proteomiche riguarda la ricerca di marcatori urinari presenti nel rigetto acuto di trapianto renale [13]. Questo studio confronta i profili proteomici urinari di pazienti con diagnosi bioptica di rigetto renale acuto con altre condizioni patologiche renali quali controlli normali, trapianti stabili, necrosi tubulare acuta, recidiva di glomerulopatie, ed infezione urinaria. Gli autori identificano un pattern specifico del rigetto acuto fortemente correlato anche temporalmente all'andamento clinico-patologico ed alla risposta terapeutica. Questi marcatori sono un promettente marcatore non invasivo per la definizione diagnostica di rigetto acuto. <<<