RICERCA ITALIANA     

Lo sviluppo, il significato fisiopatologico e l'evoluzione dell'ipertrofia in cardiomiopatia ipertrofica. Aspetti sperimentali e clinici.

Università degli Studi di Napoli "Federico II"

Abstract

L'eziologia della cardiomiopatia ipertrofica è nota da alcuni anni: è malattia a trasmissione dominante con penetranza incompleta dovuta a mutazioni di geni codificanti per proteine del sarcomero. L'estrema eterogeneità dei quadri morfologici e clinici, anche in presenza della stessa mutazione, indica che il fenotipo è determinato dall'interazione del genotipo con fattori ambientali, altri geni modificatori, espressione di fattori di crescita od altro; in altri termini, la patogenesi della malattia è ignota. Un'ipotesi patogenetica è che la mutazione delle proteine sarcomeriche induce un deficit contrattile a livello subcellulare, che a sua volta stimola il rilascio di fattori di crescita che determinano le alterazioni patologiche della malattia (ipertrofia dei cardiomiociti, malallineamento delle fibrocellule [disarray], fibrosi interstiziale, ipertrofia della media delle arteriole coronariche etc.), con un meccanismo analogo a quello che si attiva nell'ipertrofia secondaria a sovraccarico di pressione. Analogamente all'ipertrofia secondaria, una quota di pazienti con cardiomiopatia ipertrofica presenta un'evoluzione verso la forma dilatativa con disfunzione sistolica; i meccanismi alla base di tale transizione non sono stati finora identificati. Questo programma di ricerca intende analizzare i seguenti aspetti:

1. Lo sviluppo dell'ipertrofia.
Questa tematica sarà affrontata in tre modelli. Il primo è quello della patologia umana, in cui fattori di crescita e marcatori di scompenso/ipertrofia saranno analizzati in modo "cross sectional" in un'ampia popolazione di pazienti con cardiomiopatia ipertrofica di varie fasce d'età, e se ne valuterà il potenziale impatto su parametri clinici, sull'entità dell'ipertrofia valutata con Magnetic Resonance Imaging [MRI] ed ecocardiografia, e sullo sviluppo di fibrosi interstiziale. Il secondo si basa sullo studio di frammenti di tessuto da pazienti con cardiomiopatia ipertrofica o ipertrofia secondaria e si prefigge di valutare le eventuali differenze tra ipertrofia primaria e secondaria sull'espressione e la distribuzione di proteine contrattili e di canali ionici, in rapporto anche alla presenza di fibrosi interstiziale. Il terzo è un modello murino transgenico che sovraesprime l'ornitina decarbossilasi (ODC) a livello cardiaco e sviluppa ipertrofia miocardica. Si valuterà l'effetto di fattori di crescita sulle proprietà dei cardiomiociti isolati, ed in vivo si analizzeranno i fattori di crescita sia circolanti che tessutali in diversi periodi della vita degli animali (prima dello sviluppo dell'ipertrofia, nella sua fase iniziale e con ipertrofia conclamata).

2. La transizione verso la forma dilatativa, caratterizzata da deficit inotropo.
Questo aspetto sarà analizzato valutando l'interazione genotipo-fenotipo in pazienti in fase dilatativa: con istologia su cuori espiantati o autopsie, con MRI, con Integrated Back Scatter e con lo studio del metabolismo del collagene.

3. L'influenza dell'ipertrofia per se o delle mutazioni causali, della fibrosi interstiziale e dei geni modificatori sull'aritmogenesi.
Su tessuto di pazienti con cardiomiopatia ipertrofica o forme di ipertrofia secondaria si valuterà il profilo di espressione di canali ionici. Le proprietà elettrofisiologiche di cardiomiociti isolati normali ed ipertrofici saranno studiate dopo trasfezione con vettori di cDNA recanti mutazioni di proteine contrattili o di canali ionici.

Per questi scopi le Unità useranno un approccio integrato che tiene conto delle differenti competenze (di cardiologia clinica, di patologia generale, di anatomia patologica, di diagnostica per immagini e di biochimica). <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Sandro BETOCCHI Università degli Studi di NAPOLI "Federico II"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Questo progetto rappresenta la prosecuzione di un progetto PRIN COFIN 2002 che si articolava in due obiettivi principali: 1) identificazione dei meccanismi alla base dei fattori di rischio per morte improvvisa in cardiomiopatia ipertrofica: a livello cellulare (canali ionici di membrana), tissutale (fibrosi interstiziale e disarray) e dell'interazione genotipo-fenotipo; 2) studio della patogenesi dello scompenso cardiaco in cardiomiopatia ipertrofica, sia sistolico che diastolico, e degli effetti di farmaci interferenti con il sistema Renina-Angiotensina-Aldosterone sulla fibrosi interstiziale e sulla disfunzione diastolica. Il progetto, dopo poco più d'un anno, ha raggiunto interessanti risultati, che si sono concretizzati in un elevato numero di pubblicazioni su prestigiose riviste (Impact Factor totale 114.123) (1-8) e 4 capitoli d'un libro. Gli interessanti risultati preliminari ottenuti nel primo anno del programma ci hanno stimolato a proseguire nelle ricerca iniziata, ridefinendone gli obbiettivi sulla scorta delle osservazioni riportate in 2.2.
Questo progetto di ricerca si propone di studiare la genesi ed i determinanti dell'ipertrofia in cardiomiopatia ipertrofica e il loro impatto sul fenotipo. In particolare, le Unità studieranno:

1. Lo sviluppo dell'ipertrofia.
Questa tematica sarà affrontata in tre modelli. Per il primo, quello della patologia spontanea umana, i fattori di crescita e marcatori di scompenso/ipertrofia (come il Brain Natriuretic Peptide [BNP]) saranno analizzati in modo "cross sectional" in un'ampia popolazione di pazienti con cardiomiopatia ipertrofica di varie fasce d'età, e se ne valuterà il potenziale impatto su parametri clinici, sull'entità dell'ipertrofia e sullo sviluppo di fibrosi interstiziale. Il secondo modello è ex vivo e si basa sullo studio di frammenti di tessuto da pazienti con cardiomiopatia ipertrofica o ipertrofia secondaria, ottenuto mediante biopsia o nel corso di interventi cardiochirurgici; questo aspetto dello studio si prefigge di valutare le eventuali differenze tra ipertrofia primaria e secondaria sull'espressione e la distribuzione di proteine contrattili e i canali ionici, in rapporto anche alla presenza di fibrosi interstiziale.Per il terzo modello, si userà un transgenico murino che sovraesprime l'ornitina decarbossilasi (ODC) a livello cardiaco, sotto il controllo del promotore della catena pesante dell'-miosina. I cuori di questi topi transgenici presentano elevati livelli cellulari/tissutali di poliamine contestualmente a ipertrofia caratterizzata da aumento nello spessore della parete ventricolare posteriore sinistra e del setto interventricolare valutati ecocardiograficamente, e dall'incremento del rapporto peso cardiaco-peso corporeo e dell'area di sezione dei cardiomiociti. Non si tratta, evidentemente, di un modello di cardiomiopatia ipertrofica in senso stretto, tuttavia ODC è ritenuta un anello necessario nella catena di eventi che modulano il fenotipo ipertrofico piuttosto che un semplice marcatore di ipertrofia e lo studio della modulazione delle vie di segnale intracellulare mediate da stimoli pro- e/o anti- ipertrofizzanti in questo modello è uno strumento per aggiungere dettagli alla conoscenza del fenotipo ipertrofico per se (9-11). Questo modello verrà studiato a due livelli: quello cellulare, analizzando l'effetto di fattori di crescita (vedi in 2.2 e 2.4) sulle proprietà dei cardiomiociti isolati, e quello in vivo, analizzando i fattori di crescita sia circolanti che tessutali in diversi periodi della vita degli animali (prima dello sviluppo dell'ipertrofia, nella sua fase iniziale e con ipertrofia conclamata). Il secondo modello adoperato sarà

2. La transizione verso la forma dilatativa, caratterizzata da deficit inotropo.
Questo aspetto, che era già stato affrontato nel precedente progetto, sarà analizzato valutando l'interazione genotipo-fenotipo in pazienti con marcatori di evoluzione verso la ipocontrattilità, e studiando le caratteristiche di pazienti già in fase dilatativa: in particolare la presenza di fibrosi interstiziale sarà valutata con istologia su cuori espiantati o autopsie, con Imaging di Risonanza Magnetica [MRI], con Integrated Back Scatter [IBS] e con lo studio del metabolismo del collagene; verranno inoltre analizzate le anomalie del flusso coronarico e le modifiche dei livelli di fattori di crescita.

3. L'influenza dell'ipertrofia per se o delle mutazioni causali, della fibrosi interstiziale e dei geni modificatori sull'aritmogenesi.
Verrà studiato il genotipo di famiglie in cui è alta l'incidenza di morte improvvisa. Su tessuto di pazienti con cardiomiopatia ipertrofica o forme di ipertrofia secondaria si valuterà il profilo di espressione di canali ionici noti per essere implicati in morte improvvisa. Su cardiomiociti isolati normali ed ipertrofici, infine, si studieranno le proprietà elettrofisiologiche dopo trasfezione con vettori di cDNA di note mutazioni di proteine contrattili o di canali ionici. Sempre su cardiomiociti isolati, infine, si valuterà l'influenza di stimolazione adrenergica e con fattori di crescita sulle proprietà elettrofisiologiche.

Per questi scopi le Unità useranno un approccio integrato che tiene conto delle differenti competenze (di cardiologia clinica, di patologia generale, di anatomia patologica, di diagnostica per immagini e di biochimica). La necessità di analizzare gli obbiettivi su esposti nel modello transgenico di ipertrofia da accumulo di poliammine (sovraespressione di ODC) ci ha indotto a cercare le specifiche competenze in un'Unità (la 2) che non era parte del precedente progetto. <<<

Risultati parziali attesi

1. Lo sviluppo dell'ipertrofia.
Ci si aspetta di ottenere informazioni sul ruolo dei fattori di crescita su cellule isolate, nell'animale da esperimento e nell'uomo. Su miocardiociti isolati, provenienti da pazienti con cardiomiopatia ipertrofica ed ipertrofia secondaria, o dal topo transgenico sovraesprimente ODC, ci si attende di conoscere il signaling intracellulare che conduce al fenotipo ipertrofico e l'influenza dell'ipertrofia sulle proprietà elettriche di membrana e sulla proteomica. Nell'animale da esperimento ci si attende di conoscere la relazione tra età, espressione di fattori di crescita ed ipertrofia, e l'interazione tra fattori di crescita e fibrosi interstiziale. Nell'uomo è verosimile che i livelli circolanti di IGF-1 e TGF-1 in cardiomiopatia ipertrofica dipendano dall'età (anche nei soggetti di controllo) e correlino con la massa ventricolare sinistra. Inoltre, ci si attende che i fattori di crescita studiati correlino con l'entità della fibrosi interstiziale.

2. La transizione verso la forma dilatativa, caratterizzata da deficit inotropo.
Non è prevedibile se esista uno o più genotipi che si associano allo scompenso cardiaco. È verosimile che, in analogia con lo scompenso cardiaco da altra eziologia, anche in cardiomiopatia ipertrofica l'evoluzione verso la forma dilatativa si associ ad attivazione della matrice extracellulare, per cui ci si attende un aumento della fibrosi interstiziale sia dallo studio con MRI con l'uso di un mezzo di contrasto (gadolinio) che dallo studio del metabolismo del collagene, che dallo studio anatomo-patologico. Verrà studiata la riserva coronarica in pazienti con cardiomiopatia ipertrofica e evoluzione verso la forma dilatativa: mentre è molto probabile che essa sia ridotta rispetto a soggetti di controllo, non è facile prevedere se la riduzione di riserva coronarica (che si osserva in pazienti con cardiomiopatia ipertrofica anche con funzione sistolica normale) sia un determinante dell'evoluzione verso la forma end-stage.

3. L'influenza dell'ipertrofia per se o delle mutazioni causali, della fibrosi interstiziale e dei geni modificatori sull'aritmogenesi.
Mentre sono state descritte mutazioni che danno cardiomiopatia ipertrofica associata ad alto rischio di morte improvvisa, i meccanismi elettrofisiologici alla base dell'aumentato rischio aritmico non sono noti. La relazione tra le mutazioni causali della cardiomiopatia ipertrofica e le proprietà elettrofisiologiche di membrana è verosimile, alla luce dell'effetto tampone delle proteine sarcomeriche sul calcio citosolico; è analogamente possibile una simile alterazione nel modello di ipertrofia da accumulo di poliammine. La possibilità di mutazioni di canali ionici (come HERG) associate in alcuni pazienti alle mutazioni causali della cardiomiopatia ipertrofia non è evidentemente prevedibile. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La cardiomiopatia ipertrofica è un'affezione del miocardio dovuta a mutazioni delle proteine sarcomeriche (contrattili, strutturali e regolatrici) (12). Mentre l'eziologia della malattia è quasi completamente elucidata, la patogenesi è in gran parte oscura e si poggia prevalentemente su ipotesi attraenti ma non dimostrate. Esperimenti su animali transgenici hanno dimostrato che l'espressione di proteine contrattili con mutazioni riscontrate in pazienti con cardiomiopatia ipertrofica è sufficiente a riprodurre quadri di ipertrofia miocardica analoghi a quelli della malattia, ma non ne spiega l'eterogeneità dei quadri morfologici e clinici, che è sua caratteristica. È necessario quindi pensare che l'interazione della mutazione causale con l'ambiente e/o con altri geni modificatori, determini l'espressione fenotipica: l'ipertrofia, infatti, è in generale espressione della capacità del cardiomiocita di adattarsi ad una aumentata richiesta funzionale o ad una ridotta capacità contrattile. L'incorporazione della proteina mutata nel sarcomero interferisce, per alcuni geni (-miosina, troponina T) con il meccanismo della contrazione e provoca una riduzione dell'inotropismo a livello sub-cellulare (13-14), per cui si è ipotizzato che l'ipocontrattilità del sarcomero induca ipertrofia attraverso iperproduzione compensatoria di fattori trofici, con un processo comune a quello che avviene, a livello d'organo, per il sovraccarico di pressione (15). A supporto di questa ipotesi è stato dimostrato che in cardiomiopatia ipertrofica si verifica iperproduzione di alcuni indicatori espressi anche nell'ipertrofia secondaria (-actina, isoforme della catena leggera della miosina e brain natriuretic peptide [BNP], Transforming Growth Factor 1 [TGF-1] e Insulin-like Growth Factor 1 [IGF-1]) (16-19).
Un'altra caratteristica della cardiomiopatia ipertrofica è la distrettualità dell'ipertrofia: essa non è spiegabile se non invocando elementi ambientali che contribuiscano a realizzarne il fenotipo. Li e coll. (20) hanno dimostrato che l'espressione e la produzione di TGF-1 e di IGF-1 sono aumentate di circa 2.5 volte nelle zone di miocardio ipertrofico rispetto a quelle non ipertrofiche, e la loro diversa espressione regionale probabilmente determina la disomogenea distribuzione dell'ipertrofia. La maggiore produzione di fattori di crescita in alcune zone della parete ventricolare rispetto ad altre potrebbe derivare da una disomogenea alterazione della contrattilità.
Queste osservazioni suggeriscono che la cardiomiopatia ipertrofica e l'ipertrofia miocardica secondaria abbiano in comune, se non i determinanti, una comune patogenesi: dunque l'ipertrofia secondaria può rappresentare un modello per aiutare a comprendere la cardiomiopatia ipertrofica.
Caratteristiche della cellula ipertrofica sono la riprogrammazione dell'espressione genica e l'attivazione della sintesi proteica. È stato dimostrato che le poliammine naturali, sintetizzate da parte dell'ODC, hanno un ruolo in entrambi questi processi (21). Infatti, numerosi studi su animali hanno dimostrato che la sintesi di poliammine è aumentata in seguito a stimoli di vario genere: stenosi dell'aorta ascendente, esercizio fisico, o trattamento con isoproterenolo. La creazione di un modello di topo transgenico sovraesprimente l'ODC a livello cardiaco ha permesso di studiare più estesamente il ruolo delle poliammine nella catena di eventi che modulano il fenotipo ipertrofico (9). Il meccanismo attraverso il quale le poliammine inducono ipertrofia non è noto; l'accumulo di poliammine, però, potrebbe essere il punto comune di convergenza di una varietà di stimoli, tra i quali anche il deficit inotropo a livello subcellulare, che esitano nello sviluppo dell'ipertrofia.
Numerosi sono i problemi clinici irrisolti in cardiomiopatia ipertrofica. Il più rilevante, se non dal punto di vista epidemiologico, certamente da quello "emozionale", è la morte improvvisa ed il meccanismo dell'aritmogenesi. In effetti, nei pazienti con cardiomiopatia ipertrofica esistono, sia a livello cellulare che tissutale, diversi potenziali fattori di instabilità elettrica, che rappresentano importanti substrati aritmici. A livello tissutale, l'instabilità elettrica è comunemente attribuite alla alterazione delle vie di propagazione dell'impulso elettrico da parte di processi di fibrosi o da un disordinato arrangiamento delle fibre miocardiche. Su questi substrati permanenti, l'ischemia miocardica acuta può provocare cambiamenti sia della funzione cellulare sia nel substrato di propagazione, generando un ulteriore e transiente "meccanismo aritmogeno" (4, 12). L'altro importante determinante di morte in cardiomiopatia ipertrofica, quantitativamente paragonabile alla morte improvvisa, è l'evoluzione verso la forma dilatativa, cosiddetta "end-stage". Non ancora ben chiare sono le cause per cui la malattia può evolvere o verso l' "end-stage" con compromissione della funzione sistolica (22), oppure verso una forma restrittiva con marcata dilatazione dell'atrio sinistro in assenza di fibrillazione atriale e con ipertrofia lieve- moderata. <<<