RICERCA ITALIANA     

Morbo di Crohn: analisi genetico molecolare di varianti geniche di suscettibilità e correlazione genotipo/fenotipo con riguardo all'espressione della fibrosi e ai processi di fibrogenesi della malattia

Università degli Studi di Milano

Abstract

La malattia di Crohn è una patologia infiammatoria cronica intestinale ad eziopatogenesi complessa sostenuta da fattori ambientali, immunitaria e genetici. Tra alterazioni genetiche rilevate quella relativa al gene NOD2/CARD15, conferisce suscettibilità ad ammalare di Crohn sembra predispone allo sviluppo di malattia ileale e di complicanza stenotica.
Gli eventi patogenetici che portano alla formazione di stenosi nel morbo di Crohn sono ancora sconosciuti e non è escluso che altri geni siano responsabili di tale complicanza.
Partendo da quanto è già noto in letteratura, il presente progetto confermerà la associazione tra le note mutazioni genetiche della malattia e le caratteristiche fenotipiche e valuterà l'eventuale esistenza di altri polimorfismi genetici associati al morbo di Crohn. In tal caso saranno definite le loro relazioni con specifiche caratteristiche fenotipiche della malattia ed in particolare con la presenza di stenosi.
Lo studio valuterà inoltre le caratteristiche istomorfologiche ed i meccanismi di fibrogenesi che predispongono all'abnorme ispessimento della parete intestinale e alla formazione di stenosi nel morbo di Crohn e la loro relazione con i polimorfismi già noti e con quelli che eventualmente dovessero emergere nel corso delle fasi dello studio.
I risultati di questo studio potranno contribuire a definire il ruolo delle mutazioni geniche nello sviluppo della malattia di Crohn fibrostenosante ed indirizzare verso il trattamento precoce e la prevenzione di tale complicanza. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Gabriele BIANCHI PORRO Università degli Studi di MILANO

Obiettivo del Programma di Ricerca

Valutare la prevalenza delle varianti alleliche dei geni NOD2/CARD15, MDR1 e MUC3 nella popolazione CD e confrontarla con quella di popolazioni controllo rappresentate da pazienti affetti da colite ulcerosa e soggetti sani.
Effettuare un'analisi di polimorfismi (SNPs) dei geni che codificano alcuni mediatori dell'infiammazione e molecole di adesione coinvolte nel processo infiammatorio del morbo di Crohn.
Stabilire la presenza di linkage tra i loci di suscettibilità alle IBD nelle famiglie CD al fine di identificare nuovi possibili geni candidati, con particolare riguardo alla forma stenosante.

Verificare eventuali correlazioni fra le varianti alleliche dei geni IBD e i pattern di espressione del cluster di geni che codificano per mediatori dell'infiammazione con le varianti fenotipiche della malattia di Crohn.
In particolare, saranno valutate eventuali associazioni tra le varianti alleliche dei geni NOD2/CARD15, MDR1 e MUC3 e caratteristiche istologiche specifiche come il grado di fibrosi della parete intestinale e l'iperproliferazione della muscolare della sottomucosa a livello delle stenosi, in una serie di pazienti affetti da malattia di Crohn sottoposti ad intervento chirurgico.

Valutare i meccanismi di fibrogenesi che predispongono all'abnorme ispessimento della parete intestinale e alla formazione di stenosi nel morbo di Crohn, al fine di verificare se mutazioni o polimorfismi genetici associati a tale malattia predispongano ad una abnorme regolazione della fibrogenesi intestinale. <<<

Risultati parziali attesi

Conferma della elevata prevalenza delle varianti alleliche dei geni NOD2/CARD15 nella popolazione CD in relazione a quella delle popolazioni controllo e dei pazienti affetti da colite ulcerosa.
Esistenza di loci di suscettibilità alle IBD nelle famiglie CD ed identificazione di nuovi possibili geni candidati nei pazienti con CD fibrotenosante.
L'analisi di polimorfismi (SNPs) dei geni che codificano alcuni dei mediatori dell'infiammazione e delle molecole di adesione coinvolte nel processo infiammatorio è in grado di definire un pattern specifico di suscettibilità per lo sviluppo della malattia di Crohn.Esistenza di correlazione genotipo/fenotipo relative a varianti alleliche dei geni NOD2/CARD15, MDR1 e MUC3 o con cluster di geni che codificano per i mediatori dell'infiammazione
Specifica correlazione tra varianti geniche del gene NOD2/CARD15 e presenza di stenosi nel CD.
Identificazione di caratteristiche istomorfologiche e immunofenotipiche delle stenosi e varianti del genotipo NOD2/CARD15.Identificazione di specifici meccanismi biomolecolari di fibrogenesi che predispongono all'abnorme ispessimento della parete intestinale e alla formazione di stenosi nel morbo di Crohn, nei pazienti che presentano mutazioni o polimorfismi genetici associati a tale complicanza. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La patogenesi di CD è dovuta all'interazione di fattori genetici di suscettibilità, aggravanti ambientali e elementi di risposta immunitaria all'infiammazione (Shanahan et al 2002). L'implicazione dei fattori genetici nella patogenesi della malattia di Crohn è stata dimostrata tramite studi di concordanza sui gemelli mono e dizigotici. I risultati ottenuti da queste ricerche sono state in seguito validate dagli studi di aggregazione famigliare (Satsangi et al, 1996).
Nell'ultimo decennio un numero consistente di analisi genome-wide hanno permesso di determinare i possibili loci cromosomici di suscettibilità alle IBDs. Queste ricerche hanno in seguito ricevuto un consenso da parte del Consorzio Internazionale sulla Genetica delle IBDs, confermando la presenza di due loci di suscettibilità sul cromosoma 16q12 (IBD1) e sul cromosoma 12q13 (IBD2) (The IBD International Genetics Consortium., 2001). Successive analisi hanno permesso di identificare altri loci di suscettibilità a livello dei cromosomi 6p21 (IBD3), 14q, 19p, 5p, 1p, 3q, 4q e 7p (Satsangi et al., 1996, Cho et al., 1998, Taylor et al., 2001). Queste dati suggeriscono la possibile implicazione di un consistente numero di geni nella patogenesi delle malattie infiammatorie intestinali e in particolare nella malattia di CD. Nel 2001, è stato identificato che il gene di suscettibilità a livello del locus IBD1, è il gene NOD2/CARD15 (MIM *605956) (Hugot et al 2001; Ogura et al 2001). NOD2/CARD15 fa parte della famiglia dei geni NOD1/Apaf1 coinvolta nella regolazione del meccanismo apoptotico. NOD2/CARD15 è espresso nei monociti dove svolge la funzione di recettore citosolico per i lipopolisaccaridi batterici. Il prodotto di questo gene è una proteina composta da due domini di reclutamento per le caspasi a livello dell'estremità NH2-terminale, da un dominio di legame nucleotidico centrale e da regioni ripetute ricche in leucina in posizione COOH-terminale (Ogura et al, 2001). L'interazione tra i lipopolisaccaridi batterici e queste regioni ricche in leucina induce l'attivazione del fattore nucleare kB (NF-kB) (Inohara et al, 2003). Tre varianti alleliche del gene NOD2/CARD15 (Arg702Trp, Gly908Arg e 1007fsinsC) sono state trovate con una frequenza più elevata nei pazienti affetti da CD (Hugot et al, 2002). Questo ha permesso di inaugurare un nuovo capitolo nella ricerca dell'eziopatogenesi di CD.
Recentemente, sono stati identificati altri possibili geni di suscettibilità per le IBDs: il gene MDR1 (MIM *171050) e i geni MUC3A, MUC3B (MIM *158371 e MIM *605633) il cui ruolo nella patogenesi della malattia infiammatoria intestinale e le correlazioni genotipo-fenotipo sono a tutt'oggi sconosciute (Schwab et al., 2003, Kennoki et al., 2001). Il gene MDR1 (multidrug resistance 1 o ATP-binding cassette subfamily B member 1, ABCB1) e i geni MUC3 (mucin 3) sono localizzati rispettivamente nelle regioni cromosomiche 7q21.1 e 7q22. Il prodotto del gene MDR1 è la proteina Pgp (P-glycoprotein) localizzata sulla membrana apicale delle cellule epiteliali dell'intestino (Cardon-Cardo et al.,1990). Alterazioni dell'espressione e dell'attività di questo gene possono indurre un alterato assorbimento intestinale (Kim et al., 2001). Il ruolo di MDR1 nell'assorbimento e nella protezione dell'organismo da xenobiotici, batteri e tossine è stato analizzato utilizzando un modello sperimentale di topo IBD, immunologicamente normale ma privo del prodotto del gene mdr1a (ortologo murino del gene MDR1) (Panwala et al., 1998; Maggio-Price et al., 2002). I risultati ottenuti dal modello murino suggeriscono che i polimorfismi funzionali del gene MDR1, risultanti in una variazione dell'attività della Pgp, potrebbero aumentare la suscettibilità alle IBDs (Panwala et al., 1998). Per quanto riguarda i geni MUC3, essi codificano per proteine della matrice extracellulare, appartenenti alla famiglia delle mucine. Le mucine sono glicoproteine che intervengono nella protezione dell'epitelio, nell'adesione e nella crescita delle cellule epiteliali, nella trasduzione del segnale e nella modulazione del sistema immunitario (Agrawal et al 1998, Carraway et al., 1999). La presenza di polimorfismi di un singolo nucleotide (SNPs) nelle sequenze esoniche dei geni MUC3A e MUC3B sono state identificate e analizzate per la loro possibile associazione con le IBDs. Tali ricerche hanno suggerito che gli SNPs non sinonimi nel gene MUC3A all'origine di una possibile alterazione della trasduzione del segnale, potrebbero essere implicati nelle differenze interindividuali di suscettibilità al CD.
Attualmente, gli unici dati di correlazione genotipo-fenotipo, disponibili in letteratura, riguardano le varianti alleliche del gene NOD2/CARD15. Questi studi hanno dimostrato che mutazioni del gene NOD2/CARD15 sono strettamente associate alla localizzazione ileale del morbo di Crohn e alla presenza di complicanza stenotica.
Nonostante le stenosi intestinali rappresentino una frequente complicanza del morbo di Crohn ed una indicazione all'intervento chirurgico in circa il 50% dei pazienti (Legnani PE et al, 2002), i meccanismi biomolecolari coinvolti nella genesi della fibrosi della parete intestinale non sono stati ancora del tutto chiariti. L'esposizione delle cellule mesenchimali della sottomucosa a citochine proinfiammatorie in associazione con il danno tissutale e l'intervento di numerosi fattori di crescita rappresentano probabilmente i principali fattori che portano alla fibrosi transmurale nel morbo di Crohn (Borley NR et al.2000). Si ritiene che la iperproduzione di citochine di tipo Th1, in particolare IL-2, TNF-alfa ed IL-6, unitamente al costimolo da parte del basic fibroblast growth factor (bFGF) rilasciato dalle cellule endoteliali, agiscono sulle cellule stromali inducendo l'attivazione e la proliferazione fibroblastica che sbilanciano l'omeostasi tra deposizione e degradazione della matrice extracellulare finalizzata alla fisiologica riparazione epiteliale, amplificando attraverso i fattori trofici, quali il transforming growth factor-beta (TGF-beta) e l'insulin-like growth factor-I (IGF-I), la via che conduce alla fibrosi (Pucilowska JB et al. 2000). L'attivazione delle normali cellule mesenchimali in cellule dotate di un fenotipo fibrogenico si traduce in un'aumentata capacità di sintetizzare numerose proteine della matrice extracellulare, come il collagene di tipo I, III, IV e V. Quest'ultimo è il tipo di collagene più rappresentato in corrispondenza delle stenosi intestinali e sembra essere, dunque, il fattore di maggiore rilevanza biologica nella patogenesi della fibrosi intestinale nel morbo di Crohn (Graham MF et al. 1995).
Due importanti fattori di crescita che intervengono nei meccanismi di fibrogenesi intestinale nel morbo di Crohn sono rappresentati dal bFGF e dal vascular endothelial growth factor (VEGF) (Kanazawa S et al. 2001). Il bFGF, una glicoproteina prodotta dalle cellule endoteliali e dalle mast cellule, è una molecola chiave nella induzione della proliferazione fibroblastica, nel promuovere la riparazione tissutale nell'infiammazione e nell'up-regolare la produzione di collagene. Il VFGF, una glicoproteina prodotta dalle cellule stromali, ha un ruolo fondamentale nell'assicurare la sopravvivenza delle cellule endoteliali, nell'indurre i fenomeni di angiogenesi e nell'aumentare la permeabilità vascolare (Beck PL et al. 1999). Entrambi questi fattori sono risultati aumentati in pazienti affetti da morbo di Crohn, ed in particolare i pazienti portatori di stenosi intestinali presentano i più alti livelli di bFGF (Di Sabatino A et al. In press).
Un ruolo fondamentale nella patogenesi della fibrosi intestinale nel morbo di Crohn è giocato dai miofibroblasti subepiteliali che sono presenti in gran numero in corrispondenza dei siti di fibrosi (Pucilowska JB et al. 2000). Essi, in risposta a fattori chemiotattici, stimoli proliferativi e citochine Th1, sono responsabili della sintesi dei componenti della matrice extracellulare il cui abnorme accumulo esita nel processo di ispessimento fibrotico della parete intestinale (Powell DW et al 1999).
Anche una ridotta attività delle metalloproteinasi della matrice (MMP) o una maggiore attività degli inibitori tissutali delle MMP (TIMP) possono sbilanciare l'omeostasi tra deposizione e degradazione della matrice extracellulare finalizzata alla fisiologica riparazione epiteliale (Schuppan D et al. 2000). Le MMP sono una famiglia di endopeptidasi zinco- e calcio-dipendenti la cui principale funzione è la degradazione di quasi tutti i componenti della matrice extracellulare (Nagase H et al. 1999). L'attività delle MMP è controllata dai loro naturali inibitori, i TIMP. Ambedue le molecole sono secrete da cellule stromali attivate da citochine, macrofagi e linfociti attivati. In condizioni fisiologiche, specifiche MMP (principalmente la MMP-2 e la MMP-14) sono responsabili della regolazione dell'omeostasi mucosale e dell'interazione cellula-matrice (Vu TH et al. 2000), mentre in condizioni patologiche altre MMP (soprattutto MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9 e MMP-12) determinano un profondo riarrangiamento della matrice extracellulare che esita nel danno mucosale (Pender SL et al. 1997). In particolare, la MMP-3 (stromelisina 1) la MMP-9 (gelatinasi B) sono state recentemente implicate nella patogenesi del danno mucosale nel morbo di Crohn come fattori in grado di favorire un abnorme turnover della matrice extracellulare (Baugh MD et al. 1999; Louis E et al. 2000).
L'individuazione di un'alterazione genica correlata allo sviluppo di tale complicanza non ha tuttavia, chiarito i meccanismi che la determinano. In particolare, il nesso biologico tra la predisposizione genetica (mutazione del gene NOD2/CARD15) e i diversi meccanismi sopra riportati che conducono allo sviluppo di stenosi non sono stati analizzato. In particolare non è chiaro se l'aumentata prevalenza di stenosi tra i pazienti con CD portatori della mutazione del gene NOD2/CARD15 sia da attribuire ad un'abnorme rappresentazione della fibrosi e ad alterazioni della matrice extracellulare o sia legato semplicemente al perpetuarsi di uno stimolo infiammatorio. <<<