RICERCA ITALIANA     

MECCANISMI MOLECOLARI DI CHEMIOPREVENZIONE E CHEMIORESISTENZA NELLA CARCINOGENESI GASTRICA CORRELATA ALL'INFEZIONE DA HELICOBACTER PYLORI

Università degli Studi di Napoli "Federico II"

Abstract

Il cancro gastrico (CG) per frequenza, mortalità e scarsa risposta alla terapia rappresenta una delle maggiori sfide in campo oncologico. Attualmente, la migliore strategia per ridurre la morbilità e la mortalità del CG è l'identificazione dei pazienti a rischio ed il superamento della intrinseca resistenza alla chemioterapia. Condizione indispensabile perché tale strategia sia valida è la conoscenza dei meccanismi eziopatogenetici e molecolari che regolano i processi di trasformazione cellulare e progressione del CG. Negli ultimi anni è divenuto sempre più evidente che l' Helicobacter pylori (Hp) è il più importante fattore eziologico del CG e che la ciclo-ossigenasi-2 (COX-2) è implicata nella carcinogenesi gastrica sia nelle fasi precoci di trasformazione e progressione tumorale che nelle fasi tardive di acquisizione della farmacoresistenza.
A livello gastrico l'Hp induce una complessa reazione infiammatoria ed immunitaria che, se persistente, danneggia il DNA. Una delle più importanti e precoci alterazioni molecolari è rappresentata dalla sovra-espressione della COX-2. La COX-2 è coinvolta nel processo carcinogenetico attraverso l'inibizione dell'apoptosi, la modulazione della risposta immune, la regolazione della trasduzione del segnale e la promozione della neoangiogenesi.
Numerosi studi sperimentali, epidemiologici e clinici condotti prevalentemente su pazienti con neoplasie colo-rettali suggeriscono che in sottogruppi selezionati di pazienti, i farmaci anti-infiammatori non-steroidei (FANS), ed in particolare gli inibitori selettivi della COX-2 (coxib), siano potenzialmente utilizzabili sia per la prevenzione che per la terapia.
Questo progetto è finalizzato ad identificare marcatori di predittività biologica nelle lesioni preneoplastiche e neoplastiche dello stomaco utili per individuare pazienti con gastrite cronica a rischio carcinogenetico e come indicatori di prognosi e risposta alla chemioterapia nei pazienti con cancro gastrico.
In particolare il progetto si articolerà attraverso varie fasi che prevedono:
1. caratterizzazione dei meccanismi molecolari attraverso i quali l'Hp ed i suoi fattori di virulenza provocano sovraespressione della COX-2;
2. valutazione dell'influenza di COX-2 sulla risposta immunitaria intrinseca della mucosa gastrica indotta dall'infezione da Hp;
3. identificazione delle vie molecolari regolate dalla COX-2 nell'epitelio gastrico in particolare attraverso lo studio dei pattern implicati nella trasformazione e nella acquisizione della farmacoresistenza;
4. valutazione degli effetti dei farmaci inibitori della ciclo-ossigenasi, selettivi per la COX-2 e non selettivi, sui bersagli molecolari precedentemente caratterizzati.
Queste fasi saranno realizzate mediante studi paralleli su sistemi in vitro (linee cellulari e colture d'organo), in vivo (campioni di mucosa gastrica di pazienti con gastrite cronica e CG) ed ex-vivo (campioni ematici di pazienti trattati con inibitori delle COX).
Integrando approcci epidemiologici, clinico-patologici, farmacologici, biochimici, genetici e proteomici intendiamo valutare il possibile ruolo della COX-2 e dei geni ad essa correlati nella carcinogenesi gastrica e l'uso potenziale degli inibitori delle COX nella chemioprevenzione e chemioterapia del CG. Inoltre si cercherà di identificare marcatori biochimici e molecolari per selezionare i pazienti "responder" al trattamento con gli inibitori delle COX. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Gerardo NARDONE Università degli Studi di NAPOLI "Federico II"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il progetto intende chiarire importanti questioni che riguardano il ruolo delle ciclo-ossigenasi (COX) nei meccanismi molecolari implicati nelle fasi precoci e nelle fasi tardive della carcinogenesi gastrica correlata all'infezione da Hp. In particolare, l'obiettivo principale sarà quello di definire le caratteristiche fenotipiche e genotipiche dei pazienti con gastrite cronica a rischio di evoluzione neoplastica e dei pazienti con CG in relazione alla prognosi ed alla risposta farmacologica.
Data la disponibilità di inibitori selettivi e non-selettivi delle COX lo studio sarà integrato da importanti valutazioni sperimentali di farmacodinamica e farmacocinetica in vivo ed ex vivo al fine di definire nuove strategie di chemioprevenzione e chemioterapia del CG.

A tal fine ci proponiamo di:


1. Identificare le vie di trasduzione del segnale attraverso cui Hp stimola l'aumentata espressione di COX-2 nonché i meccanismi attraverso cui COX-2 contribuisce alla patogenesi molecolare della gastrite e del CG;

2. Definire il ruolo di COX-2 nella risposta immunitaria conseguente ad infezione gastrica da Hp

3. Individuare i marcatori o i profili molecolari responsabili del viraggio del processo infiammatorio gastrico verso quello tumorale;

4. Individuare i marcatori o i profili molecolari espressivi dell'aggressività biologica del tumore gastrico: chemioresistenza e cattiva prognosi;

5. definire in pazienti con gastrite cronica e CG, la farmacocinetica e la farmacodinamica delle risposte al trattamento con inibitori delle COX selettivi (rofecoxib) e non selettivi (aspirina) in relazione alle caratteristiche genetiche costituzionali dei pazienti, al ceppo infettante di Hp ed alle alterazioni molecolari somatiche associate alla progressione neoplastica mediante studi in in vivo ed ex-vivo;

6. caratterizzare le basi biochimico-molecolari delle differenti risposte farmacologiche al trattamento con inibitori delle COX, attraverso lo sviluppo di modelli in vitro;

7. stabilire nuove strategie per la chemioprevenzione e chemioterapia del CG. <<<

Risultati parziali attesi

1. Chiarire le vie di traduzione del segnale attivate da Hp ed associate alla aumentata espressione di COX-2 in relazione ai vari fattori di virulenza coinvolti;
2. Identificare il ruolo specifico di COX-2 sulla polarizzazione della risposta immunitaria dell'ospite in relazione ai quadri patologici;
3. Testare in vitro gli effetti della farmacomodulazione di COX-2 sulla risposta immunitaria specifica della mucosa gastrica.I risultati di tale valutazione potranno contribuire a chiarire i meccanismi molecolari della chemioresistenza, definire marcatori predittivi di aggressività biologica ed individuare strategie di chemioprevenzione e chemioterapia della gastrite indotta da H. pylori. Inoltre, ci si attende di verificare correlazioni tra espressione di COX-2 e alterazioni molecolari nel cancro gastrico, come presupposto a studi volti a valutare il possibile impiego possibile dei COXIBs nella terapia del carcinoma gastrico (vedere fase 4).1. Definizione della variabilità farmacocinetica e farmacodinamica della risposta ad inibitori specifici e non specifici delle COX nella gastrite cronica e nel CG.
2. Correlazione tra variabilità farmacocinetica e farmacodinamica e fattori genetico costituzionali dei pazienti, caratteristiche genetiche del ceppo di Hp infettante ed alterazioni genetiche od epigenetiche nell'epitelio e/o nel tumore gastrico.1. Confermare a livello sperimentale l'ipotesi che variabili costituzionali e/o alterazioni molecolari a livello somatico siano implicate nella variabilità farmacodinamica al trattamento con inibitori delle COX nell'epitelio gastrointestinale.
2. Sviluppare criteri per selezionare pazienti che beneficeranno del trattamento con coxib e/o con basse-dosi di aspirina. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Nonostante si sia osservato un costante e progressivo declino negli ultimi 50 anni, il cancro gastrico (CG) continua ad essere una delle neoplasie più frequenti e letali (1). Dopo il cancro polmonare, il CG è la principale causa di morte per neoplasia al mondo (2). L'Agenzia Americana di sorveglianza del cancro riporta un'incidenza di circa 800.000 nuovi casi e più di 600.000 decessi nel 2000 con una sopravvivenza a 5 anni inferiore al 20% (3). In Italia, secondo i dati ISTAT, nel solo quadriennio 1995-98, sono deceduti per CG circa 50.000 soggetti (4). Il CG non risponde alla radio- ed alla chemioterapia, e la chirurgia, potenzialmente curativa, di fatto rappresenta un intervento palliativo poiché la diagnosi viene in genere formulata in una fase avanzata di malattia.
Attualmente, la migliore strategia per ridurre la morbilità e la mortalità del CG è l'identificazione dei pazienti a rischio ed il superamento della intrinseca resistenza alla chemioterapia. Condizione indispensabile perché tale strategia sia valida è la conoscenza dei meccanismi etiopatogenetici e molecolari che regolano i processi di trasformazione e progressione cellulare.
Negli ultimi anni è divenuto sempre più evidente che il più importante fattore eziologico del CG è l'infezione da Helicobacter pylori (Hp) e che la ciclo-ossigenasi-2 (COX-2), correlata anch'essa all'Hp, è implicata nella carcinogenesi rappresentando un importante target farmacologico per la chemioprevenzione (5,6)
La relazione tra infezione da Hp e CG è provata da numerose evidenze epidemiologiche, retrospettive e caso-controllo, nonché da modelli animali (7-11). Tuttavia, la più importante evidenza proviene da un recente studio prospettico condotto su una popolazione Giapponese, in cui 3% di 1250 soggetti Hp-positivi ha sviluppato il CG in un arco di tempo di 8 anni (12). Una recente meta-analisi ha evidenziato che soggetti infetti hanno un rischio relativo di CG di circa 2 volte maggiore rispetto ai soggetti non infetti ma tale rischio aumenta significativamente se la durata dell'infezione è superiore ai dieci anni (7, 13). In seguito all'infezione da Hp la maggioranza dei pazienti sviluppa una gastrite cronica, una minoranza la malattia peptica e solo una minima percentuale il CG (5). E' verosimile pertanto che le caratteristiche del batterio, la risposta immune e le interrelazioni tra ospite e parassita svolgano una funzione critica nel determinismo della malattia (14). L'Hp colonizza la mucosa gastrica inducendo una complessa reazione infiammatoria ed immunitaria caratterizzata dal richiamo di linfociti e neutrofili e dal rilascio di specie reattive dell'ossigeno (ROS) ed ossido nitrico (NO) (15,16). Sebbene questa risposta all'inizio rappresenti un meccanismo di difesa, una persistenza dell'infezione e del processo infiammatorio danneggia il DNA cellulare. Infatti, sia le ROS che NO sono in grado di indurre metilazione del DNA ed alterazioni molecolari caratterizzate dall'attivazione di oncogeni ed inattivazione di geni oncosoppressori (16-18).
Una delle più importanti e precoci alterazioni molecolari in corso di infezione da Hp è l'overespressione della ciclo-ossigenasi (COX)-2 (6). La COX è l'enzima che regola la trasformazione dell'acido arachidonico in prostanoidi (19). Finora sono state identificate due isoforme della COX: una forma costitutiva COX-1, espressa fisiologicamente nella maggior parte dei tessuti umani ed una forma inducibile, COX-2, implicata nei processi infiammatori e nel processo della tumorigenesi (20).
L'azione della COX-2 è in parte mediata dalla produzione di prostaglandine (PG) prodotte per effetto di specifiche prostaglandino-sintetasi. Le prostaglandine esercitano i loro effetti localmente, in modo sia autocrino che paracrino. Gli effetti della PGE2 sono mediati da una famiglia di recettori accoppiati alle proteine G, chiamati EP1, EP2, EP3, EP4 (22). Topi che presentano una mutazione a carico del gene APC e deficienti del gene del recettore EP2, hanno mostrato una riduzione del numero e della grandezza dei tumori intestinali in modo simile ai topi deficienti del gene della COX-2 (23, 24). Recenti risultati hanno suggerito anche per la COX-1 un ruolo nell'infiammazione e nella carcinogenesi. Topi min, deficienti del gene della COX-1, hanno mostrato una significativa riduzione della formazione dei tumori intestinali (25). Sembra che l'espressione di COX-1 nelle cellule stromali produca livelli basali di PGE2 necessari per sostenere la iniziale crescita del tumore, mentre la successiva induzione di COX-2 e di mPGES-1 sia necessaria per la biosintesi di PGE2 e per l'ulteriore crescita neoplastica (26). Due studi prospettici hanno riportato che l'aspirina somministrata a dosi consigliate nella terapia anti-aggregante (80-325 mg die) riduce l'incidenza di polipi colo-rettali in pazienti a rischio, rispetto al placebo (27, 28).
A livello gastrico la COX-2 è overespressa nei casi di CG, sia a livello delle aree tumorali che peritumorali, ma anche nei casi di gastrite cronica secondaria ad infezione da Hp (29, 30). L'aumentata espressione di COX-2 viene regolata direttamente dall'Hp ed è strettamente condizionata dalle catteristiche di virulenza del batterio (31). L'isola di patogenicità (PAI) cag è stata messa in relazione con le vie di traduzione del segnale dipendenti da JNK ed NFkb, principale attivatore del promotore del gene COX (32). Recentemente, è stato descritto che anche la gammaglutamiltranspeptidasi (GGT), altro fattore di virulenza del batterio, svolge un ruolo centrale nell'aumentata espressione di COX e dei fattori di crescita della famiglia dell Epidermal Growth Factor (33). I meccanismi attraverso i quali la COX-2 è implicata nella carcinogenesi comprendono: il blocco dell'apoptosi, l'induzione della proliferazione cellulare, la modulazione delle risposta immune, la regolazione della traduzione del segnale e la promozione della neoangiogenesi (34).
L'equilibrio tra proliferazione e morte cellulare rappresenta una tappa fondamentale della omeostasi cellulare. Infatti mentre una cronica stimolazione della apoptosi favorisce la perdita cellulare, l'inibizione di questo processo favorisce lo sviluppo e la progressione tumorale (35). La COX-2 blocca il processo apoptosico mediante diversi meccanismi: sottraendo acido arachidonico mediante l'attività cicloossigenasica, attivando la caspasi-3 e controllando l'espressione di geni implicati nel controllo dell'apoptosi (p53, p21, c-myc, bcl-2, bcl-xl e bax) (34).
Le prostaglandine, mediatori del danno tissutale COX-dipendente, sono implicate anche nell'attivazione del peroxisome proliferators activated receptors (PPAR) gamma (36,37). Il PPAR-gamma, appartiene ad una famiglia di recettori nucleari coinvolti nella regolazione della proliferazione e differenziazione cellulare e nella regolazione dei processi infiammatori (38). In cellule epiteliali l'attivazione del PPAR-gamma inibisce la cascata dei segnali intracellulari, tra i quali il NF-kB, che regolano il processo infiammatorio ed apoptotico (39). Pertanto, l'attivazione della via del PPAR gamma diminuisce la capacità dell'Hp di indurre l'apoptosi.
COX-2 ed i suoi metaboliti, sono inoltre implicati nella regolazione della risposta immune locale, cellulo-mediata e umorale, indotta dall'infezione da Hp modulando la secrezione di citochine ed immunoglobuline e la proliferazione ed attivazione di linfociti (40). In particolare, sia la COX-2 che la PGE2 inibiscono la produzione delle citochine Th1-derivate (IFN-gamma) in grado di controllare lo sviluppo di cancro (41-44).
Di recente, è stato evidenziato in vitro una diretta relazione tra l'espressione della COX-2 e quella della glicoproteina P (P-gp) (45). La P-gp, codificata dal gene di resistenza farmacologica MDR (multi drug resistance) e localizzata a livello delle membrane cellulari, ha l'importante funzione di espellere agenti tossici e chemioterapici penetrati nella cellula (46-48). Una marcata espressione della P-gp è stata evidenziata in neoplasie che risultano resistenti alla chemioterapia e gravate da una cattiva prognosi (48). Un nostro studio recente ha evidenziato una stretta relazione tra l'espressione immunoistochimica della COX-2 e della P-gp specie nei soggetti con gastrite Hp positiva resistenti alla terapia eradicante e nei soggetti con CG (49).
Un'altra delle vie molecolari coinvolte sia nel determinismo della farmaco-resistenza che nel processo di trasformazione cellulare è regolata dalla midkina (MK) (50). La MK è un fattore di crescita legante l'eparina codificato da un gene regolato dall'acido retinoico ed è implicato nei meccanismi di crescita e differenziazione cellulare (50). La MK è overespressa in carcinomi dell'esofago, del colon, del fegato e del pancreas e sembra rappresentare un importante fattore prognostico essendo direttamente correlata con la dimensione del tumore e con le metastasi a distanza (51,52). Recenti evidenze hanno dimostrato una overespressione della MK in circa il 56% dei CG primitivi e, mediante un'analisi globale di espressione genica, in tutte le linee cellulari gastriche rese resistenti dalla somministrazione di chemioterapici (53,54). La MK, oltre a regolare i meccanismi di farmaco-resistenza, sembra implicata anche nelle fasi precoci della trasformazione e progressione tumorale in quanto svolge un'azione promuovente la proliferazione cellulare e la neoangiogenesi tumorale analogamente ad altri fattori di crescita quali il VEGF e FGF (55).
Tali premesse suggeriscono che COX-2 e le vie molecolari ad essa correlata sono coinvolte nelle fasi precoci e tardive della carcinogenesi gastrica, rappresentando pertanto un interessante target farmacologico per la chemioprevenzione e la chemioterapia del CG. <<<