RICERCA ITALIANA     

Interazioni tra immunità innata ed immunità adattativa: dalla biologia alla clinica

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

Le cellule ed i mediatori solubili dell'immunità innata non solo costituiscono una prima linea di difesa nei confronti di agenti patogeni, ma promuovono e determinano il tipo di risposte immunitarie adattative. Le cellule natural killer (NK) e le cellule dendritiche sono tra i componenti principali dell'immunità innata che operano all'interfaccia tra immunità innata ed acquisita. Nonostante si sia ritenuto inizialmente che tali cellule fossero incapaci di un riconoscimento specifico, sono sempre maggiori le evidenze che dimostrano come esse esprimano numerosi recettori di membrana in grado di riconoscere profili molecolari propri dei microrganismi nonchè antigeni self normali ed anormali. I recettori in grado di decifrare ed integrare questi segnali inibiscono (in seguito al riconoscimento di una molecola self) o attivano (in seguito al riconoscimento di strutture microbiche o self anormali) la risposta immunitaria. Questo progetto si propone di valutare:
- Il ruolo di recettori di attivazione ed inibizione nonchè di corecettori nella regolazione della funzione citotossica delle cellule NK.
- L'attività di nuovi adiuvanti e di molecole costimolatorie nell'induzione da parte delle cellule dendritiche della proliferazione e delle funzioni delle cellule NK e dei linfociti T, la definizione molecolare e la rilevanza funzionale dell'interazione tra cellule NK e linfociti T.
- Il ruolo del macchinario endocitico nella cross-presentazione di antigeni esogeni da parte delle cellule dendritiche
- La rilevanza funzionale delle cellule dell'innunità innata nell'uomo in modelli di immunodeficienze primitive o nel trapianto di midollo osseo. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Angela SANTONI Universita' degli Studi di ROMA

Obiettivo del Programma di Ricerca

L'immunità innata fornisce da un lato la prima linea di difesa contro i microbi, dall'altro promuove ed influenza il tipo di risposta immunitaria specifica, generando vari segnali regolatori. Tra le cellule dell'immunità innata, le cellule NK svolgono un ruolo importante come prima linea di difesa nei confronti di alcune infezioni virali, patogeni intracellulari o cellule tumorali in quanto dotate di attività citotossica spontanea e della capacità di secernere numerose citochine.
Le cellule dendritiche rappresentano l'anello di congiunzione cruciale tra immunità innata ed immunità acquisita, in quanto funzionano come "sentinelle" in grado di captare segnali di pericolo e di trasmetterli ai linfociti T vergini. Questa funzione richiede la maturazione delle cellule dendritiche che viene indotta da numerosi prodotti microbici e da citochine infiammatorie. Nonostante inizialmente si ritenesse che le cellule dell'immunità innata quali i macrofagi e le cellule dendritiche non fossero dotate di specificità, oggi è chiaro che esprimono numerosi recettori codificati in linea germinativa, tra i quali i recettori Toll-like (TLR), capaci di riconoscere profili molecolari propri di classi di microrganismi e di funzionare quali recettori di molecole "adiuvanti ".
Le cellule NK riconoscono sia antigeni self normali quali le molecole MHC di classe I che interagiscono con recettori inibitori, sia antigeni self "anormali" presenti su cellule infettate e trasformate mediante recettori di attivazione. Ciò indica che il risultato funzionale dell'interazione fra una cellula NK e il suo bersaglio è determinato dal bilancio fra segnali opposti generati da recettori attivatori ed inibitori.

Da quanto sopramenzionato, si evince che questo programma di ricerca che rappresenta la continuazione di un progetto precedentemente finanziato dal MIUR nel 2002, si inserisce in una delle aree di crescente interesse della ricerca biomedica in campo immunologico. Molti dei gruppi proponenti possiedono un alto livello di competitività e qualificazione internazionale ed hanno fornito importanti contributi in questo settore.

Questa nuova proposta intende raggiungere i seguenti obiettivi:
1. Studio della regolazione dell'attività citotossica delle cellule NK da parte di recettori attivatori e inibitori.
L' U.O. Alessandro Moretta identificherà i ligandi di recettori attivatori orfani, coinvolti nella citotossicità MHC I-non ristretta delle cellule NK. - Il gruppo di Lorenzo Moretta cercherà di identificare il recettore di una nuova molecola espressa su cellule tumorali in grado di inibire la citotossicità NK - L'U.O. Santoni analizzerà le diverse vie di trasduzione del segnale che portano all'innesco delle funzioni delle cellule NK da parte di recettori attivatori che non riconoscono molecole MHC I e in particolare studierà il contributo dei segnali generati dai recettori di adesione, anche in collaborazione con il gruppo Notarangelo. L'U.O. di Lorenzo Moretta insieme al gruppo Velardi studierà l'espressione e la funzione di vari recettori attivatori ed inibitori durante la maturazione delle cellule NK dopo trapianto di midollo osseo.
2. Analisi dei meccanismi molecolari e cellulari che operano all'interfaccia tra immunità innata ed immunità acquisita.
I gruppi A. Moretta e Notarangelo analizzeranno alcuni dei recettori e dei mediatori solubili coinvolti nell'interazione tra cellule NK e cellule dendritiche (DC), mentre l'U.O. Santoni sarà coinvolta nell'identificazione di recettori/ligandi che regolano l'interazione cellule NK/linfociti T. Il gruppo Paroli studierà il ruolo del macchinario endocitico nella capacità delle cellule dentritiche di cross-presentare antigeni esogeni. L'U.O. Del Prete analizzerà gli effetti di nuovi adiuvanti mediati dall'interazione con recettori TLR su varie risposte dell'immunità adattativa mediate dai linfociti T e B. Il gruppo Piccolella analizzerà la capacità di molecole di costimolazione quali CD28/B7 di generare segnali pro-infiammatori nei linfociti T.
3. Analisi della rilevanza funzionale delle cellule all'interfaccia tra immunità innata ed immunità adattativa in modelli di patologie umane.
Il gruppo di Notarangelo analizzerà la presenza di possibili difetti a carico delle cellule NK e delle cellule dendritiche all'interfaccia tra immunità innata ed immunità adattativa, in alcune forme di immunodeficienze primitive quali la sindrome di Wiskott-Aldrich (WAS) e la trombocitopenia associata al cromosoma X, la sindrome linfoproliferativa X-recessiva (XLP), e la syndrome di WHIM. Il gruppo di Velardi fornirà importanti informazioni sul ruolo delle cellule NK alloreattive nel rigetto del trapianto di midollo osseo e nella resistenza alle leucemie, e sulla possibilità di sviluppare protocolli di immunoterapia adottiva specifica che supera le barriere MHC I, nei confronti di agenti patogeni opportunisti. <<<

Risultati parziali attesi

- Identificazione di ligandi per recettori di attivazione non MHC I orfani - Identificazione di nuovi recettori inibitori non MHC I e dei loro ligandi. - Identificazione delle vie di segnalazione responsabili della citotossicità naturale, con particolare <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La difesa nei confronti di microrganismi patogeni si basa su risposte precoci mediate dall'immunità innata e da risposte più tardive mediate dall'immunità adattativa o specifica. Localizzate a livello delle barriere epiteliali, le cellule dell'immunità innata riconoscono antigeni non processati utilizzando una vasta gamma di recettori codificati nella linea germinativa. L'immunità innata fornisce da un lato la prima linea di difesa contro i microbi, dall'altro promuove ed influenza il tipo di risposta immunitaria specifica, generando vari segnali regolatori (1).
I componenti principali dell'immunità innata sono mediatori solubili come le proteine del complemento e citochine quali gli interferoni (IFN) alfa e beta, e cellule con funzioni di "sentinelle" in grado di percepire segnali di allarme e funzioni effettrici, quali le cellule dendritiche (DC), i fagociti, e le cellule natural killer (NK).
Le cellule NK sono una sottopopolazione distinta di linfociti che svolge un ruolo importante come prima linea di difesa nei confronti di alcune infezioni virali, patogeni intracellulari o cellule tumorali (2). Esse sono dotate di attività citotossica spontanea non ristretta agli antigeni del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I e secernono numerose citochine. La proliferazione e le funzioni delle cellule NK sono stimolate da citochine dell'immunità innata quali gli IFN alfa e beta, IL-12, IL-18, e IL-15, e dell'immunità adattativa quali l'IL-2. L'IFN-gamma prodotto dalle cellule NK attiva i macrofagi ad uccidere i microorganismi fagocitati e favorisce la differenziazione di linfociti T helper-1 (Th1).
Le cellule dendritiche rappresentano l'anello di congiunzione essenziale tra immunità innata ed immunità acquisita, essendo le uniche cellule in grado di presentare un antigene proteico e di stimolare i linfociti T vergini, e di determinare il tipo di risposta immunitaria (3, 4). Localizzate a livello delle principali vie di accesso nell'organismo di antigeni microbici, svolgono la funzione di captare l'antigene e di trasportarlo ai linfonodi drenanti; durante la loro migrazione le cellule dendritiche divengono funzionalmente mature e particolarmente efficienti nel presentare gli antigeni e nello stimolare i linfociti T vergini. In vivo le cellule dendritiche sono anche capaci di cross-presentare antigeni esogeni, un processo critico per l'induzione di una risposta T CD8+ efficace nei confronti di tumori, allotrapianti, o alcune infezioni, ma non ancora del tutto chiarito (5). Le cellule dendritiche sono in grado di influenzare la natura e l'intensità della risposta immunitaria grazie alla loro capacità di produrre citochine diverse quali l'IL-12, IL-18, gli IFN alfa e beta e l' IL-10. Questa capacità di produrre citochine distinte è legata all'esistenza di popolazioni diverse di cellule dendritiche (mieloidi vs plasmacitoidi); la produzione di citochine è tuttavia influenzata anche dal tipo di segnali microbici che attivano le cellule dendritiche nonchè dal microambiente citochinico
Studi recenti indicano che le cellule dendritiche influenzano anche l'attività di altre cellule dell'immunità innata quali le cellule NK, e ne attivano la funzione citotossica (6-9). Le cellule NK a loro volta possono sia indurre la maturazione delle cellule dendritiche, sia uccidere cellule dendritiche immature. Questa interazione tra cellule dendritiche e cellule NK rappresenta un altro esempio di integrazione tra cellule del sistema immunitario che regola l'induzione e il potenziamento della risposta immunitaria. Stanno anche emergendo nuove evidenze sulla capacità delle cellule NK di interagire con i linfociti T e di regolare le loro funzioni, ma le basi molecolari di queste interazioni non sono note né la loro rilevanza funzionale.
Una differenza sostanziale tra immunità innata ed immunità adattativa è legata alle diverse strategie di riconoscimento e discriminazione self/non self.
Le cellule dell'immunità innata utilizzano per identificare agenti estranei potenzialmente dannosi, proteine codificate nella linea germinativa. I diversi prodotti microbici sono riconosciuti sulla base di profili molecolari (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) conservati, propri dei microrganismi e comuni a gruppi di microrganismi simili tra loro. Una classe di recettori in grado di riconoscere questi profili molecolari è quella della famiglia dei recettori Toll-like (TLR) (10, 11). In seguito al riconoscimento di ligandi specifici, i TLR trasducono segnali intracellulari che attivano la reazione infiammatoria e risposte effettrici anti-microbiche. Inoltre, la stimolazione dei TLR sulle cellule dendritiche gioca un ruolo importante nell'induzione della risposta immunitaria adattativa, in quanto stimola l'espressione di molecole di costimolazione e la produzione di citochine quali l' IL-12, IL-18, e gli IFN alfa/beta, che sono necessarie per l'attivazione dei linfociti T vergini. I TLR sono anche i recettori per gli "adiuvanti" microbici in quanto sono responsabili della maggiorparte degli effetti potenzianti che esercitano tali prodotti microbici sulla risposta mediata dai linfociti T. Potenti adiuvanti che agiscono sulle cellule dendritiche sono anche prodotti endogeni che vengono rilasciati da cellule in necrosi, o da tessuti che hanno subito uno "stress" o un danno (12).
Ciò fa ipotizzare che i meccanismi di riconoscimento dei "segnali" di un'infezione microbica, siano essi indiretti (danno) o diretti (struttura microbica), possano essere coevoluti. Tuttavia, ci sono ancora poche evidenze disponibili sulla capacità dei TLR di riconoscere ligandi endogeni rilasciati da cellule morte o danneggiate. L'identificazione degli effetti di questi adiuvanti e dei loro recettori sulle cellule NK o sulle cellule dell'immunità adattativa può fornire nuove informazioni sui meccanismi che controllano la risposta immunitaria nei confronti di cellule che hanno subito uno "stress" e del loro coinvolgimento nell'autoimmunità.
La discriminazione self/nonself da parte delle cellule NK si basa sul riconoscimento dell'assenza del self ("missing self") e della presenza di un self anormale Il riconoscimento del "missing self " è associato all'attivazione di vie di segnalazione inibitorie che bloccano l'induzione di una risposta nei confronti del self; il riconoscimento del self anormale su cellule infettate o trasformate stimola invece recettori di attivazione (13). L'ipotesi del "missing-self" è stata inizialmente formulata per spiegare l'effetto protettivo dell'espressione di antigeni MHC di classe I sulle cellule bersaglio, nei confronti della lisi mediata dalle cellule NK (14). Quando le cellule vanno incontro a trasformazione neoplastica o vengono infettate da un virus, si ha spesso una riduzione dei livelli di molecole MHC di classe I; si perde quindi l'effetto protettivo e le cellule bersaglio vengono così lisate dalle cellule NK. Negli ultimi anni sono stati caratterizzati numerosi recettori inibitori in grado di riconoscere molecole MHC di classe I. Essi appartengono alla superfamiglia delle immunoglobuline e vengono denominati KIR (killer immunoglobulin-like receptor) o alla famiglia delle lectine di tipo C, CD94/NKG2A. Entrambi sono caratterizzati dalla presenza nella coda intracitoplasmatica di una sequenza detta ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) (15). Quando il residuo di tirosina nel motivo ITIM viene fosforilato, esso è in grado di reclutare le tirosino-fosfatasi SHP-1 e SHP-2, che inibiscono la citotossicità e la produzione di citochine da parte delle cellule NK, defosforilando alcuni substrati cellulari critici per l'attivazione di queste funzioni.
Le conoscenze sui recettori di attivazione delle cellule NK sono più scarse (16,17). E' sempre più chiaro che le cellule NK possono utilizzare una combinazione di recettori diversi e di vie di segnalazione diverse per riconoscere cellule infettate da virus, tumorali o danneggiate (13). La maggior parte di questi recettori di attivazione sono molecole transmembrana con domini intracellulari corti e privi di attività tirosino chinasica intrinsica. Essi funzionano perchè si associano a proteine adattatrici capaci di trasdurre il segnale che contengono nella coda citoplasmatica una sequenza detta ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activating motif). Nell'uomo i recettori che associano la catena DAP-12 sono i KIR2DS, il CD94/NKG2C e il recettore NKp44. Il CD16, il recettore a bassa affinità per il frammento Fc delle immunoglobuline G ed i recettori NKp30 e NKp46 associano la catena gamma del recettore ad alta affinità per il frammento Fc delle immunoglobuline E, e/o la catena zeta del CD3. I recettori KIR2DS and CD94/NKG2C legano molecole MHC di classe I, ma con un'affinità minore se paragonata a quella dei corrispondenti recettori inibitori. Ciò suggerisce che i ligandi di questi recettori possano essere antigeni microbici o comunque estranei con una struttura simile a molecole MHC di classe I. E' stato descritto che i recettori NKp44 e NKp46 riconoscano l'emoagglutinina del virus dell'influenza grazie al loro contenuto in acido sialico. Inoltre è stata anche suggerita la presenza di ligandi per questi recettori su cellule tumorali sulla base della capacità di anticorpi diretti contro di essi di bloccare la lisi di alcuni tipi di cellule tumorali. Un altro recettore di attivazione delle cellule NK recentemente descritto è l'NKG2D, un omodimero appartenente alla famiglia delle lectine di tipo C che forma un complesso con la catena DAP 10; questa proteina adattatrice presenta nella coda intracitoplasmatica una sequenza in grado di reclutare la chinasi lipidica fosfatidilinositolo 3 chinasi (PI-3K). NKG2D riconosce alcuni ligandi che presentano una struttura simile a quella di molecole MHC di classe I, quali MICA, MICB e gli ULBP preferenzialmente espressi su cellule tumorali o infettate da virus (18).
Studi recenti indicano che i ligandi dell'NKG2D sono anche espressi sui linfociti T attivati (19) e suggeriscono che le cellule NK possono inibire le funzioni dei linfociti T determinando la loro uccisione. Esistono infine recettori di membrana quali le integrine beta 1 e beta 2, il CD44, CD28, CD244 che possono funzionare sia come recettori di attivazione sia di costimolazione (20-23). Di interesse, il recettore CD244, che riconosce la molecola di adesione CD48, associa la proteina adattatrice citoplasmatica SAP che regola l'attivazione delle cellule NK in risposta alla stimolazione del recettore. Pazienti affetti dalla sindrome linfoproliferativa X-recessiva (XLP) presentano un deficit della proteina SAP e il recettore CD244 non è in grado di attivare le cellule NK di questi individui (23, 24). L'infezione da parte del virus di Epstein Barr (EBV) in questi pazienti causa spesso una mononucleosi infettiva fatale e nei pazienti che sopravvivono si sviluppano linfomi B. Queste evidenze indicano che recettori associati alla proteina SAP sono particolarmente importanti nel controllo delle infezioni da EBV. Studi recenti hanno inoltre identificato altri recettori che si associano a SAP ed in particolare NTB-A, una nuova molecola appartenente alla famiglia del CD2 che contribuisce alla mancata lisi di cellule B infettate dall'EBV da parte delle cellule NK di pazienti con XLP (25).
Complessivamente è sempre più chiaro che l'attivazione del programma funzionale delle cellule NK è il risultato dell'integrazione di segnali diversi a partenza da recettori attivatori ed inibitori e da diversi corecettori. <<<