RICERCA ITALIANA     

STUDIO CON APPROCCI DI GENOMICA E PROTEOMICA DELL'ESPRESSIONE, DELL'ATTIVITA' E COMPARTIMENTALIZZAZIONE INTRACELLULARE DI PROTEINE COINVOLTE NEL SIGNALLING IN CELLULE TUMORALI UMANE ESPOSTE O NON AD AGENTI BIOLOGICI E CITOTOSSICI.

Seconda Università degli Studi di Napoli

Abstract

La terapia medica tradizionale delle neoplasie è attualmente affidata all'impiego di agenti citotossici convenzionali il cui meccanismo d'azione principale è il danno irreversibile e letale al DNA delle cellule tumorali. Accanto al danno al DNA, uno dei meccanismi d'azione della chemioterapia tradizionale è l'induzione di apoptosi nelle cellule neoplastiche. Tuttavia le cellule tumorali possono sviluppare dei meccanismi di fuga dall'apoptosi coinvolgenti le alterazioni dei circuiti regolativi della trasmissione del segnale mitogenico e del ciclo cellulare che assicurano alle cellule neoplastiche la sopravvivenza nell'ospite e la protezione dall'apoptosi. Inoltre appare sempre più emergente la necessità di scoprire nuove molecole in grado di inibire la proliferazione cellulare tumorale e dotate di attività antitumorali in vivo. Accanto a questa esigenza sta anche emergendo la necessità di caratterizzare gli effetti di farmaci dotati d attività antitumorale sull'espressione genica e sul profileo proteico delle cellule tumorali. Il progetto intende pertanto individuare nuove molecole antitumorali e definirne il meccanismo d'azione attraverso lo studio dell'espressione genica e proteomica e degli effetti sulla trasduzione del segnale. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Ettore BISMUTO Seconda Università degli Studi di NAPOLI

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il lavoro della Unità di Ricerca del Prof. Bismuto si articolerà lungo due direttive: la prima utilizzante come principale tecnica di indagine la microscopia FLIM e volta alla localizzazione intracellulare di costrutti fluorescenti di ras con FGP (Fluorescent Green Protein) in cellule normali e tumorali con e senza trattamento con opportune molecole che siano potenziali farmaci; la seconda volta alla caratterizzazione strutturale e funzionale in vitro dei costrutti fluorescenti di ras e dei suoi complessi con altre proteine cellulari coinvolte nella cascata di traduzione. Tali studi si avvarranno in particolare di tecniche di fluorescenza risolte nel tempo e della spettroscopia di correlazione di fluorescenza con eccitazione a due fotoni che consente di osservare interazioni e processi dinamici e diffusivi al livello di molecole singole.

Il progetto di ricerca del prof. Beninati, ha come obiettivo principale l'approfondimento dei fenomeno tramite il quale è possibile controllare la crescita tumorale, agendo indirettamente sul metabolismo delle poliammine, per mezzo cioè del differenziamento cellulare indotto dall'aumentata attività Tgasica. In particolare, la novità nell'approccio sperimentale deriva dal fatto che, non sarà valutato il banale effetto citostatico di farmaci capaci di impedire la crescita cellulare in modo aspecifico, ma si cercherà di stabilire le potenzialità di un trattamento il cui fine è quello di impedire in modo selettivo la crescita solamente di cellule i cui livelli di Tgasi intracellulare siano trascurabili. A tal fine, saranno preliminarmente raccolte ulteriori informazioni sul ruolo della Tgasi nella crescita e nel differenziamento cellulare. In particolare, la collaborazione già in atto con il Prof Bismuto, Università di Napoli, permetterà di approfondire la relazione tra Tgasi, poliammine e regolazione della formazione del fattore eucariotico di inizio della sintesi proteica 5A, nella crescita neoplastica. Siccome le cellule tumorali sono caratterizzate da livelli di Tgasi molto bassi e in genere insufficienti per poter indurre il differenziamento, il trattamento con molecole capaci di incrementare l'attività della Tgasi, dovrebbe selezionarle rispetto alle cellule normali, ove i livelli di Tgasi sono in genere più elevati. Risultati preliminari ottenuti nel nostro laboratorio, hanno evidenziato che, non solo l'attivazione della Tgasi riduce drasticamente la proliferazione di melanomi sperimentali sia in vitro che in vivo, ma influenza anche il potere metastatico, abbassando significativamente la capacità invasiva del tumore nell'organo bersaglio. L'aspetto che intendiamo approfondire concerne lo studio dei ciclo cellulare di melanociti normali, cercando di evidenziare i meccanismi alla base della modulazione della crescita, del differenziamento e della morte cellulare per mezzo delle Tgasi intracellulari. L'unità del prof. Lupoli definirà le basi molecolari dell'inibizione di crescita e dell'apoptosi indotte dagli analoghi della somatostatina su cellule di carcinoma midollare tiroideo umano e indagherà sulle interazioni tra signalling SS-dipendente ed EGF-dipendente. In dettaglio studierà la possibile interazione con le via ras-erk-dipendente definendo lo specifico signalling indotto dagli analoghi della SS. Inoltre verranno individuati i meccanismi di sopravvivenza che proteggono le cellule tumorali dall'apotposi e dall'arresto di crescita indotti dagli analoghi della SS e verranno studiate le interazioni farmacologiche tra questi ultimi e inibitori farmacologici della tirosin chinasi associata all'EGFR (ZD1839) o inibitori della funzione di ras (zoledronic acid e farnesyltransferase inhibitor R115777). L'unità Baldi valuterà il cDNA microarray di mucosa bronchiale ottenuta dai pazienti affetti da carcinoma non a piccole cellule (NSCLC) e sulle colture cellulari di CMT in collaborazione con l'unità Lupoli. Particolare attenzione sarà rivolta all'espressione dei geni regolanti il ciclo cellulare (CDK, p21, p27, p53, pRB etc.) ed ai fattori di crescita ed ai loro relativi recettori. Sulla base dei risultati ottenuti, gli effetti di agenti diretti verso molecole implicate nella trasduzione del segnale (ZD1839, R11577), da soli od in combinazione con altri agenti chemioterapici convenzionali, saranno studiati sulla proliferazione ed apoptosi di colture primarie di cellule tumorali bronchiali (o celllule di CMT). Allo stesso tempo sarà anche valutata l'espressione di p53, dei membri della famiglia dei geni correlati a bcl-2, APAF-1 e survivina in tessuti fissati in paraffina di NSCLC stadio I, allo scopo di identificare il ruolo di questi geni nella patogenesi del cancro polmonare e per verificare le potenziali implicazioni prognostiche. <<<

Risultati parziali attesi

Bismuto
- Trasformazione con costrutti di FGP, crescita ed osservazioni microscopiche FLIM con cellule normali e tumorali in
assenza o dopo trattamento con opportune con potenziale interesse farmacologico: mesi 5
- Caratterizzazione dell' espressione proteica di cellule normali e cancerogene nei vari trattamenti con farmaci: mesi 5
- Trasformazione in Escherichia coli di costrutti di FGP, crescita, estrazione e purificazione: mesi 2
- Beninati
- 1. Sintesi e determinazione degli effetti di attivatori della Tgasi intracellulare (Tg-attivatori). Questa parte del programma si svolgerà in collaborazione con il laboratorio del Dr. J.E. Folk, National Institutes of Health, Oral and Pharingeal Cancer Branch, NIDR, Bethesda, MD, USA. Le procedure di sintesi si baseranno su protocolli propri del Dr. Folk. In particolare, si partirà da analoghi delle metilxantine e dell'acido retinoico. Sarà valutato il grado di attivazione della Tgasi in vitro e in vivo, discriminando tra attivazione della proteina e sua espressione genica. Determinazione delle variazioni indotte dai Tg-attivatori nei parametri connessi con la crescita, il differenziamento e la morte cellulare (espressione dell'antioncogene p53, dell'oncogene c-myc e bcl-2, e analisi del ciclo cellulare con la citofluorimetria in fluorescenza). Studio dell'azione dei Tg-attivatori su cellule normali (colture primarie di melanociti) e neoplastiche (linee cellulari di melanoma murino ed umano). Preparazione di plasmidi tesi ad incrementare l'attività della Tgasi in animali da esperimento ( in collaborazione con il Dr. F.Facchiano, ISS, Roma). Melanomi sperimentali indotti nell'animale trasfettato.
2. Screening con valutazioni statistiche (Prof. E.Capucci, Università di Roma "Tor Vergata")dell'effetto dei Tg-attivatori risultati efficaci nell'inibizione della crescita cellulare. Determinazione del potere metastatico di linee cellulari tumorali e delle variazioni indotte dai Tg-attivatori. Caratterizzazione dei tipi di Tgasi coinvolti nel differenziamento cellulare e in particolare su colture di enterociti (in collaborazione con il Prof. C.Bergamini, Univ. di Ferrara). Studio delle variazioni indotte dai Tg-attivatori sui parametri connessi alla metastaticità di un tumore: adesione, invasione, attività proteolitica e migrazione cellulare (sia in vivo che con l'uso di camere di Boyden).
3. Sperimentazioone in vivo I. Da effettuare su animali trattati con cellule tumorali (B16-F10, B16-F1) altamente metastatiche preliminarmente trattate con Tg-attivatori. Valutazione statistica dell'efficacia sulla riduzione delle metastasi e sulla sopravvivenza. Selezione di cellule tumorali resistenti al trattamento con Tg-attivatori. Questa parte del lavoro si svolgerà nell'ambito di una collaborazione in atto con la Dr.ssa H.K.Kleinman, National Institutes of Health, NIDR, Bethesda, MD, USA.
- Lupoli
- 1.Definizione dell'interazione farmacologica e biochimica fra differenti analoghi della SS nelle cellule di carcinoma midollare della tiroide TT.
2. Definition of the molecular mechanisms on the basis of apoptosis and growth inhibition induced by biological agents.
Baldi.
- Determinazione di paramteri prognostici molecolari in NSCLC stadio I e II con tecniche di DNA microarrays.Bismuto
In sintesi lo sviluppo cronologico previsto delle fasi del progetto è il seguente.
- Caratterizzazione mediante tecniche spettroscopiche di base: mesi 2
- Studi del decadimento emissivo di fluorescenza: mesi 4
- Studio di fluorescenza su molecole singole (FCS): mesi 4
Beninati
1. Valutazione della tossicità dei Tg-attivatori e della dose efficace. 2. Valutazione di markers biochimici della crescita, differenziamento e morte cellulare (ornitina decarbossilasi, tirosinasi, melanina, bcl-2, ecc.). Valutazione della curva di accrescimento dell'animale trattato con Tg-attivatori. Studi biochimici sulla formazione dei legami poliammina-proteina catalizzata dalla Tgasi e identificazione dei substrati (in collaborazione con la Prof.ssa Esposito, Univ. di Salerno). Sintesi degli standards necessari per il dosaggio analitico (HPLC) e valutazione dei risultati in vitro e in vivo. Purificazione della Tgasi da cellule di melanoma e sua caratterizzazione. Purificazione della PAO da fegato di ratto e da cellule di melanoma. Inibizione dell'attività PAO, con MDL 72527 (dono della Merrel Dow), in cellule di melanoma e sua influenza sulla crescita e invasività in animale singenico. Modulazione del metabolismo di cellule di melanoma e di melanociti normali, al fine di indirizzare la sintesi di legami poliammina-proteina secondo schemi diversi da quelli naturali (inibizione dell'attività PAO, deplezione di poliammine, incremento della sintesi di polimeri proteici con poliammine marcate)
3. Sperimentazione in vivo II. Da effettuare su animali trattati con PAO-inibitori e Tg-attivatori (somministrazione orale dei prodotti). Uso di topi nudi per saggiare le molecole identificate come efficaci su melanomi umani (SKMEL) (in collaborazione con il Dr. F.Facchiano, ISS, Roma). Valutazione statistica dei risultati (Prof. Capucci, Università di Roma "Tor Vergata").
4. Introduzione ad eventuali "trials" clinici.
Lupoli
1. Definizione e overcome dei meccanismi di sopravvivenza dagli stimoli antiproliferativi indotti dagli analoghi della SS o dagli inibitori dell'attività di Ras.
2. Determinazione del livello molecolare di interazione delle diverse combinazioni.
3. Studio in vivo dell'espressione del segnale di trasduzione delle molecole e degli analoghi della somatostatina e la loro correlazione con la clinica
Questa parte del progetto sarà effettuata in collaborazione con il Dr Baldi del Dipartimento di Biochimica e Biofisica (UO Anatomia Patologica).
Baldi
Nell'ambito della caratterizzazione strutturale e funzionale in vitro dei costrutti fluorescenti di ras e dei suoi complessi con altre proteine cellulari coinvolte nella cascata di traduzione (vedi unità di ricerca del prof. Bismuto), il nostro gruppo di rcierca si farà carico di ingegnerizzare delle chimere in cui la proteina ras sarà clonata in vettori di espressione di modo che sarà possibile esprimerla in vivo in cellule di eucariote legata ad una estremità fluorescente (in prima istanza FGP: Fluorescent Green Protein). Inoltre, tali chimere così costruite saranno anche clonate in vettori che ne permettano un'ampia produzione in sistemi procariotici, cos' da avere discrete quantità di questi prodotti proteici. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Sin dagli studi pionieristici su retrovirus trasformanti cellule di topo fino alla corrente era postgenomica, lo studio delle proteine ras è considerato fondamentale per la comprensione dei fenomeni di trasduzione dei segnali cellulari e dell'oncologia molecolare (1,2). Tutt'ora una completa comprensione della funzione delle proteine della famiglia ras e delle patologie ad esse riconducibili, in primo luogo il cancro umano, non è stata raggiunta (3). La conoscenza di tali meccanismi cellulari è essenziale per lo sviluppo di farmaci efficaci per il trattamento di numerosi tipi di tumori (4).
Le proteine ras sono membri di una grande superfamiglia di proteine leganti GTP a basso peso molecolare (5). In vitro le proteine ras purificate posseggono un basso livello di attività GTP-asica per la quale convertono lentamente la molecola di GTP che ad esse è legata. Il GDP può poi essere scambiato nuovamente con GTP. Comunque, questi processi sono catalizzati e regolati all'interno della cellula con vari tipi di proteine effettrici (guanine nucleotide exchange factors GEFs e GTPases activating proteins GAPs). Le proteine della famiglia ras controllano i processi di crescita cellulare e svolgono un ruolo nei processi di apoptosi e senescenza (6, 7). Esse si ritrovano in forme mutate sia attivate sia inibite in diversi tumori umani. Le proteine ras richiedono per il loro normale funzionamento modifiche post-traduzionali il cui scopo principale è la loro localizzazione nel giusto comparto subcellulare, in particolare alla faccia interna della membrana plasmatici in modo da poter efficacemente interagire con le giuste molecole della cascata trasduttiva del segnale (2, 8). Scopo del progetto della presente unità di ricerca è di stabilire la localizzazione intracellulare di proteine ras e molecole con esse intergenti in cellule normali e tumorali di carcinoma epidermoide umano e di carcinoma midollare della tiroide. Tale studio sarà condotto anche in presenza di sostanze ritenute potenziali farmaci antitumorali (analoghi della somatostatina, bifosfonati ed agenti citotossici convenzionali come il docetaxel) (9). Le tecniche di microscopia di fluorescenza giocano un ruolo fondamentale negli studi delle funzioni e localizzazioni cellulari in quanto spesso non richiedono la distruzione della cellula per isolare i componenti di interesse. In particolare la disponibilità di proteine intrinsecamente fluorescenti (fluorescent green protein, GFP) il cui gene può essere fuso con un gene di interesse(nel caso del presente progetto di proteine ras ed altre ad esse relazionate, da cellule normali e tumorali) e reintrodotto nella cellula dove esprime il prodotto chimerico fluorescente, ha rivoluzionato le possibilità di studio dei processi cellulari in vivo (10). In particolare, intendiamo utilizzare nel nostro progetto una tecnica avanzata di microscopia (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM) (11). I vantaggi della microscopia FLIM sono molteplici e le sue potenzialità solo in parte esplorate. Usualmente la microscopia di fluorescenza ricostruisce le immagini partendo da misure di intensità di fluorescenza. Tale segnale ha in sé numerose complicazioni che riducono la sensibilità e la risoluzione delle immagini: a) i campioni biologici presentano un'intrinseca autofluorescenza; b) a motivo dell' ampiezza elevata delle bande emissive, si ha una sovrapposizione dei segnali di fluorescenza se si è in presenza di più specie di fluorofori; c) Il segnale osservato dipende dalla concentrazione di molecole fluorescenti. Il tempo di vita, invece, non dipende dall'intensità del segnale, e quindi dal numero delle molecole presenti, e risulta meglio separato in differenti specie fluorescenti. Pertanto, le immagini ottenute con la microscopia FLIM sono ad alta risoluzione e possono inoltre essere osservati simultaneamente segnali provenienti da differenti specie fluorescenti. Avvalendosi della strumentazione di laboratori specializzati quali il Laboratory for Fluorescence dynamics dell'Università dell'Illinois di Urbana con il quale la nostra unità di ricerca collabora attivamente da molti anni, sarà possibile ottenere immagini con la stessa tecnica FLIM ma con eccitazione a due fotoni che consente di ottenere immagini con miglior risoluzione a motivo dell'eliminazione dei segnali raman e della minor sezione di impatto nell'eccitazione multipla. La possibilità di fare dei costrutti tra molecole coinvolte nel signalling e GFP( molecola fluorecente) permetterà lo studio della compartimentalizzazione intracellulare di componenti del signalling dopo adeguati stimoli.
La maggioranza delle molecole utilizzate come agenti differenzianti induce l'espressione delle transglutaminasi intracellulari(5,6)(Tgase, EC 23,2.13). E' anche noto che, molte delle proteine responsabili dell'adesione cellulare, e in particolare la fibronectina, la laminina, l'osteopontina e la vitronectina sono modificate post-traduzionalmente dalle Tgasi(8). Le Tgasi catalizzano la reazione di trasferimento di un gruppo acilico da una glutammina a una lisina, formando un legame covalente fra le proteine substrato(9). I legami in questione sono di glutammil-lisina e glutammil-poliammine, essenziali nel differenziamento terminale dell'epidermide(12,13)e nella formazione dei corpi apoptotici(12). Le poliammine sono coinvolte nei processi di crescita sia normale che neoplastica(5,15), tra l'altro l'enzima chiave della loro biosintesi aumenta molto la sua attività nel passaggio dallo stato di quiescenza a quello proliferativo(16). Queste evidenze hanno aperto un nuovo campo di indagine, permettendo di formulare nuopve ipotesi sul ruolo di questi complessi nella modulazione della crescita e della morte cellulare(17). E' stato osservato che il sito di legame sulla proteina è deciso esclusivamente dalla presenza di uno specifico residuo di lisina o di glutammina(18).Inoltre, un elevato livello di poliammine satura i residui di glutammina disponibili, impedendo la formazione di legami intra-proteina (bis-derivati), mentre bassi livelli favoriscono la formazione di strutture polimerizzate, tipiche delle cellule quiescenti(19). La formazione di derivati più adatti per l'assemblaggio delle strutture cellulari sembra essere regolata dall'azione di un altro enzima, la poliammina ossidasi(PAO), che deammina la spermidina e spermina, formando un'aldeide e una poliammina di peso inferiore(22).Il ruolo della PAO, nella regolazione della crescita cellulare è noto da tempo, La possibilità che la PAO (purificata dal fegato dí ratto) sia capace di catabolizzare alcuni dei derivati della reazione catalizzata dalle Tgasi in presenza dí poliammine, è stata recentemente dimostrata nel nostro laboratorio (S. Beninati, manoscritto in preparazione). Questa informazione apre un nuovo campo di indagine sul meccanismo di modulazione della funzione della Tgasi intracellulare ed in particolare potrebbe permettere di migliorare le nostre conoscenze sul controllo della crescita e del differenziamento cellulare. Risultano interessanti a tal fine le recenti osservazioni che hanno permesso dí concludere che l'attivazione della Tgasi intracelluiare di cellule di melanoma murino, conduce ad una diminuita crescita cellulare e in alcuni casi all'induzione del differenzíamento terminale, migliorando la sopravvivenza di animali inoculati con cellule tumorali(23). Il carcinoma midollare della tiroide (CMT) è una neoplasia maligna delle cellule parafollicolari e rappresenta il 5-10% circa dei tumori tiroidei. Tali cellule originano dalla cresta neurale e sono calcitonina (CT) secernenti.
Le recidive si presentano in circa il 50% dei pazienti, precedute spesso da un innalzamento dei livelli sierici di CT e/o CEA. Il reintervento in questi casi è indicato quando la malattia è ben localizzata.
Il CMT è scarsamente radio e chemiosensibile. La somatostatina (SS) è un peptide ciclico formato da 14aa, normalmente prodotto da cellule neuroendocrine e non. Ligando naturale dei recettori della somatostatina (SS-R), esso esercita la sua azione fisiologica attraverso una famiglia di 6 recettori accoppiati alle G-protein (SS-R 1, 2A e 2B, 3, 4 e 5). Ha una breve emivita (3 minuti) che ne rende impossibile un uso clinico; pertanto, numerosi analoghi della somatostatina sono stati sintetizzati con un'attività biologica uguale o superiore rispetto all'ormone naturale, associato ad una maggiore stabilità e durata d'azione. Tali analoghi sono stati realizzati con diverse affinità per i sottotipi recettoriali per SS.
Al momento, l'octapeptide octreotide è l'analogo della somatostatina maggiormente utilizzato in clinica in quanto presenta una buona resistenza ai processi di degradazione enzimatica mantenendo la stessa attività biologica specifica. Studi farmacologici hanno dimostrato che l'octreotide lega prevalentemente le isoforme SS-R2A, SS-R2B, SS-R3 e SS-R5, mentre il lanreotide è un analogo specifico delle isoforme SS-R2 e SS-R5. Comunque, l'attività antitumorale degli analoghi della SS sembra essere limitata solo ad un beneficio clinico. Infatti, l'ipersecrezione ormonale e la sintomatologia neuroendocrina sono ben controllati dalla terapia con analoghi della SS in molti pazienti. E' stato dimostrato che il trattamento con lanreotide od octreotide sia in grado di controllare la sintomatologia neuroendocrina, con un significativo miglioramento della qualità di vita e decremento dei livelli di CEA e CT. Recentemente, inoltre, un analogo pleiotropico della SS, SOM230, è stato sviluppato e già utilizzato in studi clinici. Il meccanismo d'azione di questi farmaci è complesso. Infatti, essi hanno un effetto "diretto", mediato dal legame dell'analogo con i recettori ad alta affinità presenti sulla cellula tumorale, e rappresentato principalmente da un'azione antimitotica diretta, con inibizione della sintesi di DNA e della replicazione cellulare, indotta dall'EGF e da altri fattori di crescita, con conseguente blocco delle cellule in fase G1 del ciclo cellulare. Essi hanno, inoltre, effetti "indiretti" rappresentati da: inibizione di numerosi fattori di crescita, tra cui l'insulin growth factor-1 (IGF-1), di cui bloccano la formazione, e l'epidermal growth factor (EGF); attività di modulazione della risposta immunitaria; induzione dell'apoptosi; riduzione dell'angiogenesi; blocco della secrezione di ormoni coinvolti nella regolazione della crescita tumorale (GH, insulina, secretina, etc).
Il nostro gruppo ha realizzato numerosi studi nel CMT avanzato basati sull'utilizzo degli analoghi della SS ed abbiamo dimostrato che la combinazione octreotide o lanreotide + interferone-α tipo 2b (rIFN-α-2b) è efficace nel trattamento del CMT avanzato, comportando un miglioramento della sintomatologia e riduzione di CT e CEA. D'altra parte queste combinazioni sono al momento poco efficaci nell'indurre risposte cliniche in pazienti affetti da CMT, probabilmente a causa di meccanismi di resistenza tumorale all'attività inibitoria della crescita cellulare degli analoghi della SS e dell'IFNα.
Recentemente, è stata riscontrata evidenza che i bifosfonati incluso lo zoledronato (ZOL) sono potenti induttori dell'apoptosi in diversi tipi di carcinoma come mieloma, carcinoma mammario, carcinoma prostatico, ma anche in macrofagi ed in linee cellulari epiteliali. Questi dati indicano che l'effetto benefico dei bifosfonati può derivare da una attività anti-tumorale diretta che può riguardare un'ampia parte di neoplasie metastatizzanti. Infatti, si è dimostrato che i bifosfonati contenenti nitrogeno inibiscono la farnesil difosfato sintasi probabilmente mimando la porzione difosfato e portando alla inibizione della sintesi farnesilica e anche alla formazione di isoprenoidi maggiori come i geranil-residui. Questi dati suggeriscono l'utilizzo dei due agenti in combinazione allo scopo di incrementare la loro efficacia anti-tumorale. La disponibilità di agenti clinici che sono specifici inibitori dei pathways EGF-Ras-dipendenti anti-apoptotici e protettivi delle cellule cancerose incoraggia lo studio sull'uso combinato di ZD1839/ZOL con analoghi della SS ed agenti citotossici nel trattamento del CMT. E' evidente che la conoscenza del meccanismo patogenetico e dei meccanismi di controllo del ciclo cellulare possono incrementare le possibilita' di identificare precocemente tali patologie. Inoltre, l'impiego di farmaci diretti all'inattivazione di specifici target importanti nella tumorigenesi e nel mantenimento del fenotipo trasformato , nonche' la conoscenza del loro meccanismo molecolare, potra' costituire un sensibile avanzamento nella lotta al cancro del polmone. Infine, riveste una grande importanza, il controllo farmacologico della disseminazione tumorale, che puo' realizzarsi attraverso la conoscenza dei meccanismi molecolari coinvolti. In particolare, del ''set'' di proteasi e fattori che stimolano il movimento delle cellule tumorali, favorendone la metastatizzazione. Alla luce di queste osservazioni, obiettivo del presente progetto sarà l'approfondimento delle conoscenze sulle attivita' svolte dai componenti della complessa macchina del ciclo cellulare (geni soppressori, cicline, chinasi ciclina-dipendenti e inibitori delle cdk) nello sviluppo e nella progressione del carcinoma polmonare, allo scopo, da una parte, di ricercare ''markers'' che consentano una diagnosi precoce.
E' noto da tempo che la proliferazione cellulare incontrollata, alla base della formazione di un tumore, e' regolata da un lato da proto-oncogeni con capacita' di stimolare la crescita cellulare e dall'altro da geni inibitori (tumor suppressors) che contrastano la crescita cellulare. Mutazioni che potenziano, sottraendole ad ogni controllo, le attivita' dei proto-oncogeni forniscono ad essi la possibilita' di promuovere la proliferazione tumorale. D'altro canto, alterazioni genetiche che inattivano i geni inibitori, liberano le cellule dai limiti proliferativi imposti da questi geni, portandole alla crescita incontrollata tipica delle neoplasie. Il risultato finale della disregolazione risultante dall'attivazione degli oncogeni ovvero dall`inattivazione dei geni soppressori sembra, quindi, essere simile se non uguale. Il complesso meccanismo di regolazione del ciclo cellulare e' l`ultimo diretto controllore della divisione cellulare, quindi alterazioni funzionali di ciascuna sua componente, possono potenzialmente provocare deregolazione dell`espressione genica, mutazioni, o modificazioni dei prodotti proteici con conseguente probabili effetti diretti sulle capacita' di controllo della cellula allorche` essa comincia a dividersi. La progressione attraverso le varie tappe del ciclo cellulare e'controllata da complessi proteici composti da cicline e chinasi ciclina dipendenti (Cdk). Le cicline rappresentano una famiglia di proteine periodiche cosi'definite per la caratteristica di essere sintetizzate in determinati momenti del ciclo cellulare e per essere, quindi, rapidamente degradate. Le chinasi ciclina dipendente sono, invece, delle proteine ad attivita'regolatoria del ciclo cellulare costituzionalmente espresse e capaci di svolgere le proprie azioni una volta formato il complesso proteico con una ciclina. Il modello attuale per il complesso enzimatimaticamente attivo prevede una ciclina come molecola ad azione regolatoria ed una Cdk come sub-unita'catalitica. La loro ciclica funzione si esplica attraverso la fosforilazione di elementi fondamentali coinvolti nel ciclo cellulare quali i membri della famiglia del gene del retinoblastoma e il gene p53. La famiglia delle cicline consiste attualmente di 8 classi maggiori identificate con le lettere dalla A alla H. Similmente alle cicline sono state identificate varie chinasi ciclina dipendente
(cdk). Recentemente, infine, e' stata identificata una nuova famiglia di regolatori del ciclo cellulare che svolgono funzione di inibitori delle chinasi ciclina dipendenti ( p21 p15, p16, p18, p19/20 p27, p57). <<<