RICERCA ITALIANA     

Studio immunofenotipico e genotipico dei „pathways" RB1, p53, Wnt ed Homeobox nel carcinoma epatocellulare e nelle lesioni preneoplastiche epatiche con la tecnica dei „tissue microarray"

Università degli Studi di Napoli "Federico II"

Abstract

Il carcinoma epatocellulare (HCC) é una delle piu' frequenti neoplasie umane. L'incidenza di questo tumore varia significativamente a seconda delle aree geografiche considerate, raggiungendo la massima incidenza nelle aree dell' Africa sub-sahariana e dell'Estremo Oriente. La marcata variabilità geografica dellí HCC é in relazione alla variabile prevalenza dei fattori di rischio ambientale che svolgono un ruolo critico nella cancerogenesi epatica. Tra questi l'infezione da epatite B (HBV) e C (HCV) sono sicuramente i fattori di rischio piu' importanti nello sviluppo dell'HCC. In Italia, ed in particolare in Italia meridionale, l'incidenza del carcinoma epatocellulare (HCC) raggiunge valori tra i piu' elevati nel mondo occidentale, in relazione soprattutto allíalta incidenza di infezione da epatite B e C. Nei paesi occidentali ed in Giappone, la maggior parte degli HCC si sviluppa da una cirrosi sia attiva che inattiva. Dati scientifici, prodotti dal nostro gruppo e da altri autori dimostrano che la cancerogenesi epatica é un processo che coinvolge piu' geni, in maniera sequenziale („multistep process"). Questo progetto si prefigge come scopo l'identificazione di fattori biologici coinvolti nella genesi delle lesioni epatiche preneoplastiche e del carcinoma epatocellulare. Nell'ambito di un progetto multicentrico é stato costruito un „tissue microarray" (TMA) dedicato particolarmente allo studio dell'epatocarcinogenesi, comprendente lesioni nodulari epatiche benigne, preneoplastiche e francamente neoplastiche. Tali lesioni nodulari sono state ottenute dagli archivi degli Istituti di Patologia dellíUniversità di Basilea (Svizzera), Napoli, Milano e Sassari. Sulla base dell'esperienza unica accumulata negli ultimi anni dal nostro gruppo nell'Istituto di Patologia di Basilea nella tecnologia dei „chips" tissutali, sono stati ottenuti da blocchi di paraffina di 428 noduli (280 pazienti) „punchs" tissutali del diametro di 0,6 mm.
Essendo state costruite 4 copie di tale TMA ed essendo possibile ottenere circa 200 sezioni da un singolo „chip" tissutale, sarà possibile effettuare circa 800 differenti studi di tipo immunoistochimico e molecolare in situ su tali neoplasie. Nellíambito dei meccanismi molecolari dellíepatocarcinogenesi, sulla base dei precedenti risultati ottenuti dal nostro gruppo e da altri autori ci proponiamo di studiare in particolare l'espressione dei geni coinvolti nei „pathways" RB-1, p53, Wnt-1 e nel circuito dei geni Homeobox. Questo studio permetterà di valutare i parametri che possono avere un ruolo nella carcinogenesi epatica e di verificarne l'eventuale significato prognostico. Il database cosí ottenuto renderà possibile successivamente comparare l'espressione di nuovi geni con quella ottenuta da „geni standard", fornendo informazioni su possibili "pathways" molecolari di cancerogenesi. Tale studio sarà effettuato utilizzando sul TMA metodiche di immunoistochimica e di FISH (Fluorescent in situ Hybridization).
Questo studio sarà il primo studio genetico ed immunoistochimico di noduli epatici con la tecnologia dei TMA. Esso permetterà líanalisi quasi istantanea del significato diagnostico, patogenetico e/o predittivo/prognostico delle alterazioni molecolari osservate.I dati ottenuti saranno inoltre di enorme utilità per la ricerca in futuro. L'analisi dei differenti geni studiati su TMA porterà alla costruzione di un database senza precedenti sul carcinoma epatocellulare (circa 14000 data points) ad un costo minimo. Dal nostro studio si potranno ottenere degli importanti risultati riguardanti il ruolo nell'HCC e nella carcinogenesi epatica di ciascuno dei markers analizzati. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Luigi Maria TERRACCIANO Università degli Studi di NAPOLI "Federico II"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Ipotesi:
Uno o piu' dei geni descritti in seguito hanno un significato patogenetico, prognostico e/o predittivo nel carcinoma epatocellulare .
Il nostro progetto di ricerca si pone come obiettivo primario la costruzione di un „database" contenente dati dellíespressione genica di almeno 32 geni in circa 428 noduli. Questo fornirà importanti informazioni sul (possibile) valore predittivo e prognostico dellíespressione di questi geni e darà nuovi elementi per lo studio della carcinogenesi epatica con metodiche di tipo molecolare, ma confermerà ulteriormente la validità della tecnica dei tissue microarrays utilizzati come risorsa di materiale tissutale. In futuro sarà infatti possibile comparare l'espressione di nuovi geni con con quella dei geni già esaminati. Queste informazioni potranno essere utili a scoprire delle associazioni tra nuovi geni e „pathways" molecolari già noti di cancerogenesi.
Sulla base dei dati ottenuti dal nostro gruppo e da altri autori(1-19), noi ipotizziamo che uno o piu' dei seguenti geni di 4 „pathways" molecolari abbiano un significato patogenetico, prognostico e/o predittivo nel carcinoma epatocellulare:

RB1 pathway: Rb, p14arf, p15ink4b, p16ink4a p27/Kip1, p21/WAF1, cyclin A, Cyclin B1, Cyclin D1, Cyclin D2, Cyclin D3, Cyclin E, CDK4, Ki67, PCNA

p53 pathway: p53, APC, mdm2

Wnt/ beta-catenin pathway: beta-catenin, E-cadherin, MMP-7

Homeobox genes pathway: HoxA9(N-20), HoxB3(C-20), HoxA10(A-20), HoxB3(S-20), HoxA1(N-20), HoxA3(L-13), HoxB6(G-20), HoxA7(G-20), HoxD3(A-12), HoxD1 (L-20), HoxD9 (H-342)

Questi geni verranno studiati con metodiche di immunoistochimica e/o di FISH.
Gli aspetti economici del programma sono di grande importanza, anche in caso di risultati negativi (assenza di correlazione con lo sviluppo dell'HCC). I nostri dati negativi saranno cosi' convincenti (428 noduli) da scoraggiare le ripetizione dello studio degli
stessi geni da parte di altri ricercatori; inoltre l'effettuazione di studi simili con metodiche tradizionali risulterebbe molte volte piu' costoso <<<

Risultati parziali attesi

Ci aspettiamo di escludere una parte degli anticorpi per motivi tecnici durante la prima fase. E' da ritenere comunque che circa un 50-75% degli anticorpi scelti funzionerà adeguatamente. Inoltre, poichè la biologia molecolare del carcinoma epatocellulare é un campo in continua evoluzione, con un aggiornamento riguardante nuovi geni e/o proteine pressoché costante, é da ritenersi molto probabile che la suddetta lista di anticorpi possa in un futuro anche prossimo, variare.Ci aspettiamo che una parte almeno dei marcatori genetici scelti mostri un differente pattern di amplificazione nei diversi tipi di noduli, permettendo cosi' di tracciare, insieme con i risultati dell'analisi immunoistochimica, una parte del "pathway" molecolare coinvolto nella carcinogenesi epatica <<<

Durata

12 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il carcinoma epatocellulare (HCC) é una delle piu' frequenti neoplasie umane(20). L'incidenza di questo tumore varia significativamente a seconda delle aree geografiche considerate, raggiungendo la massima incidenza nelle aree dell' Africa sub-sahariana e dell'estremo oriente. La marcata variabilità geografica dell' HCC é in relazione alla variabile prevalenza dei fattori di rischio ambientale che svolgono un ruolo critico nella cancerogenesi epatica. Tra questi l'infezione da epatite B (HBV) e C (HCV) sono sicuramente i fattori di rischio piu' importanti nello sviluppo dell'HCC(21, 22). In Italia, ed in particolare in Italia meridionale, l'incidenza del carcinoma epatocellulare (HCC) raggiunge valori tra i piu' elevati nel mondo occidentale(20), in relazione soprattutto all'alta incidenza di infezione da epatite B e C(23). Nei paesi occidentali ed in Giappone, la maggior parte degli HCC si sviluppa da una cirrosi sia attiva che inattiva. Dati scientifici prodotti dal nostro gruppo(14-16) e da altri autori(24-26) mostrano che la cancerogenesi epatica é probabilmente un processo che coinvolge piu' geni, in maniera sequenziale („multistep process").
Studi recenti hanno mostrato che nell'epatocarcinogenesi oltre alla stimolazione autocrina indotta da fattori di crescita come ad es. IGF-II(27) e TGF-beta(28)sono frequentemente interessati alterazioni di almeno 3 „pathways": RB-1, p53 e Wnt/beta-catenina . Questi 3 „pathways" non devono essere considerati come 3 sistemi distinti ed indipendenti tra loro, in quanto, non di rado, presentano aree di sovrapposizione. Gli inibitori del ciclo cellulare p14ARF, p15INK4B, p16INK4A , tutti collegati al „pathway" RB-1, sono inattivati da meccanismi di ipermetilazione del loro „promoter", e cio' accade probabilmente in una fase precoce dell'epatocarcinogenesi(13). RB-1 controlla la progressione dalla fase G1 alla fase S del ciclo cellulare. Il complesso CDK4/CyclinD1 fosforila RB-1, inducendo il rilascio del fattore di trascrizione E2F che a sua volta attiva geni coinvolti attivi nella transizione G1-S(29). p16INK4 inibisce il complesso CDK4/Cyclin D1, bloccando quindi tale transizione. p15INK4B, localizzato sul cromosoma 9p21 come anche p14ARF e p16INK4A, agisce in modo analogo(29). Un'alterazione del „pathway" del RB-1 puo' quindi essere dovuta a perdita della funzione di p15INK4B, p16INK4A , perdita della funzione di RB-1 o ad amplificazione di CyclinD1 e/o CDK4. p14ARF inattiva il pathway p53 nella transizione G1-S stabilizzando p53(29). p14 condivide il „promoter" con p16INK4A e, come gia' detto, puo' essere inattivata da meccanismi di ipermetilazione(24). Cio' riduce l'espressione del gene gia' in condizione di cirrosi. Meccanismi di ipermetilazione del „promoter" di p16INK4 e p15INK4B sono stati inoltre dimostrati nei cosidetti „noduli displastici" epatici, che rappresentano lesioni epatocellulari preneoplastiche(24).
Il „pathway" p53 é un altro importante meccanismo di controllo delle fasi G1/S del ciclo cellulare. Dopo alterazioni del DNA causate da agenti chimici, fisici o altro, p53 é attivato ed induce la trascrizione di geni come p21Waf/Cip1(29, 30). p14ARF si lega a MDM2 , inducendo cosi' la stabilizzazione sia di p53 che di MDM2(30, 31). Per questo motivo inattivazione del „pathway" p53 puo' essere causata da mutazione di p53, amplificazione di MDM2 o perdita della funzione di p14ARF . Recentemente il nostro gruppo ha dimostrato che il „pathway" p53 puo' essere alterato sia attraverso mutazioni di p53 che attraverso metilazione di p14ARF in un terzo di HCC(3). Le mutazioni del p53 nell'HCC sono particolarmnte frequenti in alcune province della Cina (Qidong) e del Sudafrica dove l'esposizione all'HBV e all'aflatossina B rappresentano i maggiori fattori di rischio per l'HCC(32).
Inappropriata attivazione del sistema Wnt-1, rilevata dall'accumulazione intracellulare di b-catenina, é stata descritta in diverse neoplasie maligne(33). Beta_catenina é una proteina multifunzionale che integra il sistema di adesione intercellulare E-caderina/beta catenina con il sistema Wnt-1 durante lo sviluppo embrionale(34). Si ritiene che entrambi i sistemi, come del resto altre proteine di membrana come c-Met, recettore per l'HGF, competano per beta-catenina libera nel citoplasma(35). Nelle cellule epiteliali normali dell'adulto, beta-catenina é localizzata in posizione submembranosa, mentre, in assenza di attivazione del sistema Wnt-1, beta-catenina libera nel citoplasma é presente in modica quantità. Questo risulta essere una conseguenza della fosforilazione di beta-catenina da parte di un complesso multiproteico comprendente APC, axina, e glycogen syntase kinase (GSK)-3/beta conduce ad una attivazione del sistema ubiquitina-proteosomico di degradazione proteica(36). L'attivazione del sistema Wnt-1 inibisce l'attività di GSK-3/beta ed induce stabilizzazione di beta-catenina. La translocazione intranucleare di beta-catenina e la sua associazione con Tcf/LEF causa attivazione di alcuni geni quali c-myc e CyclinD1(37, 38). Recentemente mutazioni oncogeniche del gene di beta-catenina sono state descritte in tumori epatici nel topo come nell'uomo (39). Mutazioni di beta-catenina sono state descritte nel 13-41% degli HCC ( dal nostro gruppo tra il 13-31%), a seconda dei fattori etiologici connessi all'HCC(3, 40, 41). La marcata correlazione tra la localizzazione nucleare e le mutazioni somatiche del gene di beta-catenina nelle cellule tumorali sembra indicare che l'attivazione del pathway Wnt-1/beta-catenina nell'HCC si verifichi prevalentemente attraverso mutazioni del gene stesso di beta-catenina(42).
I geni Hox ed Homeobox, infine appaiono svolgere un ruolo estremamente importante nello sviluppo e nella differenziazione cellulare(6, 43) e nel controllo di altri importanti processi cellulari implicati in malattie congenite (44), metaboliche(45) e neoplastiche(5, 46). In particolare un'alterata regolazione dei geni Homeobox sono stati descritti durante la trasformazione neoplastica. Infatti questi geni :1) sono coinvolti nelle leucemogenesi(47); 2) mostrano un ampia omologia con protooncogeni umani; 3) possono svolgere un ruolo onco-soppressore(48). Nel fegato il circuito dei geni HOX risulta attivo nel fegato umano adulto. Specifici geni del circuito sono in grado di interagire con i fattori di trascrizione maggiormente implicati nella organogenesi e nella cancerogenesi epatica. Infatti é stato recentemente riportato che lo stesso gene capace di interagire con p53, Hox A5, interagisce anche con uno dei fattori di trascrizione piu' importanti nella organogenesi epatica appartenente alla famiglia Forkhaed box denominato FKHR(49). Il topo transgenico che iper-esprime Hox A5 manifesta nanismo come conseguenza di un blocco della crescita riconducibile ad alterazioni di fenotipi cellulari epatici risultanti dall'interazione diretta tra i due fattori di trascrizione. Questo genera un incremento di 12 volte, nel fegato del topo, di insulin growth factor bindin protein 1 (IGFBP1) ed una diminuzione del 50% di insulin-like growth factor 1 (IGF1) epatico che correla con il 50% di diminuzione di IGF1 circolante. Questi dati indicano che le omeoproteine, oltre al ruolo di regolatori dello sviluppo embrionale, svolgono un ruolo importante nel controllo di funzioni metaboliche cruciali del fegato.

Sulla base di questi dati noi ipotizziamo che l'espressione dei geni coinvolti nei „pathways" RB-1, p53, Wnt-1 e nel circuito dei geni Homeobox svolgano un ruolo di primaria importanza nella morfogenesi del carcinoma epatocellulare e che siano differentemente espressi nelle lesioni nodulari epatiche benigne, preneoplastiche e francamente neoplastiche.
Usando i metodi tradizionali di patologia molecolare é chiaramente impossibile testare centinaia di geni in centinaia di tumori, sia per ovvi problemi di carico di lavoro non sopportabile da alcun laboratorio, sia perché il materiale neoplastico in paraffina disponibile negli archivi degli istituti di patologia si esaurirebbe rapidamente. La tecnica dei „tissue microarray" (TMA) recentemente descritta, rappresenta la soluzione ideale per studi in larga scala di indagini immunistochimiche e molecolari su tessuto(50, 51). Questa metodica, sviluppata da una collaborazione tra l'Istituto di Patologia di Basilea , Svizzera, e il National Human Genome Research Institute in Bethesda, USA, permette l'analisi simultanea fino a 1000 tumori per vetrino istologico, usando tecniche di evidenziazione in situ proteomiche e/o genomiche(52-58). Noi abbiamo quindi costruito un TMA dedicato particolarmente allo studio dell'epatocarcinogenesi, comprendente lesioni nodulari epatiche benigne, preneoplastiche e francamente neoplastiche, ottenute dagli archivi degli Istituti di Patologia delle Università di Basilea, Napoli, Milano e Sassari. Sulla base dell'esperienza unica accumulata dal nostro gruppo nell'Istituto di Patologia di Basilea nella tecnologia dei „chips" tissutali(59, 60), sono stati ottenuti da blocchi di paraffina di 428 noduli (280 pazienti) „punchs" tissutali del diametro di 0,6 mm (fig. 1) . Tale TMA é composto da 233 HCC, 15 Noduli displastici High grade, 7 Noduli displastici Low-grade, 10 noduli macrorigenerativi, 8 casi di displasia a piccole cellule, 11 casi di displasia a grandi cellule, 8 casi di iperplasia nodulare focale , 2 casi di adenoma, 13 lesioni clonali, 119 cirrosi. 20 aree di tessuto epatico normale da usare come controllo.
Riteniamo che uno studio sia immunistochimico che molecolare tramite la tecnica FISH, dei „pathways" RB-1, p53, Wnt-1 e del circuito dei geni Homeobox, entrambi effettutati su tale TMA di epatocarcinogenesi possa risultare estremamente utile per delineare un profilo genetico delle singole lesioni nodulari epatiche e per comprendere gli eventi molecolari che sottendono lo sviluppo del carcinoma epatocellulare. <<<