RICERCA ITALIANA     

IL SISTEMA MELANOCORTINICO NELL'OBESITA' E NEI DISTURBI DEL COMPORTAMENTO ALIMENTARE: MODELLI ANIMALI, SCREENING MOLECOLARE, CARATTERIZZAZIONE CLINICA E FUNZIONALE.

Seconda Università degli Studi di Napoli

Abstract

Il progressivo incremento della prevalenza dell'obesità osservata in molti paesi, soprattutto nella sua forma più severa ed in quella ad esordio precoce, è responsabile di un importante effetto negativo sulla salute pubblica. E' stato di recente dimostrato il coinvolgimento dei peptidi melanocortinici(peptidi derivati dalla proopiomelanocortina, recettori 3 e 4 melanocortinici) nel controllo del senso della fame nell'uomo. Numerosi studi suggeriscono che la componente genetica interviene tra il 40 e 70% nella determinazione della quota di grasso corporeo. In soggetti obesi appartenenti a differenti gruppi etnici sono state identificate numerose mutazioni a carico dell'MC4R.
Obiettivo principale della ricerca è quella di studiare, nell'uomo ed in modelli animali, il coinvolgimento delle vie metaboliche del segnale melanocortnico nella patogenesi delle alterazioni del comportamento alimentare e nell'obesità. Le nuove conoscenze possono facilitare un approccio terapeutico futuro di tipo farmacologico più specifico e razionale. Lo studio prevede di arruolare più di mille pazienti bambini, adolescenti ed adulti affetti da disturbi del comportamento alimentare e/o da obesità provenienti da diverse regioni italiane rappresentative del nord, centro e sud.
Obiettivi specifici sono:
1) Determinare quale sia la reale prevalenza di mutazioni dell'MC4R allorché la ricerca venga effettuata in un gruppo di bambini, adolescenti ed adulti con obesità severa.
2) Identificare alcuni aspetti del fenotipo in bambini, adolescenti e adulti con mutazioni dell'MC4R. In particolare verranno studiati il metabolismo glicidico e la composizione corporea mediante bioimpedenziometria.
3) Determinare la reale prevalenza delle mutazioni a carico dell'MC4R in un gruppo di adolescenti ed adulti affetti da " binge eating disorder".
4) Caratterizzare dal punto di vista funzionale ogni eventuale variante allelica trovata onde precisarne il reale ruolo patogenetico.
5) Determinare la reale prevalenza del polimorfismo Arg236Gly del POMC in bambini ed adolescenti con obesità ad esordio precoce, adulti con obesità severa, adolescenti ed adulti affetti da "binge eating disorder").
6) Meglio descrivere il fenotipo dei soggetti con polimorfismo Arg236Gly del POMC.
7) Studiare se varianti dell' Actractin-like-protein (ALP) possano essere considerate fattori predisponenti all'obesità ad esordio precoce o al binge eating disorder.
8) Studiare in modelli animali (topi) l'effetto di uno stress postnatale ripetuto sia sul sistema del segnale melanocortinico che, in particolare sulla concentrazione del Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF)un importante metabolita attraverso il quale il segnale melanocortinico regola il bilancio energetico.
Lo studio coinvolge quattro unità di ricerca e si articola in tre fasi. Nella prima fase saranno arruolati più di mille pazienti provenienti da differenti regioni italiane che rappresentano un campione significativo di soggetti obesi e/o con "binge eating desorders" del nostro paese. Di questi pazienti verrà fatta una precisa caretterizzazione clinica.
Nella seconda fase verrà si otterra una ampia conoscenza delle varianti geniche del pathway del segnale melanocortinico e della loro rilevanza funzionale.
Saranno inoltre valutate in differente aree ceebrali di topi le variazioni dei livelli di BDNF e di ormoni del sistema ipotalamo-ipofisi-surrene in relazione a differenti modelli sperimentali (stress perinatale,oligonucleotidi antisenso)messi in atto nella prima fase.
Nell'ultima fase sarà valutata la correlazione genotipo fenotipo nei pazienti studiati e saranno analizzati i risultati ottenuti sui modelli animale.
Lo studio, infine, permetterà di migliorare le conoscenze sui fattori genetici (varianti geniche) e fattori ambientali (stress postnatale) capaci di predisporre all'obesità o al" binge eating disorder" attraverso l'alterazione del segnale melanocortinico. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Laura PERRONE Seconda Università degli Studi di NAPOLI

Obiettivo del Programma di Ricerca

L'obiettivo generale dell'intera ricerca può essere considerato lo studio, nel modello animale e nell'uomo, dei meccanismi attraverso i quali alterazioni del pathway metabolico del sistema melanocortinico siano implicate nel determinismo dei disturbi del comportamento alimentare e dell'obesità. I risultati di questo studio potrebbero fornire indicazioni utili per nuove strategie terapeutiche basate su un più razionale approccio farmacologico.Più di 1000 pazienti con alterazioni del comportamento alimentare e/o obesità sia bambini che adulti saranno studiati. Essi appartengono a differenti regioni italiane, infatti sia il nord che il centro e sud Italia sono rappresentati in questo studio.
Si ritiene che lo studio permetterà di individuare un notevole numero di varianti non note dei geni dell'asse melanocortinico.
Obiettivi più specifici sono:
1) Determinare quale sia la reale prevalenza di mutazioni dell'MC4R allorché la ricerca venga effettuata in un gruppo di bambini ed adolescenti obesi reclutati sulla base di particolari carateristiche cliniche ed in un'ampia serie di adulti con obesità severa iniziata in età precoce (età di esordio > 10 anni).
2) Identificare alcuni aspetti, fino ad oggi non riconosciuti, del fenotipo in bambini ed adolescenti, così come in adulti con mutazioni dell'MC4R. In particolare verranno studiati il metabolismo glicidico mediante il test da carico orale di glucosio e sarà esaminata la composizione corporea mediante bioimpedenziometria.
3) Determinare la reale prevalenza delle mutazioni a carico dell'MC4R in un gruppo di adolescenti ed adulti affetti da " binge eating disorder".
4) Caratterizzare dal punto di vista funzionale ogni eventuale variante allelica trovata onde precisarne il reale ruolo patogenetico.
5) Determinare la reale prevalenza del polimorfismo Arg236Gly del POMC negli stessi gruppi di pazienti (bambini ed adolescenti con obesità ad esordio precoce, adulti con obesità severa ed adolescenti ed adulti affetti da "binge eating disorder").
6) Meglio precisare il fenotipo dei soggetti con polimorfismo Arg236Gly del POMC.
7) Studiare se variazioni dell' Actractin-like-protein (ALP) possano essere considerate fattori predisponenti all'obesità ad esordio precoce o al binge eating disorder.
8) Studiare in modelli animali (topi) l'effetto di uno stress postnatale ripetuto sia sul sistema del segnale melanocortinico che, in particolare sulla concentrazione del Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF)un importante metabolita attraverso il quale il segnale melanocortinico regola il bilancio energetico. <<<

Risultati parziali attesi

Dopo questa fase ci aspettiamo di aver arruolato più di mille pazienti (500 nell'Unità di Ricerca di Napoli, 350 nell'Unità di Ricerca di Pavia e 250 nell'Unità di Ricerca di Pisa) con obesità grave o con binge eating disorder. Il loro fenotipo sarà stato accuratamente investigato. Inoltre saranno stati effettuati gli esperimenti preventivati (stress durante le prime settimane di vita)sui topi da laboratorio.Dopo questa fase noi ci aspettiamo di aver individuato numerose varianti nei geni coinvolti nell'asse melanocortinico. Inoltre noi ci aspettiamo di avere caratterizzato dal punto di vista funzionale tutte le nuove varianti del gene MC4R e di avere individuato nuove varianti del gene ALP. Inoltre, la reale incidenza della mutazione al livello del codone 236 del gene POMC sarà individuata nella popolazione studiata. I livelli di BDNF e degli ormoni dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene saranno valutati su omogenati di cervelli provenienti da topi sottoposti a stress in epoca neonatale.Dopo questa fase noi ci aspettiamo di aver effettuato una analisi completa del rapporto genotipo-fenotipo (anche tenendo conto della caratterizzazione funzionale delle varianti individuate) e di avere completamente analizzato i risultati ottenuti sul modello animale. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il continuo incremento della prevalenza dell'obesità, ed in particolare dell'obesità ad esordio precoce, osservato in molti paesi, ha senza dubbio un impatto negativo sullo stato di salute della popolazione e di conseguenza sulla spesa pubblica (1). E'noto che l'obesità è una malattia multifattoriale, infatti, le differenze interindividuali relative all'adiposità sono certamente una conseguenza dell'interazione tra fattori ambientali e genetici (2). Il modello di studio meglio conosciuto e probabilmente più sensibile per quantificare la componente genetica della variabilità fenotipica tra gli individui (ovvero l'ereditarietà di un dato fenotipo) è lo studio di gemelli monozigoti separati alla nascita. Questi studi suggeriscono che il tasso di ereditarietà della quantità di massa grassa si aggira intorno al 40-70 % a seconda della età in cui è avvenuta la separazione e della lunghezza del follow-up (3, 4).
L’identificazione dei geni che regolano il comportamento alimentare e la quantità delle riserve energetiche, è stato oggetto di una intensa ricerca negli ultimi anni. L’isolamento del gene OB ha condotto alla scoperta della leptina, proteina secreta dagli adipociti, che fornisce informazioni al sistema nervoso centrale sulla quantità di energia (sotto forma di lipidi) immagazzinata a livello adiposo.
L’identificazione del locus agouti e l’individuazione del suo meccanismo di azione hanno permesso di individuare un ulteriore pattern di vie neuronali, denominato sistema delle melanocortine, che sembra svolgere un ruolo importante nella regolazione dell’appetito e del metabolismo energetico. Il sistema delle melanocortine comprende i neuroni che producono la pro-opio-melanocortine (POMC), il neuropeptide Y (NPY), l’antagonista melacortinico agouti-related protein (AGRP) e infine, a valle, i recettori 3 e 4 melanocortinici (MC3R e MC4R) che legano un derivato melanocortinico, l’alfa MSH. In particolare il gene che ha suscitato il maggiore interesse scientifico è quello che codifica per l’isoforma 4 del recettore melanocortinico. Il gene del recettore MC4R è localizzato sul cromosoma 18 e codifica per una proteina di 332 aminoacidi con sette domini trans-membrana, associata alle proteine G. Il recettore MC4R è espresso a livello di molteplici regioni del sistema nervoso centrale, in particolare a livello del nucleo paraventricolare dell’ipotalamo. Il coinvolgimento dei peptidi melanocortinici nel controllo dell’appetito nell’uomo è stato per la prima volta dimostrato in due pazienti con mutazioni inattivanti del gene POMC, i quali presentavano iposurrenalismo (da deficit di ACTH), obesità ad insorgenza precoce (durante il primo anno di vita) e colore rosso dei capelli. Le melanocortine (ACTH, alfa, beta, gamma MSH) hanno noti effetti fisiologici a livello della corticale del surrene (ACTH) e dei melanociti (MSH) ma sono anche coinvolti nella regolazione dell’equilibrio energetico, nell’apprendimento e nella memoria, nella regolazione del sistema cardiovascolare, nella termoregolazione, nella analgesia.
Recentemente è stato descritto un gruppo di obesità monogeniche dovute a mutazioni di molecole coinvolte nel controllo dell'omeostasi energetica (5). Alcune mutazioni sono associate ad obesità essenziale grave ad esordio precoce ed a particolari caratteristiche cliniche, neuroendocrine e biochimiche riconducibili all'alterazione della funzione delle molecole coinvolte . Mutazioni sul gene della leptina (6), del recettore della leptina (7), della proopiomelanocortina (POMC) (8), del neuropeptide Y del "cocaine and amphetamine regulated transcript (CART)" (9), e dell' enzima proormone convertasi 1 (PC-1) (10), benché estensivamente ricercate sono state riscontrate in pochi pazienti al mondo.
La leptina, sintetizzata dal tessuto adiposo, agisce a livello ipotalamico, stimolando la sintesi e la secrezione del POMC (11).
Studi sui roditori hanno dimostrato che l'a-MSH sopprime il senso di fame interagendo col suo recettore melanocortin 4 receptor (MC4R). I topi knock-out per il gene MC4R presentano obesità, iperisulinemia grave e un incremento della lunghezza; i topi eterozigoti mostrano un fenotipo intermedio se paragonato con i topi omozigoti knock-out e con i topi wild-type (12). Numerose mutazioni del gene MC4R sono state identificate in diversi gruppi etnici (13-19). Tenendo presente tutti i dati pubblicati è possibile affermare che circa il 3-6% dei pazienti obesi, con obesità ad esordio precoce, presenta mutazioni causali sul gene codificante l'MC4R.
L'esatto contributo delle differenti variazioni dell’ MC4-R nella patogenesi dell'obesità e la loro prevalenza nei diversi gruppi etnici è ancora oggetto di controversia.
Alcuni studi di coorte hanno dimostrato un'associazione tra mutazioni del gene umano dell’MC4-R ed obesità, ma la prevalenza di tali mutazioni patogenetiche varia tra 0.5 e 5.8 % . Le discrepanze tra i diversi dati di prevalenza può dipendere dalla valutazione di differenti gruppi etnici. Tuttavia, anche all'interno della popolazione italiana, la prevalenza di mutazioni MC4-R nei soggetti obesi varia da < 0.5 a Napoli a quasi il 2 % a Pisa. In alternativa, differenti criteri di selezione del gruppo di studio (intervallo di body mass index, età di esordio dell'obesità, età al momento dell'arruolamento, presenza di co-morbilità) potrebbero costituire fattore di confusione nella valutazione della reale prevalenza delle varianti genetiche dell’ MC4-R nella popolazione.
Data questa prevalenza relativamente elevata, i pazienti portatori di mutazioni a carico dl gene MC4R rappresentano un sottogruppo interessante per una ulteriore caratterizzazione, sia per una maggiore comprensione dei meccanismi che sottendono il comportamento alimentare che per una futura apertura alla farmacogenomica finalizzata ad individuare una terapia medica. Recentemente Farooqui e coll. hanno caratterizzato attentamente il fenotipo dei soggetti portatori di mutazioni su MC4R (20). Essi presentano iperfagia ed iperinsulinemia (più marcata nei pazienti con età inferiore a 10 anni), una densità ossea superiore alla media, ed una velocità di crescita accelerata rispetto ai controlli di pari indice di massa corporea (BMI). I livelli di leptina, i livelli di lipidi, la funzione surrenalica, il metabolismo basale, la funzione tiroidea e quella riproduttiva sono nella norma. La capacità di trasdurre il segnale nella proteina mutata, come determinato da studi funzionali, correlava con la severità del fenotipo. I soggetti portatori di mutazioni che compromettono il signaling presentano un BMI maggiore rispetto a soggetti portatori di mutazioni responsabili della ritenzione parziale della proteina. Ugualmente i soggetti omozigoti hanno un BMI maggiore dei soggetti eterozigoti. Queste osservazioni suggeriscono che il fenotipo dovuto a deficit di MC4R nell'uomo si trasmette con pattern autosomico codominante, come avviene nei modelli animali.
Già molto tempo prima della scoperta della leptina e dell'MC4R era noto che l'ipotalamo fosse coinvolto nella fisiologia del comportamento, in particolare nella regolazione della fame e della sazietà. Il bilancio energetico e l'introito calorico totale sono regolati da neuropeptidi ipotalamici. Branson e coll. (21) hanno studiato il gene codificante l'MC4R in circa 500 soggetti con obesità grave. Gli autori diagnosticarono il binge-eating disorder (BED) in tutti i soggetti portatori di mutazioni sull’ MC4R, ma solo nel 14.2% dei controlli. Il BED è una diagnosi contemplata nel Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders quarta edizione, ed è caratterizzato da episodi ricorrenti (due o più a settimana) di iperfagia e sensazione di mancanza di controllo.
Queste evidenze, benché differenti rispetto a dati precedenti (22), sembrano indicare un meccanismo molecolare nella genesi di una malattia del comportamento alimentare e potrebbero esser d'aiuto nell'introdurre un punto di riferimento da cui differenziare fattori causali da epifenomeni, permettendo un approccio terapeutico basato sulla somministrazione di farmaci, quali gli agonisti dell' MC4R.
Queste osservazioni sembrano implicare un meccanismo molecolare nella genesi del disturbo del comportamento alimentare.
Un'ulteriore cautela riguarda necessariamente l'interpretazione del significato di queste mutazioni. Tre di queste mutazioni (Val 103Ile, Ile251Leu e Thr112Met), che insieme rendono conto delle anomalie molecolari identificate nei tre quarti dei probandi dello studio, sono, secondo altri, responsabili di piccole modificazioni o di nessun effetto sulle proprietà di segnale dell’ MC4-R e hanno frequenze simili in obesi e controlli normopeso. In questo contesto è molto importante caratterizzare funzionalmente ogni nuova variabile allelica. Per poter eventualmente stabilire il ruolo patogenetico della mutazione.
Tuttavia, la possibilità che MC4-R sia ragionevolmente un gene candidato nel disturbo del comportamento alimentare rimane ancora oggetto di dibattito. La dimostrazione di un effetto funzionale anomalo da parte della mutazione rappresenta l'anello mancante tra geni e comportamento. Quindi, sebbene diventi sempre più chiaro come il sistema melanocortinico ed altri neuropeptidi ipotalamici controllino la quantità di cibo che mangiamo, sono necessarie ulteriori indagini per stabilire il ruolo di MC4-R nel determinismo della quantità che noi mangiamo in una sola volta.
L'importanza del pathway delle melanocortine nel regolare il comportamento alimentare è stata ulteriormente avvalorata dall'identificazione di una mutazione missenso ( Arg236Gly) presente in eterozigosi sul gene codificante la proopiomelanocortina che annulla un sito di clivaggio tra beta-MSH e beta-endorfina (23). Questa mutazione è stata trovata in circa lo 0.9% di bambini con obesità grave ad insorgenza precoce e nello 0.2 % di soggetti normopeso. Studi funzionali hanno dimostrato che questa variante risulta nella formazione di una proteina di fusione con un'affinità per l'MC4R identica a quella dell'alpha-MSH, ma con una ridotta capacità di attivare il recettore. Questi dati suggeriscono che mutazioni che comportano la sostituzione dell'arginina in posizione 236 possano conferire una suscettibilità ereditaria all'obesità attraverso un nuovo meccanismo consistente nella formazione di una proteina in grado, legando l'MC4R, di impedire l'interazione tra alpha-MSH ed il suo recettore. Il comportamento alimentare e le caratteristiche cliniche dei pazienti con questa mutazione non sono stati studiati in dettaglio.
E'ora ampiamente accettato che variazioni anche modeste nel numero di molecole MC4R espresse o nella capacità di trasdurre il segnale possono compromettere il controllo dell'appetito determinando lo sviluppo di obesità. Alla luce di queste evidenze è ragionevole pensare che un ruolo cruciale nell'ambito del comportamento alimentare possa essere giocato anche da una proteina scoperta di recente: attractin-like protein (ALP). Haqq e collaboratori (24) hanno recentemente dimostrato che la regione C terminale della ALP (residui 1280-1317) interagisce direttamente con la porzione C- terminale dell'MC4R (residui 303-313). Inoltre la porzione intracellulare C-terminale dell'MC4R contiene un sito che può essere fosforilato dalla chinasi A e che gioca un ruolo nella internalizzazione del recettore in seguito al legame con l'agonista, suggerendo un ruolo potenziale dell'ALP nel trafficking di MC4R. Infine è stato anche osservato che cellule che esprimono l'MC4R, in alcune regioni del cervello coesprimono anche l'ALP, come ad esempio avviene nel nucleo paraventricolare dell'ipotalamo. Tutti questi dati suggeriscono che l'ALP possa essere importante nel pathway delle melanocortine ed inducono ad ipotizzare che mutazioni sull'ALP possano rappresentare un nuovo pezzo nell'intricato puzzle della genetica dell'obesità (25)
Diversi lavori indicano che anche il Brain Derived Neutrophic Factor (BDNF) ha un ruolo nella regolazione del comportamento alimentare.
Fenotipi obesi sono stati osservati in topi BDNF eterozigoti e in topi in cui il gene per il BDNF era stato deleto nei neuroni eccitatori nel cervello. La somministrazione di BDNF sia centrale che periferica riduce l'assunzione di cibo, aumenta il dispendio energetico e migliora l'iperinsulinemia e l'iperglicemia nei topi diabetici db/db. Tuttavia, il meccanismo con cui il BDNF altera il bilancio energetico rimane sconosciuto. Lo stato del bilancio energetico viene trasmesso all'ipotalamo attraverso segnali neuronali ed ormonali. Numerosi nuclei ipotalamici sono coinvolti nella regolazione del bilancio energetico, tra i quali il ventromediale (VMH) il paraventricolare (PVN) il nucleo arcuato (ARC) e l'area ipotalamica laterale (LH). Benchè l'osservazione che lesioni bilaterali del VMH possano produrre iperfagia ed obesità ha fatto ritenere che questa regione intervenga nella regolazione del bilancio energetico, i meccanismi neuronali attraverso cui il VMH influenza il bilancio energetico non sono ancora chiari. Recentemente è stato dimostrato che l'MC4R controlla l'espressione del BDNF nel VMH, supportando un modello in cui le funzioni del BDNF costituiscono un importante effettore attraverso cui MC4R regola il bilancio energetico (26). <<<