RICERCA ITALIANA     

Determinanti genetici e molecolari del ruolo della COX-2 nell'aterotrombosi.

Università degli Studi "G. d'Annunzio" Chieti-Pescara

Abstract

La ciclossigenasi-2 (COX-2) svolge un ruolo primario sia nella disfunzione endoteliale, primus movens dell'aterosclerosi, che nella rottura della placca aterosclerotica, evento finale della malattia aterosclerotica.
Nella disfunzione endoteliale, un ruolo critico è svolto dal diminuito rilascio di ossido nitrico (NO) endoteliale; di conseguenza, mediatori che alterino il rilascio di NO possono favorire la disfunzione endoteliale. Uno di essi è la COX-2, che può ridurre la sintesi di NO tramite un aumento dello stress ossidativo. Ciò è confermato dal fatto che l'inibizione della COX-2 è in grado di ripristinare la normale funzione endoteliale. Diversi sistemi enzimatici possono modulare la suscettibilità allo stress ossidativo COX-2-dipendente. Infatti, la proteina p66Shc regola la risposta allo stress ossidativo, ed una delezione di p66Shc si associa ad un'aumentata resistenza allo stress ossidativo.
Tuttavia, il ruolo della COX-2 nella parete vasale è più complesso. Infatti, essa può esercitare effetti sia pro- che anti-aterogeni, a seconda del tipo di cellula e di prostaglandina (PG) da essa generata. Infatti, la COX-2 nelle cellule endoteliali (EC) forma PGI2 anti-aterogena. In particolare, ciò è vero in presenza di lipoproteine ad alta densità (HDL)3, che inducono il rilascio di PGI2 ma non di PGE2 pro-aterogena.
Oltre a svolgere un ruolo nell'omeostasi dell'endotelio, la COX-2 è coinvolta anche nella progressione della placca aterosclerotica verso la rottura. Infatti, nelle placche la COX-2 modula l'attività dei macrofagi (Mf). I Mf sintetizzano le metalloproteinasi (MMP), enzimi di degradazione della matrice della placca. Il rilascio di MMP dipende dall'attività sequenziale di COX-2 e PGE sintasi (mPGES-1). Pertanto, i mediatori implicati nella modulazione di COX-2 sono target ottimali di intervento terapeutico per la stabilizzazione di placca. In tal senso, l'Angiotensina (Ang) II è uno stimolo per l'espressione di COX-2, e può regolare nei Mf l'attività delle MMP PGE2-dipendenti tramite i recettori AT-1. Alla luce di ciò, il gruppo del prof. Cuccurullo ha mostrato che il blocco dei recettori AT-1 promuove la stabilizzazione della placca aterosclerotica nell'uomo. Tuttavia, non è noto se l'asse Ang II-COX-2/mPGES-1 sia operativo anche a livello delle EC, e se possa quindi mediare la disfunzione endoteliale indotta dall'Ang II.
Inoltre, l'attività di COX-2 può essere modulata anche da enzimi che competono con essa per lo stesso substrato, l'acido arachidonico. In particolare, l'aumentata espressione del Fatty Acid CoA Ligase (FACL)4 riduce la biosintesi di PGE2 del 55%. Tuttavia, nessuno studio ha ancora esaminato l'espressione del FACL4 nei diversi tipi di placca (stabile vs instabile).
Infine, un importante quesito ancora da chiarire è se polimorfismi della COX-2 possano modulare la funzione endoteliale.
Pertanto, in questo progetto, noi intendiamo perseguire quattro principali obiettivi:
1. Esaminare il ruolo del FACL-4 nel controllo degli eventi COX-2 dipendenti nelle placche aterosclerotiche umane.
2. Caratterizzare i meccanismi di "signaling" intracellulare coinvolti nella suscettibilità al danno ossidativo COX-2-dipendente.
3. Investigare come l'espressione della COX-2 indotta da HDL3 influenzi la produzione di eicosanoidi anti-aterogenici.
4. Verificare se la COX-2 sia uno dei meccanismi con cui l'Ang II induce alterazioni vascolari.
Quattro Unità di Ricerca lavoreranno per lo stesso Progetto di Ricerca. Il Progetto mira ad analizzare aspetti diversi degli eventi metabolici che inducono l'aterosclerosi, dalla disfunzione endoteliale all'instabilità di placca:
1. Regolazione a monte dell'espressione della COX-2, esaminata dall'Unità #4.
2.Regolazione competitiva dell'attività della COX-2, esaminata dall'Unità #3
3. Meccanismi di protezione dal danno da COX-2, studiati dall'Unità #2
4. Vie di regolazione che orientano selettivamente in senso anti-aterogenico l'attività della COX-2, indagate dall'Unità #1. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Franco CUCCURULLO Università degli Studi "G. d'Annunzio" CHIETI-PESCARA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Questo progetto è focalizzato su differenti linee di ricerca nell'ambito della patologia cardiovascolare.
È stato dimostrato che l'infiammazione svolge un ruolo primario nella cascata di eventi che sfocia nell'erosione della placca aterosclerotica. Tale stato infiammatorio è più evidente nelle placche sintomatiche che presentano un maggiore infiltrato di macrofagi (Mf) e di linfociti T, e la stessa fissurazione è influenzata dal grado di infiammazione piuttosto che dalla morfologia della lesione o dall'entità della stenosi. È stata dimostrata un'aumentata espressione di MMP, enzimi in grado di degradare gli elementi costitutivi della placca, proprio nei Mf infiltrati nella regione più vulnerabile della lesione instabile. Poiché l'aumento di MMP potrebbe essere responsabile della rottura della placca, è fondamentale conoscere il meccanismo di regolazione della loro produzione per l'individuazione di strategie mirate alla stabilizzazione della lesione. La produzione di MMP può essere inibita dai metaboliti della PGD2 sia tramite l'attivazione del Recettore attivato dal Proliferatore perossisomiale (PPAR)-gamma che attraverso l'inibizione di NF-kB. La via enzimatica interessata coinvolge la COX-2, espressa nei Mf delle lesioni aterosclerotiche umane, che catalizza la conversione dell'acido arachidonico (AA) a prostaglandina (PG)H2 che viene ulteriormente metabolizzata dalla PGES e dalla PGD-sintasi (PGDS) nei due prostanoidi PGE2 e PGD2. L'aumentata espressione di COX-2 potrebbe essere un passaggio fondamentale nella produzione di MMP nei Mf delle placche instabili, e i sistemi coinvolti nella sua regolazione sembrano essere i target ideali per testare l'ipotesi infiammatoria dell'instabilità di placca. È ipotizzabile che l'effetto finale di COX-2 nell'induzione del danno aterosclerotico sia strettamente dipendente dall'attivazione selettiva della isomerasi prevalente a valle. Infatti, se la presenza di PGES è responsabile dell'induzione delle MMP nei Mf, al contrario la prevalenza di PGDS o PGI sintasi (PGIS) può avere effetti protettivi ed è noto che le HDL3 possono indurre selettivamente quest'ultima via. L'individuazione delle vie responsabili di tale effetto sul metabolismo dell'AA rappresenta una tappa fondamentale per il disegno di future strategie di intervento. Inoltre, sistemi enzimatici competitivi con COX-2 per l'utilizzo di AA come substrato potrebbero rappresentare un importante meccanismo di controllo dell'output infiammatorio. In tal senso, il "Fatty Acid CoA ligase" (FACL)4 converte l'AA nell'estere arachidonoil CoA, riciclandolo nei fosfolipidi di membrana, e sottraendolo quindi al metabolismo di COX-2. É interessante la recente dimostrazione che l'induzione di FACL4 in concomitanza con l'aumentata espressione della COX-2 è in grado di ridurre la biosintesi in vitro della PGE2 fino al 55% rispetto a quando viene sovraespressa solo COX-2. Tuttavia, nessuno studio ha ancora esaminato l'espressione del FACL4 nel tessuto aterosclerotico, né è stato valutato il ruolo del FACL-4 nella fisiopatologia dell'instabilità COX-2-dipendente della placca aterosclerotica. È da tempo noto che l'aumentata produzione di radicali liberi dell'ossigeno (ROS) ha un ruolo causale nell'innescare il processo aterosclerotico danneggiando la parete vasale, tramite l'attivazione di NF-kB. Infatti i ROS promuovono l'adesione monocitaria ed il danno endoteliale. Le cellule endoteliali della parete vasale esprimono costitutivamente la NO sintasi (eNOS) e producono NO, regolatore del tono vasale che utilizza come effettore NF-kB. È probabile che in vivo possa attuarsi un'alterazione dell'omeostasi dell'NO secondaria ad aumentato stress ossidativo, e che ciò possa condurre alla progressione della lesione ed alla sua instabilità. È stato evidenziato che uno dei meccanismi responsabili di tale disfunzione endoteliale è proprio l'anomala attività della COX, che attraverso un processo non ancora ben caratterizzato, è in grado di causare stress ossidativo alterando la produzione di NO. In linea con questa ipotesi, l'inibizione di questo enzima può ripristinare la normale funzione endoteliale. Infine, è stata dimostrata un'aumentata espressione di COX-2 proprio quando le cellule sono soggette ad aumentato stress ossidativo suggerendo un feedback diretto tra le due condizioni.Questo ruolo dello stress ossidativo indotto dalla COX-2 nella patogenesi del danno aterosclerotico suggerisce l'importanza dei sistemi anti-ossidanti nella difesa dell'endotelio ed infine anche nella stabilizzazione di placca. Infatti, in segmenti di aorta si è dimostrato che l'alterazione del rilasciamento endotelio-dipendente puo' essere corretta dal blocco non selettivo di COX o dagli antagonisti recettoriali di PGH2/TXA2 come anche dalla superossido dismutasi (SOD), scavenger di O2-, indicando che sia i prostanoidi vasocostrittori che le specie reattive dell'ossigeno (ROS) inducono la disfunzione endoteliale. Inoltre, nei pazienti con NIDDM e IDDM la vitamina C migliora la vasodilatazione endotelio-dipendente nel circolo dell'avambraccio. Cosentino e col. hanno recentemente dimostrato come la presenza di antiossidanti è in grado di ristabilire l'equilibrio tra formazione di NO e ROS. É ormai accettato che la modulazione dello stato ossido-riduttivo cellulare ed il suo coinvolgimento nel danno tissutale si realizza attraverso l'espressione di proteine regolatrici che promuovono o si oppongono all'attività dei ROS. É un dato recente che la proteina p66Shc regola la risposta allo stress ossidativo: topi mutanti con una delezione selettiva del gene p66Shc mostrano un' aumentata resistenza allo stress ossidativo associata ad un aumento del 30% della vita media rispetto agli animali di controllo.
Ci sono quindi forti evidenze riguardo meccanismi di regolazione di geni critici per l'induzione del danno endoteliale e della destabilizzazione di placca. Questi sistemi comprendono la regolazione delle vie enzimatiche che utilizzano l'acido arachidonico, la modulazione della COX-2 e del sistema a valle PGES/PGIS, l'omeostasi del sistema ossidante/antiossidante intravasale, il bilancio tra PGI2 ed NO.
In questo progetto di ricerca, noi intendiamo perseguire 4 obiettivi maggiori:
1.Identificare nuovi target molecolari per la modulazione farmacologica della risposta infiammatoria, gelatinolitica e proliferativa indotta dalla COX-2, nel seguente ambito cellulare e clinico:
Ruolo del FACL4 nel controllo degli eventi correlati al bilancio pro- e anti-infiammatorio, all'equilibrio tra produzione e degradazione della matrice extracellulare, ed alla proliferazione cellulare ed apoptosi in modelli umani di malattia cardiovascolare aterosclerotica.
2.Caratterizzare i determinanti genetici e molecolari degli effetti vascolari individuali dell'attività della COX-2 integrando la quantificazione degli obiettivi funzionali con lo studio del polimorfismo genetico di COX-2, con la misurazione della loro attività, dello stato infiammatorio e ossidativo e della disfunzione endoteliale nei seguenti contesti sperimentali:
a. Inibizione selettiva di COX-2
b. Inibizione selettiva di PGES
c. Riduzione dell'espressione di COX-2 in presenza del polimorfismo -765 G>C.
3. Esplorare nuove strategie terapeutiche di prevenzione della malattia aterosclerotica basate su modelli animali di delezione selettiva del gene p66Sh in condizioni sperimentali e cliniche caratterizzate dalla presenza di stress ossidativo, induzione di COX-2 e infiammazione cronica.
4.Identificare nuovi target molecolari per la modulazione farmacologica della risposta infiammatoria nella parete vasale nel seguente paradigma cellulare e clinico:
Ruolo delle HDL3 e delle vie enzimatiche da esse modulate nel controllo degli eventi correlati al bilancio pro- e anti-infiammatorio di COX-2, all'equilibrio tra produzione di PGI2 e ROS, alla proliferazione cellulare ed apoptosi in modelli animali e cellulari di danno endoteliale. <<<

Risultati parziali attesi

Studi sulla disfunzione endoteliale.
È previsto che in questo periodo di studio di 12 mesi sarà identificato e reclutato un numero di pazienti con vari profili di rischio cardiovascolare sufficiente ad ottenere un adeguato potere statistico. La dimensione del campione è stata determinata dall'analisi della potenza, dove la potenza = 0.95 e α = 0.05. Abbiamo stimato i valori medi dei parametri analizzati basandoci su dati precedentemente pubblicati dall'Unità #4, e assumendo che tra i gruppi dei pazienti con differente profilo di rischio ci siano differenze del 25% rispetto ai diversi markers di funzione endoteliale. La stima della differenza nei marker molecolari è stata sempre una valutazione conservativa.

Studi sull'instabilità di placca.
È previsto che in questo periodo di studio di 12 mesi sarà identificato e reclutato un numero di pazienti con placche aterosclerotiche carotidee sintomatiche e asintomatiche sufficiente ad ottenere un adeguato potere statistico. La dimensione del campione è stata determinata dall'analisi della potenza, dove la potenza = 0.95 e α = 0.05. Abbiamo stimato i valori medi dei parametri analizzati basandoci su dati precedentemente pubblicati dall'unità 3, ed assumendo che tra i gruppi dei pazienti sintomatici e asintomatici ci siano differenze che vadano dal 30% al 60% rispetto ai diversi marker molecolari La stima della differenza nei marker molecolari è stata sempre una valutazione conservativa.

Studi su animali.
Nel modello animale di iperglicemia, il trattamento con una singola dose di streptozotocina (STZ) porterà alla distruzione delle cellule beta pancreatiche e di conseguenza ad una condizione di iperglicemia cronica sia su topi knock-out p66Shc-/- che sui controlli wild-type di 12-16 settimane e sesso maschile.
Nel protocollo di studio su Ang II e danno vasale, il trattamento cronico con Ang II porterà ad un danno vascolare tipico dell'ipertensione arteriosa nei modelli di controllo, ed a lesioni minori (secondo l'ipotesi di studio) nel modello genetico di topo che presenta un deficit omozigote di mPGES-1.
Dopo 4 settimane, in tutti i protocolli i topi verranno anestetizzati con una somministrazione intraperitoneale di 50 mg/Kg di pentobarbital e poi sacrificati. Le aorte ed i piccoli vasi di resistenza saranno isolati e congelati, fissati in paraffina o utilizzati nella seconda fase del progetto in base ai diversi protocolli di studio.Ci si attende che le attività di ricerca impegnate nel primo obiettivo consentano l'identificazione di nuovi target molecolari alternativi alla COX-2, che potrebbero influenzare processi infiammatori fondamentali correlati all'evoluzione delle lesioni aterosclerotiche verso l'instabilità, senza alterare i potenziali effetti secondari anti-infiammatori dovuti all'induzione della COX-2 in presenza di alti livelli di PGDS.
Le attività di ricerca incluse nel secondo obiettivo consentiranno di identificare i meccanismi coinvolti nel controllo della reattività vascolare nell'uomo nel contesto di vari profili di rischio cardiovascolare. Queste attività di ricerca condurranno ad una migliore definizione del profilo rischio/beneficio dei farmaci inibitori della COX già esistenti. In particolare, l'accurata definizione dei meccanismi alla base della regolazione della reattività vascolare da parte dei derivati dell'acido arachidonico potrebbe avere un impatto significativo sul Sistema Sanitario Nazionale Italiano dato l'ampio numero di pazienti in trattamento con i FANS convenzionali e con i coxibs. D'altra parte, la caratterizzazione dei determinanti genetici delle risposte individuali terapeutiche ai coxibs potrà condurre ad una migliorata tollerabilità, ottimizzando questa nuova strategia terapeutica in aree come l'ipertensione e le malattie coronariche.
Le attività di ricerca comprese nel terzo obiettivo consentiranno di identificare i meccanismi molecolari responsabili della disfunzione endoteliale nel diabete e di esplorare target molecolari alternativi per prevenirne l'insorgenza. Lo studio delle interazioni fra i geni e l'ambiente redox come determinanti della risposta individuale a questi mediatori molecolari costituirà la base di partenza per la progettazione di farmaci efficaci e con minimi effetti collaterali. In particolare, gli studi sulla disfunzione endoteliale indotta da iperglicemia nei topi p66Shc-/- resi diabetici potrebbero consentire di considerare l'inibizione farmacologica della proteina p66Shc come un nuovo approccio terapeutico per la prevenzione dello sviluppo e della progressione delle complicanze cardiovascolari nel diabete.
Infine, ci si aspetta che le attività di ricerca comprese nell'ultimo obiettivo consentano di individuare i meccanismi tramite i quali la COX-2 indotta dalle HDL influenza la produzione e l'attività degli eicosanoidi in vitro ed in vivo. Questo consentirà di generare lipoproteine ricostituite in grado di mimare l'attività delle HDL sulla via COX-2/PGIS. I risultati di questo studio potrebbero aprire nuove prospettive nel trattamento farmacologico dell'aterosclerosi mediante interventi selettivi sul profilo delle lipoproteine circolanti. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

1. Ruolo della via della PGH-sintasi nel metabolismo dell'acido arachidonico.
L'acido arachidonico (AA; 20:4, n-6) è un acido grasso essenziale polinsaturo dalla cui ossidazione vengono generati prostanoidi e leucotrieni, denominati "eicosanoidi". Quando i tessuti sono esposti a diversi stimoli, fisiologici e patologici, l'AA viene liberato dai fosfolipidi di membrana e convertito ad opera della PGH sintasi (PGHS), nota anche come cicloossigenasi (COX), in prostanoidi come le prostaglandine e il trombossano (TX)A2. Le due attività catalitiche di questo enzima bifunzionale, ciclossigenasica e idroperossidasica, portano alla formazione sequenziale degli intermedi endoperossidi instabili PGG2 e PGH2. Quest'ultimo a sua volta viene trasformato in PGD2, PGE2, PGF2alfa, PGI2 e TXA2 ad opera di isomerasi e sintasi cellulo-specifiche. Dal 1991 sono state identificate due isoforme di PGHS, note come COX-1 e COX-2. Entrambe sono ancorate alla membrana come dimeri ed hanno un'alta omologia strutturale. L'AA si lega al sito attivo della COX tramite un canale idrofobico che può essere bloccato da farmaci che si legano in modo reversibile o irreversibile a residui in posizioni strategiche. La COX-1, espressa costitutivamente in molti tessuti dell'organismo, svolge un ruolo fondamentale nell'aggregazione piastrinica e nella citoprotezione gastrica. La COX-2 invece è indotta durante il processo infiammatorio, nella riparazione cicatriziale e nella trasformazione neoplastica, ed è espressa costitutivamente nel rene e nel cervello umano. I prostanoidi esercitano i loro effetti in modo autocrino (sulle cellule di origine) e paracrino (su cellule vicine) legandosi a recettori transmembrana accoppiati con la proteina-G del tipo della rodopsina. Inoltre, sono stati descritti vari meccanismi d'azione nucleare ed è stata ipotizzata la presenza di recettori nucleari dei prostanoidi, in particolare delle PG ciclopentenoniche (CyPG). Il livello delle isomerasi che convertono la PGH2 nei vari prostanoidi è diverso nei vari organi e tessuti. Inoltre, l'esistenza di diverse isoforme degli enzimi a monte e a valle della cascata dell'AA, come evidenziato per le fosfolipasi (PLA2) e le PGE sintasi (PGES), complica gli effetti di potenziali farmaci aventi come target il metabolismo dell'AA. Nell'ultimo biennio, dati sperimentali hanno consolidato il concetto della co-espressione funzionale di PLA2, COX e PGH isomerasi. Secondo questo modello, la biosintesi basale di PGE2 coinvolge prevalentemente le attività enzimatiche costitutive di cPLA2, COX-1 e di una isomerasi citosolica della PGES (cPGES). In presenza di stimoli che promuovono l'induzione della COX-2 e della isomerasi inducibile della PGES (mPGES-1), la sintesi di PGE2 dipende dalla co-espressione di questi due enzimi e di cPLA2. Infine, quando l'esposizione agli stimoli si prolunga nel tempo, avviene il coinvolgimento dell'isoenzima inducibile sPLA2 che crea un ciclo di amplificazione per bilanciare la disponibilità di AA con le aumentate capacità biosintetiche della COX-2 e della mPGES-1.

2. Ruolo della COX-2 e delle PGH-isomerasi nelle malattie cardiovascolari.
La prevalenza di uno specifico prostanoide rispetto ad un altro è il risultato dell'espressione e dell'attività della sua specifica isomerasi; solo la co-espressione degli enzimi COX-2 e PGES può condurre ad un aumentato stato infiammatorio e proliferativo che può portare alla rottura della placca aterosclerotica. Esistono due isoforme di PGES. La PGES citosolica (cPGES) è espressa costitutivamente ed è importante per la regolazione cellulare fisiologica; la mPGES, invece, presente a bassi livelli in condizioni basali, viene indotta da un ampio range di stimoli infiammatori e mitogenici nelle cellule nucleate, e questo suggerisce il suo coinvolgimento nella sintesi di PGE2 e metalloproteinasi PGE2-dipendenti nelle sindromi infiammatorie vascolari.


3.Ruolo della via metabolica della COX-2 nella stabilità di placca.
Un ruolo chiave nei meccanismi della progressione della lesione aterosclerotica è svolto dalle modificazioni ossidative della componente lipidica delle lipoproteine a bassa densità (LDL) migrate nel subendotelio. I lipidi ossidati a loro volta inducono una risposta infiammatoria cronica, modulata dai monociti/macrofagi. L'occlusione trombotica di un vaso coronarico o cerebrale può complicare l'improvvisa fissurazione o rottura di una placca e provocare rispettivamente l'infarto del miocardio o l'ictus ischemico. Forti evidenze dimostrano che l'infiammazione svolge un ruolo chiave nella cascata di eventi metabolici che portano alla rottura della placca aterosclerotica. Infatti, l'infiammazione è più evidente nelle placche sintomatiche, caratterizzate da un maggior infiltrato di Mf e di cellule T, e la rottura di placca è influenzata dal grado di infiammazione piuttosto che dalla morfologia della lesione o dal grado di ostruzione vasale. I macrofagi sintetizzano le MMP, enzimi litici dei costituenti di placca, e nei macrofagi delle regioni vulnerabili delle placche instabili è stata dimostrata un'aumentata espressione delle MMP. Quindi, poiché l'aumento localizzato delle MMP può provocare la rottura della placca, la conoscenza delle vie che regolano la loro produzione è fondamentale per identificare strategie di stabilizzazione della lesione aterosclerotica. Il rilascio delle MMP da parte dei macrofagi è mediato da una cascata enzimatica PGE2-dipendente, mentre invece può essere inibito dai metaboliti della PGD2 con meccanismi dipendenti dal PPARgamma e da NF-kB. In particolare, è stato dimostrato che la COX-2 è espressa nei macrofagi delle placche aterosclerotiche umane e la sua aumentata espressione potrebbe avere un ruolo chiave nella sintesi di MMP nei macrofagi delle lesioni instabili. Dunque gli inibitori selettivi della COX-2 sembrano essere tools farmacologici adeguati a testare l'ipotesi infiammatoria dell'instabilità di placca. In accordo con questa ipotesi, il gruppo del Prof. Cuccurullo ha dimostrato che le placche carotidee sintomatiche umane presentano un'aumentata espressione degli enzimi COX-2/PGES e MMP. Inoltre, anche la PGDS può essere coinvolta nella modulazione della stabilità di placca (Cipollone et al, ATVB, in revisione): infatti, il 15d-PGJ2, metabolita della PGD2 e potente agonista del PPAR-gamma, può esercitare effetti anti-infiammatori come la soppressione della COX-2 e della MMP-9. Pertanto, stimoli in grado di modificare il rapporto PGE2/PGD2 nei macrofagi di placca potrebbero esercitare profondi effetti sulla stabilità della lesione, e la loro identificazione può essere fondamentale per lo sviluppo di strategie preventive ottimali.

4. Ruolo di altri enzimi metabolizzanti l'AA nel controllo dell'attività pro-infiammatoria di COX-2 nella placca aterosclerotica.
È interessante notare che l'acido arachidonico, oltre ad essere metabolizzato dalla ciclossigenasi e dagli altri enzimi di ossidazione dell'acido arachidonico (lipossigenasi e citocromo P450), può essere il substrato di un altro enzima, noto come FACL4, uno dei membri della famiglia delle acil-CoA sintetasi (o ligasi). Questo enzima svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo degli acidi grassi, in quanto catalizza la formazione dei tioesteri acil-CoA, importanti substrati per la beta-ossidazione, la biosintesi dei fosfolipidi e le vie di segnale cellulari. Nei mammiferi sono state clonate cinque isoforme del FACL, ognuna con una diversa specificità di substrato e distribuzione tissutale. Tra queste, il FACL4 è l'isoforma con la più alta selettività per l'acido arachidonico e lo converte nell'estere arachidonoil CoA, riciclandolo nei fosfolipidi di membrana, e sottraendolo quindi alla metabolizzazione da parte di altre vie enzimatiche. Alla luce di ciò, è estremamente interessante la recente dimostrazione che l'induzione del FACL4 in concomitanza con l'aumentata espressione della COX-2 è in grado di ridurre la biosintesi in vitro della PGE2 fino al 55% rispetto a quando viene sovraespressa soltanto la COX-2. Tuttavia, nessuno studio ha ancora esaminato l'espressione del FACL4 nel tessuto di placca aterosclerotica, né è stato valutato il ruolo potenziale del FACL-4 nella fisiopatologia dell'instabilità COX-2-dipendente della placca aterosclerotica.

5. Inibizione della COX-2 e funzione endoteliale: dalla selettività biochimica al riscontro clinico.
Modelli animali geneticamente ipertesi e pazienti affetti da ipertensione essenziale sono caratterizzati da disfunzione endoteliale e ridotta disponibilità di ossido nitrico (NO). Questa alterazione causa un invecchiamento precoce della parete vasale e promuove la patogenesi dell'aterosclerosi. È stato dimostrato che uno dei meccanismi responsabili della disfunzione endoteliale è l'attività patologica della COX-2 che, tramite meccanismi poco noti, causa stress ossidativo e un'alterata regolazione di NO. Pertanto, la funzione endoteliale può essere ripristinata inibendo la COX-2. È stato anche dimostrato che in condizioni di stress ossidativo l'espressione della COX-2 aumenta, suggerendo la presenza di un sistema di regolazione a feedback positivo. Tuttavia, non è ancora noto se lo stress ossidativo indotto dalla COX-2 sia causato dall'attività intrinseca dell'enzima o sia mediato dai prostanoidi tramite l'azione su specifici targets. Poiché è stata dimostrata una forte correlazione tra induzione della COX-2 e sintesi di PGI2, valutata dal livello dei suoi metaboliti, è stato ipotizzato che il blocco selettivo della COX-2 endoteliale possa essere dannoso in pazienti con rischio cardiovascolare, poiché la COX-2 è la principale fonte di PGI2 endoteliale. Tuttavia, altri dati suggeriscono che l'induzione della COX-2 nelle cellule endoteliali attivate possa contribuire alla biosintesi di TXA2 insensibile all'aspirina in pazienti con angina instabile. Quindi, il ruolo della COX-2 nelle cellule endoteliali può avere un diverso significato nelle varie fasi della malattia aterosclerotica.

6. Meccanismi molecolari di controllo della COX-2.
I meccanismi molecolari attraverso cui vari stimoli, ad esempio le lipoproteine ad elevata densità (HDL) 3, inducono la COX-2 non sono stati ancora completamente chiariti. L'espressione della COX-2 è modulata da diversi fattori di crescita e citochine attraverso l'attivazione della via delle protein chinasi "mitogen-activated" (MAPKs). Una volta attivate, le MAPKs modulano l'attività di diversi fattori trascrizionali tra cui CREB, NFAT, AP-1, NF-kB che sono coinvolti nell'espressione di COX-2. Le HDL3 attivano due delle principali cascate chinasiche coinvolte nell'espressione genica di COX-2: ERK1/2 e p38 MAPK. L'attivazione di ERK1/2 può avvenire attraverso il recettore SP1 in modo HDL-dipendente in cellule astrogliali, ma esiste la possibilità che l'attivazione delle MAPK sia legata alla deplezione di colesterolo dalla membrana plasmatica. In supporto a questa ipotesi, Smith et al. ha dimostrato che l'incremento della concentrazione di LDL o di colesterolo libero diminuisce l'espressione della COX-2 e la sintesi di PGI2. Poiché le HDL favoriscono l'efflusso di colesterolo dalle cellule, il bilancio del colesterolo intracellulare può svolgere un ruolo importante nel determinare i livelli di COX-2. Le HDL3 attivano anche CREB in modo tempo-dipendente; CREB si lega infatti al CRE e funge da ancora per l'interazione di P300 con gli elementi transattivatori a monte e con l'apparato trascrizionale a valle, suggerendo così l'importanza del CRE nell'induzione della COX-2 da parte di numerosi stimoli. Mediante transfezioni transienti, il gruppo del Prof. Catapano ha recentemente dimostrato che, mutando il CRE, viene abrogata l'attività luciferasica indotta da HDL3, confermando così il ruolo del CRE nell'espressione genica della COX-2 indotta da HDL3. Tuttavia, l'inibizione di p38MAPK è responsabile dell'induzione di COX-2 mediata da HDL3. Poiché la p38MAPK svolge anche un importante ruolo nel mantenimento della stabilità dell'mRNA della COX-2, il gruppo del prof. Catapano ha recentemente investigato la stabilità dell'mRNA di COX-2 in cellule stimolate con HDL3. La simultanea aggiunta di actinomicina D e SB 203580 alle cellule ha provocato una più rapida diminuzione dell'mRNA della COX-2 rispetto alla sola actinomicina D, suggerendo così un ruolo di stabilizzazione dell'mRNA esercitato dalle HDL3.
7. Determinanti genetici del danno vasale indotto da COX-2.
In aggiunta ai meccanismi di controllo dell'espressione genica a livello trascrizionale e post-trascrizionale, l'attività della COX-2 può essere anche influenzata da mutazioni funzionali a carico del gene responsabile del controllo dell'espressione o dell'attività. In particolare, recentemente è stata identificata una nuova variante del promoter della COX-2, denominata -765G>C. I pazienti con l'allele -765C hanno una ridotta attività del promoter e ridotti livelli plasmatici di proteina C reattiva, un marker sensibile di infiammazione di grado lieve, rispetto ai pazienti omozigoti per il -765G. Poiché una ridotta attività della COX-2 potrebbe avere come diretta conseguenza una ridotta produzione di MMP all'interno della placca aterosclerotica, è stata considerata la possibilità che la variante -765G>C possa proteggere gli individui dall'instabilità della placca. Dati in corso di pubblicazione (Cipollone et al, JAMA 2004) indicano che i pazienti portatori dell'allele -765C presentano un ridotto rischio di sviluppare un infarto del miocardio ed un ictus cerebrale. Tuttavia, al momento attuale rimane ancora da valutare se questo polimorfismo genetico possa svolgere un ruolo nel modulare anche la funzione endoteliale e se sia in grado di regolare l'effetto acuto e cronico dei COX-2 inibitori sulla funzione endoteliale. In aggiunta all'impatto diretto di mutazioni a carico del gene COX-2 sul relativo output proinfiammatorio e pro-ossidante, è ormai accettato che la modulazione dello stato ossido-riduttivo cellulare ed il suo coinvolgimento nel danno tissutale si realizza attraverso l'espressione di altre proteine regolatrici che promuovono o si oppongono all'attività dei ROS. A questo riguardo è stato riportato recentemente che la proteina p66Shc regola la risposta allo stress ossidativo. Topi mutanti con una delezione selettiva del gene p66Shc mostrano una aumentata resistenza allo stress ossidativo associata ad un aumento della vita media del 30% rispetto agli animali wild-type di controllo. Tuttavia, non è ancora noto se l'inattivazione della proteina p66Shc sia protettiva contro la disfunzione endoteliale, in particolare quando indotta da iperglicemia. <<<