RICERCA ITALIANA     

ISOLAMENTO, CARATTERIZZAZIONE E DIFFERENZIAMENTO DI CELLULE STAMINALI DA POLPA DENTARIA UMANA

Seconda Università degli Studi di Napoli

Abstract

La capacità, da parte dell'organismo umano, di sostituire le cellule danneggiate, al fine di conservare la sua integrità, è affidata ad un pool di cellule indifferenziate, virtualmente residenti in ogni tessuto Tali cellule, definite "staminali", possiedono inoltre la capacità di differenziarsi in citotipi diversi, oltre a quello del tessuto da cui provengono e possono venir prelevate sia da organismi allo stadio embrionale che adulto.
La ricerca proposta ha come obiettivo l'isolamento, la caratterizzazione, il differenziamento e la successiva ingegnerizzazione tissutale di cellule staminali ottenute da polpa dentaria umana.
Attualmente un solo centro di ricerca, sito negli Stati Uniti d'America (dr. Gronthos, NIH) si occupa di tale argomento, con risultati incoraggianti.
Partendo dai dati della letteratura internazionale a carattere generale sulle cellule staminali e da quelli del centro di ricerca che ha già ottenuto risultati su tali cellule, tenendo anche presente che saggi preliminari sono stati da noi effettuati con risultati altrettanto incoraggianti, mediante la ricerca proposta si cercherà di:
-ottenere un numero sufficiente e ben selezionato di elementi staminali da polpa dentaria proveniente sia da denti decidui che permanenti e porli in coltura per il differenziamento;
-caratterizzare le cellule sia mediante appositi anticorpi monoclonali per le cellule di tipo staminale sia, successivamente, selezionarle al FACscan onde ottenere la massima purificazione citotipica possibile; in aggiunta elementi staminali verranno dapprima posti in pozzetti singoli per la loro "clonazione", sempre al fine della loro "purificazione e selezione";
-una volta ottenuto un numero sufficiente ed una buona selezione si potrà porre in essere una banca delle cellule staminali da polpa dentaria umana, da conservare in azoto liquido;
-successivamente si procederà al "committement" delle stesse in senso primariamente osteogenetico, a mezzo di fattori di stimolazione appropriati e crescita delle cellule su polimero polilattico-glicolico, in apparato di rotazione a bassa velocità, così da ottenere un tessuto con caratteristiche tridimensionali;
-inoltre si tenterà di ottenere una "conversione" in vitro di tutte le componenti del parodonto (gengiva, cemento, legamento alveolo dentale) ed, in aggiunta, si accerterà un loro possibile differenziamento sia in senso miogenico che adipocitario;
-sarà infine tentata una "conversione" in vivo mediante innesto di cellule ingegnerizzate, osservandone l'eventuale capacità di riparazione di tessuto danneggiato. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Fernando GOMBOS Seconda Università degli Studi di NAPOLI

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il progetto di ricerca proposto, partendo dai dati di letteratura internazionale e da nostri preliminari risultati in via di pubblicazione, si pone i seguenti obiettivi:
-isolare e coltivare cellule di polpa dentaria proveniente da denti decidui e permanenti, confrontandone le possibili differenze;
-isolare e caratterizzare dette cellule staminali così da poterle adoperare successivamente per il loro differenziamento:
a) in senso osteogenico mediante l'uso di un polimero lattico-coglicolico in un apparato di rotazione a bassa velocità, ciò al fine di ottenere un tessuto idoneo a futuri reimpianti ossei;
b) per la ricostruzione dei costituenti parodontali, sfruttando la loro potenzialità di differenziare in elementi mesenchimali;
c) realizzare una banca delle cellule staminali umane della polpa dentaria come riserva di cellule potenzialmente utilizzabili in terapia.

Obiettivo a)realizzare colture in vitro di cellule staminali della polpa dentaria umana, proveniente sia da denti permanenti che decidui o da germi dentari, adeguatamente isolate.
L'obiettivo si concretizzerà, dopo l'isolamento nell'indurne la proliferazione, nella successiva caratterizzarle mediante anticorpi monoclonali e citometria a flusso con cell sorter e nell'indurne la differenziazione in senso osteogenico e dentinogenico. A tal fine saranno adoperati fattori osteoinducenti nonchè un particolare apparato rotativo (roller apparatus) in grado di determinare una ricostruzione tridimensionale del tessuto.

Obiettivo b) Impiego delle cellule staminali isolate dalla polpa dentaria per la ricostruzione dei costituenti parodontali.
La perdita di supporto del dente consegue ad una serie di gravi alterazioni che riguardano i costituenti del parodonto (gengiva, cemento, legamento alveolo-dentale e osso alveolare), secondarie a svariate patologie, nell'insieme conosciute come "malattia parodontale". Tale patologia, nella sua forma più grave, provoca la perdita irreversibile del sostegno parodontale. In soggetti trattati con "terapia causale"e/o "terapia chirurgica", è di comune riscontro l'impossibilità di rigenerazione dell'attacco parodontale. Sarebbe pertanto utile poter disporre di precursori dei cementoblasti che, opportunamente differenziati in vivo o in vitro, possano ricostruire cemento, contribuire alla rigenerazione del legamento, contribuendo al riempimento del difetto osseo e, quindi, ripristinare il supporto del dente.

Obiettivo c) Realizzazione di una banca delle cellule staminali umane della polpa dentaria
Le cellule staminali presenti nella polpa dentaria coltivate come in Miura et al.2003 saranno fatte crescere a densità clonale ed i singoli cloni caratterizzati per FACS per l'espressione di marcatori di superficie come CD34, c-kit, CD-133 (marcatori di staminalità), CD-45, CD-31 e VEGF-R (marcatori endoteliali), STRO-1 e CD146 (marcatori precoci di cellule staminali mesenchimali).
Le cellule ottenute dalla polpa dentaria saranno separate tramite l'identificazione dei loro antigeni di membrana specifici. I singoli cloni verranno conservati in azoto liquido per essere disponibili. I cloni mantenuti in coltura, dopo essere stati tenuti ciclanti in coltura, saranno testati per misurare in modo quantitativo la loro capacità di conversione in diversi tipi istologici mesenchimali. <<<

Risultati parziali attesi

Al termine della prima fase di sperimentazione i risultati parziali attesi sono i seguenti:
- standardizzazione della tecnica di prelevamento della polpa dentaria a partire dalla sterilità del prelievo fino alla coltura che dovrà essere particolarmente prolungata nel tempo;
- standardizzazione della metodica di separazione e di coltura stessa ai fini di una corretta ed elevata proliferazione delle cellule;
-ottenimento di un adeguato numero di cellule staminali proliferanti anche mediante adeguata "clonazione" delle stesse;
-ottenimento di un adeguato numero di cellule staminali positive per anticorpi di staminalità al FACSorter;
-ottenimento quindi di una linea di cellule selezionate in quantità sufficiente ai fini del prosieguo della ricerca;
-ottenere la produzione di proteine tipiche dei fibroblasti quali il collagene (di tipo I e tipo III) o delle cellule del legamento parodontale come l'osteopontina e l'osteocalcina o la fosfatasi alcalina;
-individuare e selezionare queste cellule mediante clonazione;
-valutazione dell'effetto mitogenico e/o differenziativo di fattori di crescita su tali cellule;
- valutazione dell'induzione alla neoformazione di cemento con inserzione di fibre dello Sharpey grazie alle metodiche adoperate;
-osservazione dell'abilità di cellule ingegnerizzate, secondo modelli precedentemente utilizzati e da noi modificati in parte, al fine di migliorare l'efficienza dell'impianto dentario.Al termine della seconda fase di sperimentazione i risultati attesi sono i seguenti:
-per la realizzazione di una banca delle cellule staminali umane della polpa dentaria ci si attende una sufficiente quantità di popolazione cellulare positiva ai markers di staminalità adoperati. In tal modo, le cellule "clonate" saranno disponibili per essere conservate in azoto liquido.
Inoltre, i cloni mantenuti in coltura dovranno mostrare sia "quantitativamente" che "qualitativamente", capacità di conversione in diversi tipi istologici mesenchimali.

-per la CONVERSIONE "IN VITRO" ci si attende che le cellule staminali di polpa dentaria umana, trattate con sostanze stimolanti in apparato di rotazione, saranno effettivamente in grado di differenziarsi oltre che in tessuto osseo anche in costituenti parodontali (cemento, gengiva, legamento alveolo-dentale)ed eventualmente in muscolo ed adipe.
Ciò sarà dimostrato mediante l'uso di svariate tecniche che vanno dall'immunocitochimica in fluorescenza alla citofluorimetria, alle tecniche di istochimica, alla microscopia elettronica in trasmissione ed all'analisi degli acidi nucleici mediante PCR.

-per la CONVERSIONE "IN VIVO", dopo test di tumorigenicità, si dovrà osservare se le nostre cellule marcate con timidina C14 dimostreranno capacità rigenerativa. Pertanto si andrà in definitiva ad osservare se cellule iniettate partecipino alla riparazione del tessuto danneggiato. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La capacità di rigenerare tessuti è attribuibile ad un pool di cellule indifferenziate in grado di sostituire le cellule danneggiate al fine di garantire l'integrità dell'organismo.
Oggi è accertato che le cellule staminali contribuiscono in modo sostanziale a tale processo.
Cellule staminali possono venir prelevate sia da organismi allo stato embrionale, sia da organismi adulti. E' noto che cellule staminali totipotenti possono essere isolate dalla massa cellulare interna di un embrione: queste cellule staminali embrionali (ES) sono caratterizzate da una potenzialità replicativa praticamente illimitata e dalla capacità di dare origine a tutti i lineages cellulari dell' organismo [Potten & Loeffer, 1990]. L'utilizzo di tali cellule ES è limitato per ragioni etiche. La segregazione delle cellule embrionali in particolari foglietti germinativi durante la embriogenesi era considerato un evento duraturo definitivo. Si è a lungo ritenuto che, nell adulto, la sostituzione cellulare e la rigenerazione tissutale in quei tessuti ed organi che necessitano di rinnovamento, fosse dovuta alla limitata popolazione di precursori residenti nel tessuto stesso e competenti a differenziare in un unico senso, incapaci cioè di generare tipi cellulari di lineages differenti.
Recenti esperimenti hanno permesso di stabilire che nei tessuti adulti esistono popolazioni staminali con potenzialità differenziative non limitate al tessuto cui appartengono [Bianco & Cossu, 1999; Jackson et al., 1999; Lagasse et al., 2000; Clarke & Frisen, 2001; Donovan & Gearhart, 2001; Cossu & Bianco, 2003].
Le cellule staminali isolate da individui adulti hanno una potenzialità differenziativa minore ma il vantaggio di poter essere utilizzate nei trapianti autologhi. La fonte principale di cellule staminali da organismi adulti è, al momento, il midollo osseo in quanto dal suo stroma si possono facilmente ottenere cellule staminali mesenchimali (BMSC, Bone Marrow Stromal Cells). Le cellule staminali derivate dal midollo osseo possono dare origine ad una notevole varietà di tipi cellulari, ma l efficienza di differenziamento è molto bassa per le cellule che non appartengono al lineage emopoietico [Wagers et al., 2002]. Una altra fonte di cellule staminali sono le cellule staminali residenti nei diversi tessuti periferici. Le cellule staminali autologhe presenti nei tessuti periferici non sono facilmente isolabili da un individuo senza ledere il tessuto di partenza. Inoltre la possibilità di ottenerne una quantità significativa è un fattore limitante per il loro impiego.
Una fonte particolarmente interessante di cellule staminali mesenchimali è rappresentata dalle cellule staminali isolabili dalla polpa dentaria ottenuta da denti umani di adulti (DPSC, Dental Pulp Stem Cells) [Gronthos et al., 2000]. Di recente [Miura et al., 2003] è stato dimostrato che dalla polpa di denti decidui è possibile isolare cellule staminali multipotenti, di cui è stata dimostrata o suggerita la differenziazione in senso neuronale, adipocitico e odontoblastico (SHED, Stem cells from Human Exfoliated Deciduous teeth). Apparentemente il potenziale proliferativo delle SHED sarebbe molto superiore rispetto a quello delle DPSC.
Le cellule SHED mostrano sulla loro superficie le molecole STRO-1 e CD146 (MUC18), due marcatori precoci di cellule staminali mesenchimali già precedentemente individuati in BMSC e in DPSC. E' interessante notare che l'analisi immunoistochimica condotta su preparati di polpa dentaria ha permesso di stabilire che cellule STRO-1+ e CD146+ sono localizzate intorno ai vasi sanguigni, dando conforto all'ipotesi che le cellule staminali si localizzino nella parete vasale.
Le cellule staminali della polpa dentaria, in particolare le SHED, sono interessanti per diversi motivi: la facilità con cui questo tessuto può essere ottenuto da individui adolescenti o adulti; la varietà di lineages cellulari cui presumibilmente queste cellule possono dare origine, argomento ancora in larga parte da esplorare; l'osservazione che le SHED esprimono anche marcatori neuronali e gliali, una caratteristica messa in rapporto con l'origine della polpa dentaria dalle creste neurali. Probabilmente non è casuale che le stesse creste neurali siano delle strutture da cui derivano i più svariati tipi cellulari, tra cui neuroni, cellule pigmentate, fibre muscolari scheletriche e lisce, condroblasti, osteoblasti ed odontoblasti.
La polpa dentaria, per il suo contenuto in cellule staminali multipotenti, appare quindi un tessuto che presenta notevoli prospettive sia per la comprensione dei meccanismi di sviluppo delle strutture dentarie e, più in generale, di tutte le strutture associate allo splancnocranio, come anche per le potenziali applicazioni cliniche delle cellule staminali.
In ambito odontoiatrico a tutt'oggi non si possiede un materiale in grado di sostituire idoneamente i tessuti duri del dente. Una valida alternativa valida può venir fornita proprio dalle cellule staminali. Il protocollo terapeutico si fonda sull'utilizzo di tali cellule, prelevate dal soggetto stesso in cui esse verranno reimpiantate successivamente. Siffatta terapia potrebbe essere sfruttata in chirurgia oro-maxillo-facciale per la rigenerazione ossea (Abukawa H et al. 2003 ; Chen Fet al. 2002), mentre, in campo odontoiatrico, ne beneficierebbero soprattutto le tecniche conservatrici dentali.

L'osteogenesi o la dentinogenesi da parte delle cellule staminali in coltura, non procede nell'organismo donatore senza un veicolo che le sostenga come un "impalcatura" (scaffold) per un tempo sufficiente a favorire la vascolarizzazione di queste cellule e sostenerle poi durante le fasi di differenziazione (Bianco and Robey , 2001). Numerosi studi hanno segnalato infatti che l'osteogenesi non procede quando la sospensione di cellule staminali è iniettata semplicemente nel sottocute come sospensione cellulare o quando è legata ad un veicolo rapidamente riassorbito dall'organismo ospite (Kresbach et al.2002 ).
Pertanto appare assolutamente necessaria la presenza di un'intelaiatura organizzata tridimensionale alla quale le cellule staminali possano aderire e proliferare inizialmente in vitro e che le sostenga in vivo per un periodo abbastanza lungo al fine di assicurare la differenziazione e quindi l'osteogenesi. Tale aspetto, ripetesi, è di fondamentale importanza ai fini dell'utilizzazione clinica (impianto o reimpianto) del tessuto neoformato a partire da cellule staminali. <<<