RICERCA ITALIANA     

Epifillia come espressione della totipotenza cellulare: studio delle basi molecolari e citofisiologiche della competenza meristematica ed embriogenetica.

Università di Pisa

Abstract

La plasticità morfologica che caratterizza le piante ha consentitito l'evoluzione di meccanismi alternativi di sviluppo come la differenziazione ectopica sulle foglie di meristemi, embrioni o strutture fiorali (epifillia). In alcuni casi tali modelli di sviluppo possono anche modificare lo schema classico di accrescimento delle fanerogame basato sulla reiterata produzione dei fitomeri. Tra le peculiarità delle cellule vegetali è infatti rimarchevole la capacità di riprogrammare il loro stato di determinazione al punto da riacquisire l'enorme potenzialità dello zigote (totipotenza). Lo studio della totipotenza è rilevante ai fini della biologia dello sviluppo ma al tempo stesso ha anche notevoli ricadute applicative in floricoltura, nel vivaismo e nei programmi di miglioramento genetico.
In passato la potenzialità di sviluppo delle cellule vegetali è stata studiata su basi in buona parte empiriche, soprattutto attraverso le tecniche di coltura in vitro. Queste ultime hanno comunque permesso di chiarire come gli ormoni svolgano un ruolo essenziale nel modulare la morfogenesi in vitro.
Negli ultimi anni, lo studio della totipotenza è stato affrontato in modo più mirato utilizzando piante modello come Arabidopsis thaliana. E' stato così accertato che nella morfogenesi avventizia viene riattivata l'espressione di geni regolatori che in planta sono specifici per la competenza meristematica o per l'embriogenesi zigotica. E' emerso inoltre che esiste una complessa interazione di tipo reciproco tra l'attività di questi geni ed il contenuto endogeno degli ormoni.
Il quadro di informazioni che si delinea è comunque ancora incompleto e riteniamo che, per definirlo, possa essere interessante estendere le analisi anche alle specie che manifestano fenomeni di epifillia in vivo. Ciò consentirebbe da un lato di caratterizzare meccanismi di sviluppo atipici, come ad esempio il fillomero, assenti in Arabidopsis, e dall'altro, di studiare in un unico organo domini cellulari che esprimono un diverso livello di competenza senza la necessità di manipolazioni esterne.
Scopo principale del progetto è rispondere a tale esigenza studiando la totipotenza in due sistemi caratterizzati da un peculiare modello di sviluppo.
Il primo è la specie acaule Streptocarpus rexii, della famiglia delle Gesneriaceae, caratterizzata da uno sviluppo basato sui fillomeri e dalla presenza di tre differenti tipi di meristemi epifillici. Il secondo è il variante somaclonale EMB-2 dell'ibrido interspecifico Helianthus annuus x H. tuberosus che, all'interno della famiglia delle Compositae, rappresenta un caso unico a causa della spontanea differenziazione sulle foglie di embrioni somatici e germogli avventizi.
Il materiale sperimentale che proponiamo di utilizzare ha maggiori limitazioni operative rispetto a sistemi modello. Tuttavia le tre Unità di Ricerca hanno verificato che le principali indagini molecolari esposte possono essere eseguibili. Sulla base di quanto accertato in Arabidopsis, saranno pertanto isolati nei due materiali epifillici, i geni putativamente più interessanti per marcare a livello cellulare l'identità meristematica o embriogenica. L'indagine sarà estesa anche ai rispettivi geni regolatori, come ad esempio ASYMMETRIC LEAVES1 e PICKLE.
Successivamente verrà affrontato lo studio dei profili di espressione genica attraverso metodi di RT-PCR, "Northern blot" ed ibridazione in situ. Per il clone EMB-2 il ruolo dei geni selezionati potrà essere studiato anche mediante sovraespressione o silenziamento genico in piante trasformate. Parallelamente all'analisi dell'espressione genica, sarà valutata a livello cellulare la distribuzione dell'acido indolacetico e della zeatina con tecniche cito-istochimiche.
Nel complesso i dati ottenuti consentiranno di delineare le relazioni tra l'espressione dei geni candidati ed il contenuto endogeno di morfogeni durante l'induzione e l'ontogenesi delle strutture ectopiche permettendo di elaborare uno specifico modello. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Mauro DURANTE Università di PISA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Una prerogativa fondamentale dello sviluppo delle piante è l'accrescimento illimitato, determinato dall'attività mitotica di specifiche regioni cellulari quali i meristemi, destinati a proliferare per l'intero arco della vita e da cui si originano gli organi secondo uno schema di sviluppo regolare e reiterato. Alle due estremità dell'asse principale dell'embrione si formano, durante l'embriogenesi, gli apici meristematici apicali del germoglio e della radice (Sussex e Klerk, 2001). Lo sviluppo post-embrionale prevede la successiva formazione di altri meristemi che determinano ulteriori assi di sviluppo (Sussex e Klerk, 2001). A livello del periciclo si differenziano i meristemi da cui si originano le radici laterali mentre i meristemi all'ascella delle foglie, presiedono alla ramificazione del fusto principale. La localizzazione dei meristemi è una caratteristica, controllata geneticamente, fondamentale per definire il piano di sviluppo delle piante (Sussex e Klerk, 2001).
Tuttavia le piante esibiscono una enorme plasticità a livello morfologico come evidenziato in vivo dalle specie epifilliche nelle quali si sviluppano organi vegetativi e/o riproduttivi sulle foglie. In questi casi il classico piano di sviluppo basato sui fitomeri si modifica in misura più o meno sostanziale. Forme estreme, non convenzionali, sono per esempio le piante acauli del genere Streptocarpus dove si è evoluto un nuovo tipo di unità: il fillomorfo (Möller e Cronk, 2001).
In biologia vegetale lo studio dell'epifillia è interessante sotto diversi aspetti. Le analisi filogenetiche basate su piante epifilliche possono essere infatti utili per ottenere informazioni sull'evoluzione di nuove forme morfologiche nelle piante superiori (Möller e Cronk, 2001). Inoltre, l'epifillia può avere valore da un punto di vista ornamentale, giustificando il suo inserimento in specifici programmi di miglioramento genetico (Dole e Wilkins, 1999).
L'elevato potenziale morfogenetico alla base dei fenomeni di epifillia rende questo materiale vegetale particolarmente idoneo per studiare i fattori genetici e fisiologici che sono alla base del cambiamento di identità cellulare (Fambrini et al., 2001). Nelle piante le cellule differenziate possono riacquisire l'enorme capacità generativa dello zigote (totipotenza). La totipotenza è un fenomeno di interesse centrale con enormi ricadute sia nella ricerca di base che in quella applicata quali la propagazione clonale, l'induzione di variabilità somaclonale, la rigenerazione di piante aploidi e la trasformazione genetica (Jain, 2001). Lo studio della totipotenza nelle piante è stato affrontato fino ad oggi, soprattutto utilizzando la coltura in vitro di cellule differenziate. E' stato documentato da tempo che cellule somatiche isolate e coltivate in terreni sintetici possono perdere lo stato di differenziazione originario e riattivare il ciclo cellulare, determinando un "pattern" di sviluppo alternativo con la rigenerazione di nuove piante. L'esperienza in vitro dimostra che la morfogenesi avventizia può essere influenzata da innumerevoli fattori tra cui decisivi sono il tipo di espianto, lo stadio di sviluppo, il genotipo e soprattutto, la composizione ormonale dei terreni sintetici (Fehér et al., 2003).
Per esprimersi la totipotenza richiede un cambiamento di identità cellulare attraverso una profonda riprogrammazione dell'espressione genica che coinvolge specifici meccanismi epigenetici di controllo (Loidl, 2004). Recentemente lo studio dei processi di rigenerazione a livello molecolare hanno dimostrato che i medesimi geni che agiscono in vivo nella differenziazione e nell'attività dei meristemi possono avere un ruolo diretto anche nel determinare la rigenerazione in vitro (Takada e Tasaka, 2002). E' stato chiarito che l'espressione ectopica di geni che codificano per fattori di trascrizione necessari all'induzione e al mantenimento dei meristemi in vivo (come i geni homeobox di tipo KNOX), può essere sufficiente per l'organogenesi avventizia (Sinha et al., 1993); analogamente, genotipi deficienti nell'attività dei loro geni repressori (ad esempio, ASYMMETRIC LEAVES1) acquisiscono una considerevole potenzialità rigenerativa (Semiarti et al., 2001). Inoltre l'espressione ectopica di geni regolatori che intervengono nel controllo dell'embriogenesi zigotica (ad esempio, LEAFY COTYLEDON1) può indurre la differenziazione di embrioni somatici (Lotan et al., 1998). Molto interessanti sono stati gli studi che hanno valutato il "pattern" di espressione di geni implicati nello sviluppo durante le fasi che precedono la comparsa dei primi segnali di morfogenesi avventizia negli espianti in vitro (Teo et al., 2001; Cary et al., 2002).
A fronte di questa importante serie di dati sulla morfogenesi avventizia in vitro, permane una notevole carenza di informazioni sulla natura molecolare dei cambiamenti di identità cellulare relativi ai fenomeni di epifillia in natura.
Obbiettivo del presente programma è pertanto quello di studiare, in due sistemi vegetali epifillici, il pattern di espressione dei geni, individuati negli esperimenti su Arabidopsis thaliana e potenzialmente coinvolti nella determinazione del fenomeno dell'epifillia. In particolare cercheremo di stabilire quali sono le relazioni tra l'attività dei geni e l'accumulo di auxine e citochinine.
Le due piante scelte sono Streptocarpus rexii ed il variante somaconale EMB-2 dell'ibrido interspecifico Helianthus annuus x H. tuberosus. Il primo materiale è una specie acaule della famiglia delle Gesneriaceae con sviluppo su base fillomorfica, priva di un apice vegetativo e provvista di tre specifici meristemi ectopici a livello fogliare. Il clone EMB-2 è stato ottenuto dalla coltura in vitro di espianti fogliari di un ibrido interspecifico tra due specie non epifilliche: H. annuus ed H. tuberosus. La sua peculiarità consiste nella produzione in vivo ed in vitro, di embrioni somatici e germogli ectopici sulla superficie adassiale delle foglie in prossimità del picciolo e delle nervature (Fambrini et al., 2000). In ambedue le piante è stata accertata la possibilità di modificare la frequenza e la natura della morfogenesi avventizia attraverso trattamenti ormonali esogeni (Rosenblum e Basile, 1984; Fambrini et al., risultati non pubblicati). Inoltre in Streptocarpus rexii e nel clone EMB-2, si possono identificare a livello delle foglie settori citoistologici che esprimono un diverso stato di competenza cellulare. Pertanto, con riferimento ai meccanismi di base della totipotenza nelle piante, noi riteniamo che questo materiale vegetale possa essere utile per migliorare le conoscenze sulla complessa serie di relazioni che intervengono tra gli ormoni e l'espressione dei geni regolatori durante lo sviluppo.

Cary A.J., Che P., Howell S.H., 2002. Plant Journal 32: 867-877.
Dole J.M., Wilkins H.F., 1999. Floriculture. Principles and Species. Prentice Hall, New Jersey.
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Risultati parziali attesi

PRIMO ANNO

L'analisi genetica degli ibridi ottenuti dall'incrocio fra specie rosulate ed unifoliate del genere Streptocarpus dovrebbe chiarire il controllo genetico del carattere rosulata (Unità di Ricerca 3).

Le analisi morfologiche condotte in Streptocarpus rexii con l'utilizzo del microscopio elettronico a scansione e di quello ottico permetteranno di suddividere lo sviluppo del fillomorfo in diversi stadi caratterizzati da differenze morfologiche; inoltre sarà definita la zona del picciolo in cui compare il meristema e come da questo si origini la foglia. L'analisi delle sezioni del fillomorfo a diversi stadi di sviluppo fornirà un quadro completo degli eventi istologici durante la formazione del meristema e lo sviluppo del fillomorfo (Unità di Ricerca 3).

Clonaggio dei geni KNOX-like e ARP-like in Streptocarpus rexii con tecniche di PCR e valutazione del numero di copie mediante "Southern blot"; costruzione e "screening" di una libreria di cDNA da tessuti meristematici del fillomorfo (Unità di Ricerca 3).

Clonaggio dei geni coinvolti nella competenza meristematica (KNOX-like e ARP-like) ed embriogenica (LEC1-like e PICKLE-like) in Helianthus spp con tecniche di PCR. Determinazione mediante "Southern blot" del numero di copie di ciascun gene isolato (Unità di Ricerca 2).

Valutazione del livello di espressione dei geni isolati, nella fase iniziale del programma, in espianti di Helianthus annuus x H. tuberosus e in fillomorfi di Streptocarpus rexii mediante esperimenti di "Northern blot", RT-PCR competitiva e/o quantitativa e di ibridazione in situ (ISH). I risultati consentiranno di individuare tra i geni analizzati, quelli espressi in misura differenziale in relazione al tipo ed allo stadio di sviluppo morfogenetico. L'analisi ISH definirà peraltro i domini citoistologici di espressione dei geni putativi "markers" di eventi morfogenetici (Unità di Ricerca 1, 2 e 3).

Livelli endogeni di auxina e immunolocalizzazione della zeatina e dell'acido indolacetico (IAA). I risultati ottenuti dall'analisi di fillomorfi di Streptocarpus rexii prelevati a vari stadi di sviluppo e da espianti epifillici (EMB-2) e di controllo dell'ibrido interspecifico H. annuus x H. tuberosus, consentiranno di evidenziare eventuali alterazioni dei livelli endogeni di IAA e di individuare le cellule "target" e i domini cito-istologici dell'attività ormonale (Unità di Ricerca 1 e 2).

Trasformazione genetica dell'ibrido interspecifico Helianthus annuus x H. tuberosus utilizzando il gene HTKN1. Caratterizzazione delle piante transgeniche attraverso l'analisi dell'espressione del transgene, dei livelli ormonali endogeni e loro distribuzione nei tessuti trasformati. I risultati consentiranno di valutare se l'espressione ectopica di HTKN1 è in grado di indurre fenocopie del variante epifillico EMB-2. Le eventuali variazioni dei livelli endogeni (IAA) e/o distribuzione ormonali (zeatina ed IAA) permetteranno inoltre di valutare se la sovraespressione di HTKN1 modifica i livelli ormonali considerati (Unità di Ricerca 1 e 2).SECONDO ANNO

Caratterizzazione morfologica con microscopia ottica ed elettronica della risposta morfogenetica del clone EMB-2 in funzione della composizione ormonale e della quantità di saccarosio nei terreni di coltura (Unità di Ricerca 1 e 2).

L'analisi del clone EMB-2 prelevato dagli esperimenti in vitro dovrebbe consentire di verificare il tipo di "pattern" di espressione genica ("Northern blot", RT-PCR quantitava e/o competitiva e ISH) associato a ciascuna risposta indotta attraverso la manipolazione in vitro. Inoltre i risultati permetteranno di indagare il ruolo svolto dai singoli fattori (ormoni e/o zucchero) nell'attivazione e/o repressione di specifici geni coinvolti nella competenza organogenetica e/o embriogenica.
L'analisi in Streptocarpus rexii comprenderà alcuni dei geni fondamentali nel controllo dell'organizzazione del meristema caulinare appartenenti alle famiglie KNOX ed ARP e fornirà indicazioni sull'eventuale coinvolgimento di questi geni nell'epifillia di Streptocarpus rexii (Unità di Ricerca 1, 2 e 3)

Trasformazione genetica dell'ibrido interspecifico Helianthus annuus x H. tuberosus utilizzando i geni LEC1-like e/o HaSERK. Caratterizzazione delle piante transgeniche attraverso l'analisi dell'espressione del transgene, dei livelli ormonali endogeni e loro distribuzione nei tessuti trasformati (Unità di Ricerca 1 e 2). I risultati consentiranno di valutare se l'espressione ectopica di LEC1-like e/o HaSERK è in grado di indurre fenocopie del variante epifillico EMB-2. Le eventuali variazioni dei livelli endogeni e/o distribuzione ormonali (zeatina ed IAA) permetteranno inoltre di valutare il rapporto tra i suddetti geni e i due ormoni (Unità di Ricerca 1 e 2).

Il silenziamento genico di HTKN1, LEC1-like e/o dei loro rispettivi geni regolatori nell'ibrido interspecifico H. annuus x H. tuberosus consentirà di acquisire ulteriori informazioni sia sul ruolo dei geni isolati, sia nell'induzione e nell'espressione della totipotenza cellulare (Unità di Ricerca 1 e 2).

I risultati delle tre Unità di Ricerca saranno condensati in un modello per schematizzare le relazioni tra l'espressione dei geni considerati ed i livelli ormonali endogeni nell'ontogenesi dei meristemi ectopici delle specie epifilliche (Unità di Ricerca 1, 2 e 3). <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La biologia dello sviluppo delle piante differisce in misura sostanziale da quella degli animali. Nelle prime infatti, durante l'embriogenesi non si verificano fenomeni di migrazione cellulare e la capacità organogenica si protrae durante l'intera vita per effetto del mantenimento di cellule meristematiche da cui si originano tutti gli organi (ontogenesi ricorrente) (1).
Nell'organogenesi ricorrente solo le cellule periferiche entro l'apice vegetativo sono direttamente coinvolte nella costituzione dei primordi degli organi laterali. La loro reintegrazione deve essere continua e ciò avviene mediante un ristretto gruppo di cellule pluripotenti ubicate nella zona centrale dell'apice meristematico. Il meccanismo di controllo che assicura un accurato equilibrio tra la produzione di cellule destinate alla differenziazione e di quelle pluripotenti ha quindi un ruolo essenziale per lo sviluppo di una pianta (2,3).
L'unità fondamentale dello sviluppo di una pianta è il fitomero composto da un nodo, un internodo, una foglia ed una gemma ascellare, che viene reiterato. Questo schema generale è caratteristico di molte specie vegetali, ma in alcuni raggruppamenti sistematici, alla base dello sviluppo dell'organismo, troviamo unità differenti. Ad esempio, nelle forme acauli del genere Streptocarpus (subgenere Streptocarpus) l'unico organo può essere rappresentato da un cotiledone particolarmente sviluppato, dal quale, al momento induttivo, si differenzia uno scapo fiorale. L'altro cotiledone rimane vestigiale ed è importante sottolineare che non si individua un vero e proprio apice meristematico. L'estrema atipicità di questo schema di sviluppo ha reso necessario elaborare il concetto di una nuova unità di sviluppo: il fillomorfo. Esso comprende un componente foglioso, la lamina, con capacità di crescita continua e una struttura simile ad un picciolo, il petiolode, in grado di radicare. La regione morfogenetica del fillomorfo è la giunzione lamina-picciolo, dove si localizzano tre meristemi permanenti. Due di questi sono meristemi intercalari mentre il terzo, il meristema del solco, può presentare le proprietà di un meristema apicale. La ripetizione di fillomorfi conduce alla formazione di una struttura a rosetta.
L'analisi delle basi molecolari dell'attività del meristema è stata recentemente affrontata mediante lo studio di sistemi modello come l'Arabidopsis thaliana. I primi risultati ottenuti hanno evidenziato il ruolo di alcuni geni homeobox. Questi geni, implicati nella regolazione dello sviluppo in organismi animali e vegetali, codificano per proteine con un omeodominio che ha una regione conservata di tipo "helix-loop-helix-turn-helix" e una serie di aminoacidi basici in posizione N-terminale.
Relativamente allo sviluppo delle piante, sono fondamentali i geni KNOX ("KNOTTED-like homeobox") che appartengono alla super-classe TALE ("Aminoacid Loop Extension") caratterizzata dalla presenza di tre aminoacidi atipici situati tra la prima e la seconda alfa-elica (4). Le proteine codificate dai geni KNOX vengono suddivise in due classi sulla base della sequenza aminoacidica della terza alfa-elica dell'omeodominio. Questa suddivisione è correlata con il pattern di espressione e della funzione biologica. Infatti, soltanto la prima classe di geni KNOX è espressa nelle cellule meristematiche e la proteina codificata è un fattore di trascrizione necessario per mantenere indeterminato il destino cellulare (5). In Arabidopsis thaliana è stato dimostrato che l'espressione del gene SHOOTMERISTEMLESS (STM), attivato da CUP-SHAPED COTYLEDON (CUC), è indispensabile per la formazione dell'apice meristematico durante le prime fasi dell'embriogenesi. Viceversa entro l'apice, altri geni di classe 1 (come KNAT1, KNAT2 e KNAT6) hanno un "pattern" di espressione più periferico e precludono una precoce (e quindi impropria) differenziazione cellulare. Inoltre è stato dimostrato che l'attività del gene ASYMMETRIC LEAVES1 (AS1) reprime l'espressione di KNAT1, KNAT2 e KNAT6 (6) e ciò consente alle cellule di differenziarsi. AS1 e AS2 codificano per fattori di trascrizione di classe MYB-ARP ed è stato accertato che genotipi mutanti per questi loci hanno foglie di aspetto irregolare e lobato a seguito dell'espressione ectopica dei geni KNOX.
Un altro gene di tipo homeobox estremamente importante per l'attività meristematica è WUSCHEL (WUS). Infatti, alla base del meccanismo di omeostasi, che assicura il giusto bilanciamento tra cellule meristematiche in via di differenziazione e cellule che devono rimanere pluripotenti, esiste l'interazione molecolare dei trascritti del gene WUS e di quelli dei geni CLAVATA (CLV) (6). Il dominio cellulare di espressione del gene WUS è ristretta al centro di organizzazione dell'apice meristematico, una piccola zona centrale situata in stretta prossimità del gruppo di cellule pluripotenti che esprimono il gene CLV3. Sebbene ll destino delle cellule pluripotenti dipenda dall'attività di WUS, l'espressione di CLV3 attiva un circuito a "feed-back" negativo che coinvolge i prodotti dei geni CLV1 e CLV2 e che ha lo scopo di reprimere l'attività di WUS in corrispondenza del centro di organizzazione.
Oltre ai suddetti geni sono stati identificati anche altre categorie di geni coinvolti nel controllo del destino cellulare. Molto interessanti sono i geni implicati nella riprogrammazione epigenetica dell'espressione genica come ad esempio FASCIATA e PICKLE. Il primo agisce sul destino cellulare a livello meristematico, mentre il secondo interviene nella compentenza embriogenica a livello dell'embrione zigotico (7,8,9).
Il processo di differenziazione riduce la porzione di genoma soggetta a trascrizione e conduce a stati di determinazione cellulare, funzionali ai diversi organi maturi. Tuttavia il programma ontogenetico delle piante è flessibile e le cellule somatiche possono modificare con relativa semplicità il proprio destino attraverso processi di sdifferenziazione e riacquisizione del potenziale morfogenetico dello zigote (totipotenza) (10,11).
Questa abilità viene frequentemente osservata, in vivo od in vitro, durante i fenomeni di rigenerazione di nuove piante con una sostanziale modificazione del classico "pattern" di sviluppo (12). Un esempio rimarchevole è offerto dalle specie epifilliche in cui organi vegetativi, riproduttivi od embrioni somatici, si differenziano sulla lamina fogliare (13).
La totipotenza cellulare ha da sempre suscitato un grande interesse scientifico ed è stata studiata con vari approcci metodologici. Da tempo la principale tecnica utilizzata rimane la coltura in vitro (14). E' stato ben presto osservato che i processi di sdifferenziazione e di ripresa del ciclo cellulare sono facilmente ottenibili attraverso la coltura, su terreni sintetici, di cellule somatiche isolate (15). Relativamente all'induzione di morfogenesi avventizia, l'attenzione si è focalizzata sul ruolo esercitato dagli stimoli chimici esogeni (16). In particolare, a partire dai pionieristici studi di Skoog e Miller (17), è emerso il ruolo degli ormoni nei processi di organogenesi e di embriogenesi somatica. Ad esempio, le auxine sono di solito importanti per l'induzione dell'embriogenesi mentre la loro presenza può addirittura essere negativa ai fini della maturazione dell'embrione somatico (10,18). Le citochinine sono di norma correlate alla differenziazione di gemme avventizie e i genotipi con un elevato contenuto endogeno (19,20) o con una alta sensibilità (21-23), mostrano un significativo incremento della capacità organogenica. Per esempio, il mutante di Arabidopsis "high shoot-organogenic capacity" (hoc) ha un elevato potenziale morfogenetico, anche in assenza di un apporto ormonale esogeno (24). Si ritiene che il gene HOC sia coinvolto nel metabolismo delle citochinine e ciò probabilmente conduce ad un accumulo dell'ormone. Analogamente l'incremento della sensibilità alle citochinine attraverso l'espressione costitutiva del gene ARR1 induce l'ectopica proliferazione di apici meristematici sui cotiledoni di Arabidopsis (25). L'epifillia non è comunque necessariamente legata ad una alterata risposta alle citochinine infatti: sono stati descritti meristemi ectopici anche nel mutante "polycotyledon" (poc) di pomodoro che presenta un elevato trasporto polare delle auxine (26).
Oltre agli ormoni, altri fattori, come il tipo di espianto, il genotipo e lo stadio di sviluppo, possono essere fondamentali per l'induzione della totipotenza (27-31).
Recentemente lo studio della morfogenesi avventizia in vitro è stato affrontato anche a livello molecolare. E' stato così accertato che alcuni geni richiesti per la formazione dell'apice meristematico vegetativo possono essere espressi prima dell'apparente organizzazione di strutture morfogenetiche in segmenti radicali di Arabidopsis (21). In particolare, i geni CUC2, WUS, STM e CLV1 sono attivati durante l'incubazione degli espianti in terreno di rigenerazione addizionato con citochinine. Osservazioni analoghe sono state effettuate in Brassica, dove un gene KNOX di classe 1 (BROSTM) è espresso precocemente in risposta alla citochinina (32). Questi dati consentono di delineare a livello molecolare la relazione tra ormoni ed espressione di geni chiave per lo sviluppo delle piante.
E' stato inoltre dimostrato come specifiche mutazioni geniche possano influenzare la risposta morfogenetica di espianti coltivati in vitro. Sebbene gli espianti fogliari di Arabidopsis thaliana non esprimano potenzialità rigenerativa, mutanti deficienti nel gene ASYMMETRIC LEAVES, sono in grado di manifestare una significativa percentuale di rigenerazione, anche in assenza di ormoni esogeni (54). Considerando che il gene ASYMMETRIC LEAVES è un repressore dei geni KNOX di classe 1, il risultato è facilmente interpretabile. Un effetto opposto sulla morfogenesi in vitro è stata osservata quando la mutazione interessa attivatori genici dell'espressione dei geni KNOX (55).
Per quanto concerne la differenziazione degli embrioni somatici, numerosi dati sono stati riportati in letteratura a proposito della regolazione degli ultimi stadi dell'embriogenesi (33), mentre scarse sono le informazioni relative alle fasi d'induzione della competenza embriogenica. Fino ad ora, la serie di dati più consistente è stata raccolta sul gene SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR KINASE (SERK) che codifica per un recettore chinasico ricco in leucina ed il cui "pattern" di espressione può essere utilizzato per marcare a livello cellulare, lo stato di competenza embriogenica in diverse specie (34-39). Il coinvolgimento di geni di altro tipo è stato comunque verificato più volte. Ad esempio, in colture cellulari di carota, l'espressione del gene homeobox CHB2 è stata accertata a partire dalle prime fasi di allevamento, ma il suo livello aumentava in modo significativo soprattutto negli stadi globulari avanzati (33). Analogamente, i livelli di espressione del gene KNOX di classe 1 SBH1 aumentavano in modo rilevante durante la transizione da stadio a cuore a quello di torpedine, nel momento in cui i cotiledoni e i fasci provascolari erano determinati (40).
L'utilizzazione di embrioni zigotici immaturi di mutanti di Arabidopsis thaliana (pt e clv), caratterizzati dall'aumento di dimensione dell'apice meristematico vegetativo, ha suggerito che la presenza di un consistente gruppo di cellule meristematiche faciliti l'ottenimento di linee cellulari altamente embriogeniche (41). Tuttavia, esperimenti con mutanti deficienti nella differenziazione dell'apice meristematico caulinare (stm, wus e zwille - zll) hanno dimostrato che l'attività meristematica non è comunque indispensabile per ottenere embrioni somatici (42).
Possiamo quindi concludere che con la coltura in vitro di cellule somatiche sono state ottenute interessanti informazioni circa la natura fisiologica e molecolare della totipotenza vegetale (10,14,28,33,43-46). Al contrario, un numero molto più ridotto di dati è disponibile sui fenomeni di totipotenza associati alla formazione delle strutture morfogenetiche nelle specie epifilliche. Fino ad oggi sono state condotte soprattutto indagini a livello istologico sull'ontogenesi dei processi di epifillia (47-49) e, a livello fisiologico, sull'effetto degli ormoni o dei fattori ambientali (50,51). Per contro, significativa è la carenza di informazioni sulle basi molecolari della totipotenza cellulare nelle specie epifilliche o in piante caratterizzate da un "pattern" di sviluppo non convenzionale come ad esempio, nelle specie acauli di Streptocarpus.
Riteniamo che l'acquisizione di dati su questo argomento sia interessante sotto diversi aspetti. Lo studio della totipotenza è fondamentale nella biologia dello sviluppo, ma ha un grande valore anche per scopi più applicativi come la micropropagazione o la trasformazione genetica. Inoltre, la caratterizzazione dei geni coinvolti nel cambiamento del destino cellulare, può essere utile anche per l'ottenimento di piante di interesse ornamentale con una architettura modificata.
Negli ultimi anni, la trasformazione genetica con geni che codificano per fattori di trascrizione, ha suggerito che la riattivazione ectopica di specifici geni KNOX può essere sufficiente per fare acquisire una identità meristematica ad alcune cellule somatiche fogliari (52-58). Un fenotipo analogo è stato ottenuto attraverso l'aumento della biosintesi di citochinine mediante l'espressione costitutiva del gene ISOPENTENYL TRANSFERASE (IPTC) di Agrobacterium tumefaciens (59). Diversi autori hanno recentemente dimostrato che esiste una correlazione reciproca tra l'espressione di geni KNOX ed il livello endogeno dei principali ormoni (60-68).
La formazione di embrioni somatici epifillici è stata ottenuta attraverso l'espressione ectopica di fattori di trascrizione di natura diversa (come ad esempio LEC1, LEC2, BBM, WUS e AGL15) (69-73). Tuttavia, al momento non sappiamo se questi geni siano tutti espressi nella cellula uovo o nello zigote; è stato ipotizzato che la loro riattivazione in cellule somatiche sia da ricollegare al verificarsi di situazioni di stress (74).
Attraverso l'utilizzazione delle tecniche di trasformazione genetica nel sistema vegetale modello (non epifillico) Arabidopsis thaliana è stato dunque chiarito che un pattern alternativo di sviluppo può essere indotto attraverso l'espressione ectopica di geni che codificano per fattori di trascrizione (56), per la sintesi degli ormoni (59) o per recettori coinvolti nella trasduzione del segnale ormonale (25).
Tenendo presenti questi risultati riteniamo che sia particolarmente interessante rispondere ai seguenti quesiti:
I geni che in Arabidopsis possono indurre fenomeni di epifillia sono coinvolti anche nel cambiamento del destino cellulare osservato nelle piante che esprimono in vivo un pattern di sviluppo non convenzionale? Quali sono le relazioni tra l'espressione genica e i livelli endogeni di auxine e/o citochinine nelle specie naturalmente epifilliche?
Lo scopo del presente programma è quello di investigare, in due specie caratterizzate da un peculiare tipo di sviluppo, i principali aspetti molecolari ed ormonali correlati alla modificazione della competenza cellulare.
La prima specie scelta è Streptocarpus rexii perché estremamente atipica nel suo modello di sviluppo (sostituzione del fitomero con il fillomero).
La seconda è rappresentata dal somaclone variante EMB-2, ottenuto attraverso la coltura in vitro di espianti fogliari dell'ibrido interspecifico Helianthus annuus x H. tuberosus (75-76). Questo clone, a differenza dei parentali, è caratterizzato dalla proliferazione ectopica sulle foglie di embrioni e apici meristematici. <<<