RICERCA ITALIANA     

Sviluppo del seme nei cereali: nuovi approcci verso il miglioramento delle specie coltivate.

Università Cattolica del Sacro Cuore

Abstract

La ricerca sui cereali è concentrata principalmente su mais e riso, specie entrambe oggetto di studio in questo progetto. Il genoma del riso è stato completamente sequenziato e la specie è semplice da allevare ed è facilmente trasformabile. Il mais, alla semplicità della coltivazione e dell'esecuzione degli incroci, abbina la disponibilità di oltre 360.000 ESTs sequenziati, che rappresentano circa 30.000-50.000 geni, e una vasta mappa genetica. L' accesso a tutti questi dati permette lo sviluppo di approcci genomici per lo studio dello sviluppo del seme. Oltre dieci anni di studio su mutanti dello sviluppo nelle piante hanno permesso di comprendere i meccanismi coinvolti nella transizione dalla crescita vegetativa a quella riproduttiva, la determinazione dell'infiorescenza, del meristema fiorale, dell'identità degli organi florali e dello sviluppo del seme. Nonostante tutto è necessario identificare e analizzare più geni per ottenere un quadro generale dell'organizzazione e del funzionamento del seme nei cereali. Lo scopo di questo progetto è la conoscenza del controllo genetico dell'embrione e dell'endosperma durante il loro sviluppo come tappa cruciale per la ricerca sulla biologia del seme. La presente proposta di ricerca coinvolge tre gruppi che hanno acquisito una grande esperienza in tre distinti campi sullo sviluppo del seme nei cereali, in particolare: svilluppo dell'ovulo e inizio dello sviluppo del seme, sviluppo dell'embrione e dell'endosperma. Il progetto, tramite questi tre gruppi, copre i maggiori aspetti concernenti lo sviluppo dei semi nei cereali. Si propone l'integrazione di approcci di genetica classica con tecniche microgenomiche messe a punto recentemente. Verranno studiati in dettaglio mutanti di riso e mais; l'espressione genica in specifici tessuti del seme di piante wild type e mutanti; verrà elaborata una mappa funzionale dei geni di interesse. L'insieme di queste analisi permetterà la caratterizzazione dei geni implicati nei vari aspetti dello sviluppo del seme e dei percorsi metabolici in cui sono coinvolti. E' evidente che la presente proposta abbia come obiettivo iniziale la creazione di un network che integri alcuni ricercatori che studiano lo sviluppo del seme a livello universitario e quindi fornirsca una piattaforma tecnologica basata sulla combinazione della microdissezione laser e l'analisi trascrizionale con cDNA-AFLP. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Adriano MAROCCO Università Cattolica del Sacro Cuore

Obiettivo del Programma di Ricerca

Nel recente passato, c'è stato un rinnovato interesse nello studio dello sviluppo del seme. I cereali con semi persistenti ed economicamente rilevanti hanno attirato la maggior parte dell'attenzione ed è risultato chiaro che solo attraverso la caratterizzazione di nuovi fenotipi mutanti si potrà arrivare ad una approfondita comprensione delle basi dello sviluppo del seme.
In questo progetto si è scelto di lavorare con riso, la pianta modello per l'analisi genomica di tutti i cereali, e mais, una delle colture economicamente più importanti. Il mais, inoltre, rappresenta il sistema genetico meglio studiato e più trattabile. Una seria limitazione all'avanzamento nella ricerca di base ed applicata in mais, è la mancanza di una approfondita comprensione del contenuto e delle funzioni geniche del genoma. L'analisi genica funzionale aiuterà a chiarire le basi molecolari di caratteri agronomicamente importanti e di conseguenza faciliterà il miglioramento in mais ed in altre specie coltivate. Questi risultati agronomici avranno un forte impatto sulla popolazione attraverso il miglioramento della salute umana, l'aumento di produzione energetica e la protezione ambientale. La produzione di nuovi composti nelle piante aumenterà la richiesta di mais e di conseguenza apporterà benefici direttamente alla comunità agricola. La produzione di cibi ad alto contenuto nutrizionale, più sicuri e meno allergenici rispetto ai cibi attuali, apporteranno ulteriori benefici ai consumatore.
Lo scopo di questo progetto è la conoscenza del controllo genetico dell'embrione e dell'endosperma durante il loro sviluppo come tappa cruciale per la ricerca sulla biologia del seme. Gli obbiettivi scientifici più importanti di questa proposta di ricerca saranno la costruzione di una mappa genetica funzionale, l'isolamento e la caratterizzazione di nuovi geni che influenzano il processo di sviluppo dell'ovulo, la formazione del meristema apicale vegetativo e la determinazione cellulare dell' endosperma amilaceo. Il progetto include approcci genomici strutturali e funzionali. La genomica strutturale produrrà le mappe molecolari per stabilire la distribuzione di marcatori molecolari e di mutanti nel genoma del mais in modo da facilitarne il successivo clonaggio. Una strategia di genetica diretta basata sulla mutagenesi inserzionale sarà portata avanti sia in riso che in mais per identificare i fattori genetici che controllano gli stadi di sviluppo iniziali del seme. I risultati più importanti sono attesi dall'analisi del trascrittoma. La presente ricerca verrà focalizzata sui cambiamenti trascrizionali che hanno luogo nel seme di riso e mais durante lo sviluppo dell'ovulo, dell'embrione e dell'endosperma. I dati ottenuti nei tre tessuti verranno analizzati con lo scopo di identificare le modificazioni trascrizionali comuni e specifiche. L'analisi del profilo di espressione sarà portato avanti usando microarray di riso e l'analisi cDNA-AFLP. Si propone un progetto pilota nazionale per identificare i geni di cereali che controllano gli stadi precoci e tardivi dello sviluppo del seme. E' evidente che la presente proposta abbia come obiettivo iniziale la creazione di un network che integri alcuni ricercatori che studiano lo sviluppo del seme a livello universitario e fornisca una piattaforma tecnologica basata sulla combinazione della microdissezione laser e l'analisi trascrizionale con cDNA-AFLP.
Le fasi del progetto sono:
I. Caratterizzazione genetica, molecolare e funzionale di mutanti del seme indotti da trasposoni;
II. Mappe funzionali per mutanti difettosi dell'endosperma
III. Analisi istologica e cellulare durante le fasi iniziali della formazione del seme.
IV. Analisi dell'espressione genica usando aprocci di microgenomica. <<<

Risultati parziali attesi

Al termine dei due anni del progetto sono previsti i seguenti risultati:
- L'identificazione di marcatori AFLP ed SSR polimorfici e loro mappatura in mais;
- La mappa di 16 mutanti dello sviluppo dell'endosperma in mais;
- L'identificazione e il clonaggio molecolare di mutanti del meristema apicale indotti da trasposoni in mais;
- La caratterizzazione e il clonaggio molecolare di mutanti da inserzione osmads13 e osmads21 in riso;
- La caratterizzazione funzionale, a livello istologico e del profilo di espressione, di mutanti embrione specifici (emb) di mais;
- La determinazione del profilo di espressione genica nel mutante dell'endosperma de-18 di mais;
- La determinazione del profilo trascrizionale nei primordi degli ovuli in riso;
- L'identificazione del profilo di espressione nei primordi degli ovuli di mutanti osmads13 e osmads21 di riso;
- L'analisi dell'espressione di OsMADS21 di riso mediante in situ hybridization;
- Il profilo di espressione su microarray nei primordi degli ovuli di riso;
- L'applicazione della microdissection laser microscopy in ovuli, embrioni ed endospermi di mais e riso;
- L'applicazione della tecnica cDNA-AFLP su sezioni istologiche in mais e riso. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

I cereali, come il riso ed il mais, sono le principali risorse alimentari per l'uomo e gli animali. Il miglioramento genetico ha contribuito all'enorme progresso delle rese di queste coltivazioni, registrato negli ultimi 75 anni. Tuttavia, il rapido aumento della popolazione mondiale, nel 2025 ci saranno ulteriori 2 miliardi di persone da sfamare, ripresenta drammaticamente la necessità di aumentare le rese produttive. Inoltre, diventa sempre più importante l'aumento della qualità nutrizionale e la riduzione dei componenti allergenici dei cereali. Per raggiungere questi obiettivi è necessaria una profonda conoscenza dei fenomi che controllano lo sviluppo del seme dei cereali. Oltre agli aspetti applicativi, c'è un fondamentale interesse scientifico nell' apprendere i meccanismi coinvolti nello sviluppo del seme.

La ricerca cerealicola è oggi prevalentemente rivolta al riso ed al mais, le specie studiate in questo progetto. Il vantaggio derivante dall'impiego del riso riguarda la disponibilità della sequenza del genoma, oltre che alla facilità con cui si alleva e si trasforma. Per il mais, alla facilità di allevamento e di esecuzione degli incroci, di affianca l'enorme conoscenza genetica e la disponibilità di oltre 360.000 ESTs sequenziati in rappresentanza di 30.000 - 50.000 geni ed una densa mappa genetica. La possibilità di utilizzare queste informazioni consente lo sviluppo di approcci genomici per studiare lo sviluppo del seme.

Studi approfonditi per più di un decennio su mutanti dello sviluppo nelle Dicotiledoni hanno portato al chiarimento dei meccanismi implicati nella transizione dalla crescita vegetativa alla crescita riproduttiva, nella determinazione dell'infiorescenza, del meristema fiorale e dell'identità degli organi fiorali e nello sviluppo del seme (Hartmann et al., 2000; Ferrándiz et al., 2000).


Le conoscenze relative ai geni che controllano lo sviluppo del fiore e del seme nelle Monocotiledoni, quali il riso e il mais, sono molto più scarse se confrontate ai dati su Dicotiledoni. Lo studio della determinazione dell'identità degli organi fiorali mediante mutanti omeotici ha portato alla formulazione del cosiddetto modello ABC, secondo cui 3 classi di geni determinano l'identità degli organi fiorali. Questi geni omeotici sono stati successivamente clonati e si sono dimostrati appartenere tutti alla famiglia di fattori trascrizionali MADS-box. E' stato dimostrato che il modello ABC è ampiamente applicabile a specie dicotiledoni (Immink et al., 2003). Inoltre, sono stati identificati in specie monocotiledoni geni MADS-box omologhi ai geni ABC delle dicotiledoni. L'analisi funzionale nel riso ha dimostrato che la funzione dei geni di classe B e C è conservata, in quanto controllano l'identità delle lodicule, degli stami e dei carpelli. Recentemente, il modello ABC è stato ampliato con la classe di geni D, necessari per lo sviluppo dell'ovulo, e con la classe di geni E (geni SEP), indispensabili per la determinazione dell'identità di petali, stami, carpelli ed ovulo (Ferrario et al., 2003). Anche questi geni di classe D e E codificano per fattori di trascrizione MADS-box ed hanno un ruolo chiave nella determinazione dell'identità dell'ovulo. Sono stati isolati geni di riso, OsMADS, che codificano per proteine altamente omologhe alle proteine di classe D di Petunia e Arabidopsis e sono espressi in modo specifico negli ovuli di riso(Lopez et al., 1999).

Il seme dei cereali, costituito dall'embrione e dall'endosperma persistente, rappresenta un efficace sistema modello per studiare i meccanismi fondamentali dello sviluppo nelle piante. Lo sviluppo dell'embrione avviene attraverso l'attività di un gruppo di cellule che definiscono il meristema. Il meristema apicale si origina durante l'embriogenesi e consiste di tre domini, una zona centrale di cellule staminali, una zona periferica dove le cellule vengono canalizzate verso la formazione degli organi laterali e una terza zona che fornisce le cellule per la formazione del midollo. Si può anche descrivere il SAM (Shoot Apical Meristem) in termini di strati cellulari, corpus e tunica , sulla base del loro pattern di divisioni cellulari. In mais, la tunica è formato da un singolo strato di cellule epidermiche. Le cellule staminali del SAM sono una fonte di cellule necessarie per la formazione dello stelo e degli organi laterali. L'attività del meristema apicale consiste nel mantenimento locale di cellule staminali, nell'amplificazione di cellule figlie delle staminali e nella formazione degli abbozzi degli organi. Uno dei principali obiettivi del miglioramento genetico delle piante coltivate è quello di riuscire a manipolare l' architettura della pianta in modo tale da ottenere piante bene adattate al loro habitat colturale. A questo fine è indispensabile ottenere una conosscenza approfondita dei meccanismi richiesti per l'elaborazione di un meristema funzionale. Mentre nella specie modello Arabidopsis questa conoscenza a livello molecolare comincia a farsi strada, grazie a un recente approccio genetico e molecolare , nei cereali è ancora in uno stadio iniziale, in parte a causa dei pochi mutanti del SAM isolati e caratterizzati molecolarmente. In Arabidopsis il quadro che emerge dallo studio di diversi geni interessati nello sviluppo del meristema è quello dell'esistenza di un meccanismo di feed-back negativo del destino delle cellule staminali che fa sì che i meristemi mantengano un equilibrio tra la proliferazione e la perdita di cellule staminali per dislocazione alla periferia dove vengono sequestrate per la formazione degli organi (Fletcher and Meyerkowitz, 2000). Protagonisti di questo feed-back sono i geni CLAVATA che reprimono il destino o le divisioni delle cellule staminali del meristema e il gene WUSCHEL che ha un effetto di promozione sull'attività delle cellule staminali e contrasta i segnali elaborati dal complesso CLV. Restano da scoprire i meccanismi attraverso i quali le cellule del meristema interpretano la loro posizione, decidono il loro destino e lo comunicano ad altre cellule. Nei cereali la comprensione di alcuni aspetti delle funzioni del meristema si è avvalsa della analisi del pattern di espressione di geni che si esprimono preferenzialmente nel meristema, come ad esempio il gene omeobox knotted (Reiser et al., 2000). Tuttavia è indispensabile analizzare altri geni coivolti in questo processo per poter elaborare un quadro generale dell'organizzazione e del funzionamento del meristema apicale nei cereali (Gavazzi et al., 2004).

L'endosperma si forma, in seguito alla fecondazione, a partire dalla grande cellula centrale triploide del megagametofito. La cellularizzazione porta alla formazione di quattro tipi cellulari: l'endosperma amilaceo, l'aleurone, le cellule di trasferimento e le cellule che circondano l'embrione. Studi recenti mostrano che lo schema di sviluppo è conservato fra Arabidopsis e cereali (Olsen et al., 1999). Dall'analisi di fenotipi mutanti, comprendenti assenza delle cellule dell'aleurone, schemi di divisione anomali delle cellule dell'aleurone, aleurone pluristratificato, endosperma contenente cellule aleuroniche, sono stati isolati geni i cui trascritti sono preferenzialmente espressi in alcune fasi di sviluppo e in specifici strati cellulari. In mais, durante il differenziamento dell'endosperma interviene Crinkly4 che codifica per un recettore chinasico (Becraft et al., 1996), insieme a fattori di trascrizione come Vp1 e della famiglia Myb (Olsen et al., 1999). Un marcatore molecolare per le cellule di trasferimento è BET1 (Hueros et al., 1995) mentre, la cellularizzazione dell'endosperma è regolata dalla chinasi ZmWee1 (Sun et al., 1999) e dal gene globby1-1 (Costa et al., 2003). Le cellule che circondano l'embrione sono caratterizzate dell'espressione di Esr1 (Opsahl-Ferstad et al., 1999). Per comprendere il ruolo e il modo di sviluppo delle cellule di trasferimento e del pedicello, tessuti critici per un'efficace riempimento del seme, sarà necessario disporre di nuovi mutanti (Cerioli et al., 1995). <<<