RICERCA ITALIANA     

PATOLOGIA INFETTIVA DEI RUMINANTI

Università degli Studi di Bari

Abstract

Il progetto di ricerca"PATOLOGIA INFETTIVA DEI RUMINANTI" è incentrato sullo studio di alcune patologie infettive dei ruminanti domestici in grado di causare gravi perdite economiche agli allevamenti, dovute alla mortalità, agli aborti e ai cali di produzione di latte e di carne. Vengono prese in esame anche patologie dei ruminanti che possono avere riflessi sulla salute pubblica.
In particolare sono studiate dal punto di vista patogenetico e diagnostico: 1) la febbre catarrale maligna; 2) le correlazioni tra i livelli di lisozima nel latte ovino e sensibilità alle mastiti; 3) gli aborti infettivi della bufala, in considerazione delle scarsissime informazioni a riguardo; 4) la diarrea neonatale da rotavirus dei vitelli, con particolare riguardo alla tipizzazione genomica degli stipiti isolati, anche in funzione della verifica dell'efficacia dei vaccini; 5) le mastiti da Staphylococcus aureus meticillino resistenti, agenti di pericolose infezioni anche per l'uomo. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Canio BUONAVOGLIA Università degli Studi di BARI

Obiettivo del Programma di Ricerca

L'impatto delle malattie infettive sulla scarsa redditività degli allevamenti zootecnici è in continuo aumento. In aggiunta alle "classiche" patologie infettive non ancora eradicate (brucellosi, tubercolosi, IBR, BVD), si osservano nuove infezioni che nel passato erano poco note o inesistenti. Basti pensare alla Blue Tongue che ha completamente alterato il normale management aziendale degli allevamenti bovini, ovini e caprini, condizionando i flussi commerciali.
Non sono da trascurare inoltre altre patologie infettive quali la febbre catarrale maligna (FCM)il cui impatto negativo è forse sottostimato perchè non vi sono strumenti diagnostici appropriati e di applicazione routinaria.
Gli obiettivi principali del progetto di ricerca "PATOLOGIA INFETTIVA DEI RUMINANTI" sono:
1) messa a punto ed impiego di tecniche diagnostiche innovative da utilizzare per l'approfondimento di aspetti patogenetici, immunologici e epidemiologici di alcune malattie infettive dei ruminanti di particolare interesse zootecnico;
2) studio di alcune patologie dei ruminanti con possibili riflessi sulla salute pubblica. <<<

Risultati parziali attesi

La prima fase del programma di ricerca potrà fornire i seguenti risultati:
TECNICHE BIOMOLECOLARI APPLICATE ALLA DIAGNOSI ED ALLA PATOGENESI DELLA FEBBRE CATARRALE MALIGNA
1. Messa a punto e validazione di un test di PCR convenzionale per la ricerca di OvHV-2 nei tessuti e nei secreti di bovini ed ovicaprini infetti e di un test di PCR quantitativa (Real-Time PCR) per la quantificazione del DNA virale.
LISOZIMA NEL LATTE OVINO: MESSA IN EVIDENZA DI PROPRIETA' ANTIBATTERICHE
1. Titolazione del lisozima in tutti i campioni di latte esaminati.
PATOLOGIE ABORTIGENE NEL BUFALO
1. Messa a punto di una multiplex PCR per la diagnosi delle più frequenti patologie abortigene.
CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI STIPITI ROTAVIRUS BOVINI
1. Ottimizzazione della tecnica di tipizzazione mediante scelta di nuovi primer tipo-specifici, o, eventualmente, ottimizzazione di primer già pubblicati.
STUDIO DEL GENOMA DI STAPHYLOCOCCUS AUREUS MEDIANTE L'APPLICAZIONE DELL'ELETTROFORESI PULSATA (PFGE) E DELL'AMPLIFICAZIONE DI POLIMORFISMI (AFLP)
1. Isolamento di stipiti di Staphylococcus aureus meticillino-resistenti;
2. messa in evidenza di profili di similarità tra i diversi stipiti esaminati.Lo sviluppo del programma di ricerca permetterà di ottenere i seguenti risultati:
TECNICHE BIOMOLECOLARI APPLICATE ALLA DIAGNOSI ED ALLA PATOGENESI DELLA FEBBRE CATARRALE MALIGNA
1. Quantificazione del DNA virale nei tessuti dei bovini infetti, con particolare riferimento a sangue e cervello, mediante PCR quantitativa sui campioni risultati positivi;
2. valutazione della replicazione virale nei linfociti circolanti e della distribuzione di OvHV-2 nei diversi tessuti, nei secreti e negli escreti con applicazione della PCR quantitativa agli ovini e ai caprini infetti.
LISOZIMA NEL LATTE OVINO: MESSA IN EVIDENZA DI PROPRIETA' ANTIBATTERICHE
1. Quantificazione del lisozima presente nel latte ovino e valutazione dell'azione antibatterica protettiva nei confronti della ghiandola mammaria.
PATOLOGIE ABORTIGENE NEL BUFALO
1. Dati epidemiologici sulle cause abortigene del bufalo.
CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI STIPITI ROTAVIRUS BOVINI
1. Isolamento su cellule degli stipiti rotavirus;
2. tipizzazione genomica ed analisi delle sequenze di stipiti di rotavirus del bovino.
STUDIO DEL GENOMA DI STAPHYLOCOCCUS AUREUS MEDIANTE L'APPLICAZIONE DELL'ELETTROFORESI PULSATA (PFGE) E DELL'AMPLIFICAZIONE DI POLIMORFISMI (AFLP)
1. Tipizzazione con tecniche di biologia molecolare di stipiti di Staphylococcus aureus meticillino-resistenti non tipizzabili con metodiche tradizionali. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Le patologie infettive dei ruminanti, prese in considerazione nel progetto di ricerca, hanno notevole impatto economico sulle aziende zootecniche e, in qualche caso, hanno anche riflessi sulla salute pubblica.
TECNICHE BIOMOLECOLARI APPLICATE ALLA DIAGNOSI ED ALLA PATOGENESI DELLA FEBBRE CATARRALE MALIGNA
La febbre catarrale maligna (MCF) è una malattia infettiva dei bovini e di alcuni ruminanti selvatici, causata da due gammaherpesvirus, alcelaphine herpesvirus 1 (AlHV-1), presente in Africa, e ovine herpesvirus 2 (OvHV-2), diffuso su scala mondiale. OvHV-2 è responsabile della sheep-associated MCF (SA-MCF) che colpisce i bovini ed i cervidi e riconosce come serbatoi dell'infezione gli ovini e i caprini, che sono portatori asintomatici. La patogenesi della SA-MCF non è ancora del tutto chiarita. I bovini, che contraggono l'infezione mediante uno stretto contatto con gli animali carrier (pecore e capre), sviluppano una malattia molto grave ad esito letale, anche se sono state descritte forme cliniche lievi, con guarigione degli animali infetti. I bovini rappresenterebbero degli ospiti a fondo cieco, in cui la malattia si manifesta in forma sporadica, e non sembrano essere capaci di trasmettere l'infezione ad altri animali sensibili. Tuttavia, la ripetuta segnalazione di focolai, in cui numerosi animali di uno stesso allevamento hanno sviluppato al malattia in un periodo di tempo relativamente breve, ha messo in discussione questa ipotesi patogenetica, riconsiderando il ruolo dei bovini con sintomatologia in atto e, soprattutto, di quelli con infezione subclinica o guariti, ai fini della trasmissione di OvHV-2.
In Italia, episodi di MCF sono stati segnalati raramente, nell'ambito di allevamenti promiscui bovini/ovini o bovini/ovicaprini. Si tratta, comunque, di casi diagnosticati su base clinica, istopatologica o sierologica, non supportati dalla identificazione dell'agente causale.
La diagnosi virologica di MCF, a causa della mancanza di substrati idonei per l'isolamento di OvHV-2, si basa su tecniche di biologia molecolare, tra le quali la PCR, per la sua elevata sensibilità e specificità, risulta la più diffusa. L'analisi di sequenza di frammenti del genoma o di interi geni, amplificati mediante PCR, ha messo in evidenza una bassa variabilità degli stipiti OvHV-2 presenti nelle varie parti del mondo. Recentemente è stata messa a punto una metodica di PCR quantitativa, mediante la quale è stato possibile valutare la replicazione di OvHV-2 nelle pecore e quantificare il DNA virale nei tessuti degli animali con malattia in atto. L'impiego di queste metodiche ha permesso di accertare che, come altri gammaherpesvirus, OvHV-2 latentizza a livello dei linfociti circolanti e che il titolo virale nel sangue degli ovini infetti non è costante, ma subisce notevoli variazioni, che condizionano il diverso titolo infettante di secreti ed escreti. Inoltre, è stato possibile evidenziare che il titolo virale nel cervello dei bovini con MCF è notevolmente superiore rispetto ai portatori asintomatici (ovini).
LISOZIMA NEL LATTE OVINO: MESSA IN EVIDENZA DI PROPRIETA' ANTIBATTERICHE
Il lisozima è un'enzima, presente nelle lacrime, nella saliva, nelle secrezioni nasali e gastriche, nel sangue, nei leucociti e nel latte, che esplica un'azione inibitrice sullo sviluppo batterico mediante la rottura del legame β - 1-4 glucosidico tra N - acetilglucosamina e acido N - acetil muramico, costituenti dei mucopolisaccaridi della parete batterica. Questo enzima è quindi considerato un antimicrobico naturale molto importante. Per quanto riguarda il contenuto di lisozima nel latte si hanno notevoli differenze di specie: nei ruminanti si ha solo una quantità limitata di questo enzima, mentre maggiori quantità si evidenziano nel latte umano, equino e suino (Grün, 1985; Solaroli et al., 1993; Elagamy, 2000).
Numerose sono state le ricerche tese a rilevare la concentrazione di lisozima nel latte prodotto sia da bovine clinicamente sane che affette da mastiti, evidenziando una correlazione con lo stato patologico della mammella. È stato dimostrato che il latte prelevato da quarti mammari sani possiede un elevato contenuto di lisozima; per questa ragione sembra che la somministrazione per via mammaria di tale latte in quarti infetti sia in grado di curare le mastiti subcliniche (Farid et al., 1984). Altri studi hanno mostrato che somministrazioni per via mammaria di latte ad elevato contenuto di lisozima portano alla guarigione, nell'89% dei casi, di quarti mammari infetti da agenti patogeni (Grün, 1985).
In altri studi ancora è stato rilevato che campioni di latte provenienti da bovine affette da mastite stafilococcica contenevano basse concentrazioni di lisozima (Piccinini et al., 1995). Da tutto ciò si potrebbe dedurre che l'assenza, o la scarsa quantità di lisozima, potrebbe essere interpretata come predisposizione all'insorgenza di mastite.
A fronte di numerosi studi sulla specie bovina, scarse sono invece le notizie presenti in letteratura sugli ovini. A questo proposito riteniamo opportuno quantificare il lisozima presente nel latte ovino al fine di poter valutare se esso possiede un'azione antibatterica protettiva nei confronti della ghiandola mammaria, preservandola così da forme di mastite.
PATOLOGIE ABORTIGENE NEL BUFALO
L'allevamento del bufalo mediterraneo (Bubalus bubalis) in Italia ha assunto negli ultimi anni un'importanza zootecnica ed economica estremamente rilevante soprattutto nel Sud Italia. Oggi la specie bufalina allevata, limitatamente all'aspetto economico, è da considerarsi una specie da latte. Trattandosi di un settore 'nuovo', la ricerca scientifica ha riguardato principalmente le tecniche di allevamento, il miglioramento genetico e le ‘strategie' di alimentazione, poche informazioni sono, invece, disponibili sull'eziopatogenesi delle malattie infettive del bufalo. Parallelamente allo sviluppo dell'allevamento bufalino dal punto di vista zootecnico, si è assistito alla comparsa di numerose patologie, sicuramente comuni con la specie bovina, ma fin'ora poco diffuse nella specie bufalina. Allo stato attuale, infatti, numerosi agenti patogeni, di origine batterica, parassitaria, fungina e virale, nella specie bufalina si rendono responsabili di turbe funzionali a carico di diversi organi ed apparati. Considerando in particolare le patologie che coinvolgono l'apparato riproduttore, denunciate da aborti, mummificazioni, mortinatalità, numerosi studi sono in corso per individuare i singoli patogeni in causa e le relative strategie di cura, diagnosi, prevenzione e controllo. Dai risultati emersi, particolare attenzione per il ruolo svolto nel determinismo dell'aborto, va concentrata nei confronti dei due principali virus erpetici bovini, il tipo 1 e il tipo 4, un protozoo di recente scoperta, Neospora caninum, e la Chlamydophila abortus. BHV-1 è responsabile di diverse sindromi quali la Rinotracheite infettiva bovina, la Vulvovaginite pustolosa infettiva e la Balanopostite infettiva pustolosa. L'infezione ha distribuzione cosmpolita e causa gravi perdite economiche negli allevamenti colpiti; inoltre, in corso di infezione si stabilisce spesso uno stato di latenza che si riattiva in concomitanza di diversi stimoli quali trasporto, parto, trattamenti con glicocorticoidi. Alla riattivazione segue escrezione del virus nell'ambiente esterno. Il BHV-4, allo stesso modo, è un virus ampiamente diffuso nella popolazione bufalina, in cui determina infezioni persistenti nei tessuti linfoidi, e una prolungata viremia associata ai monociti. Isolato per la prima volta in Ungheria da soggetti con infezione respiratoria, successivamente è stato isolato anche da animali con metrite post-partum, come pure da soggetti apparentemente sani. Allo stato attuale delle conoscenze, si ritiene che BHV-4 agisca come agente primario nel deprimere il sistema immunitario e che agenti secondari, virali e/o batterici, possano causare le differenti sintomatologie ad esso correlate. Neospora caninum è un protozoo della famiglia Sarcocystidae, simile al Toxoplasma gondii sia per quanto riguarda il ciclo replicativo, sia per l'aspetto morfologico. Scoperto per la prima volta in Norvegia nel 1984 attualmente si ritiene sia un importante agente di aborto nelle specie bovina e bufalina in tutto il mondo. L'infezione viene introdotta in allevamento dai cani, ospiti definitivi del parassita e resta all'interno dell'allevamento tramite la trasmissione verticale. Chlamydophila abortus, nome derivato da una recente nomenclatura delle clamidie, è un importante agente abortigeno, responsabile anche di zoonosi. Il ruolo epidemiologico di tale microrganismo nell'ambito degli agenti infettivi causa di aborto negli allevamenti bufalini è ancora oggetto di dibattito; tuttavia è indubbio che sia in grado di persistere allo stato latente nell'organismo ospite, fino alla gestazione successiva.
Da quanto fin qui detto, risulta rilevante l'allestimento di tecniche diagnostiche sensibili e rapide, che consentano di evidenziare la presenza di agenti infettivi responsabili di aborto, al fine di consentirne un efficace controllo.
CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI STIPITI ROTAVIRUS BOVINI
Nell'uomo l'infezione da rotavirus è considerata la principale causa di enterite nei primi anni di vita. Nei bovini la rotavirosi rappresenta la principale causa di mortalità neonatale.
I rotavirus sono virus nudi, del diametro di circa 70 nm, dotati di un capside trilaminare, di cui lo strato capsidico esterno è formato dalle proteine VP7 e VP4. Nei rotavirus si distinguono tre importanti specificità antigeniche. L'antigene di gruppo, espresso sulla proteina VP6, consente di distinguere 7 gruppi antigenici (A→G). Le infezioni umane ed animali sono prevalentemente sostenute da rotavirus di gruppo A, e, meno frequentemente, da rotavirus di tipo B e C. I rotavirus di gruppo A esprimono sulla VP6 anche un antigene di sottogruppo (SG) con specificità I o II. La specificità SG II è più diffusa nei rotavirus umani, mentre la specificità SG I è prevalente nei rotavirus animali. Nello strato capsidico esterno si riconoscono le proteine VP4 e VP7. Entrambe le proteine esprimono determinanti antigenici importanti ai fini della protezione immunitaria. La specificità antigenica relativa alla proteina VP7 viene definita G tipo, mentre la specificità antigenica relativa alla proteina VP4 viene definita P tipo. Mediante prove di neutralizzazione crociata con antisieri iperimmuni, e mediante analisi genetica del quarto e del nono segmento di RNA virale, è stato possibile identificare 15 G tipi e 23 P tipi.
I principali sierotipi identificati nell'uomo sono G1, G2, G3 e G4, che rappresentano all'incirca il 90% dei rotavirus riscontrati in tutto il mondo. Mentre i sierotipi G1, G3 e G4 sono per la maggior parte associati al P tipo 1A[8], il sierotipo G2 è associato preferibilmente con il P tipo 1B[4]. Altri G e P tipi sono spesso identificati, talvolta con elevata prevalenza locale, come G5, G6, G8, G9, G10 e G12 e P2A[6], P3[9], P4[10], P5A[3], P11[14]. In genere diversi G e P tipi possono co-circolare nella stessa zona e la distribuzione relativa dei vari G e P tipi può subire notevoli variazioni temporali. Recentemente, l'inusuale sierotipo G9 si è rapidamente diffuso anche in Italia.
Nei bovini i principali sierotipi circolanti sono G6, G8, G10 e P6[1], P7[5], P8[11], mentre sono stati descritti sporadicamente i tipi G7, G15, P[17] e P[21].
La caratterizzazione antigenica dei rotavirus può essere effettuata mediante dei metodi rapidi, basati sull'impiego di mAbs tipo-specifici in test ELISA, o su tecniche di genotipizzazione, quali test di ibridazione con sonde a DNA tipo-specifiche e la reazione polimerasica a catena (PCR) con primer tipo-specifici. L'accumularsi di mutazioni puntiformi nel genoma virale (drift) porta a una diversificazione genetica graduale ma di entità notevole. In certi casi, l'entità del drift genetico/antigenico può interessare gli attuali sistemi di tipizzazione dei rotavirus mediante alterazione degli epitopi antigenici riconosciuti da mAbs tipo-specific o mediante l'accumulo di variazioni nucleotidiche nel sito di attacco dei primer tipo-specifici. Problemi di tipizzazione dovuti al drift genetico/antigenico dei virus sono stati descritti per gli stipiti G1, G2, G8, G9 e P1A[8]. Ciò rende opportuno ottimizzare le metodiche correntemente in uso per la tipizzazione dei rotavirus.
STUDIO DEL GENOMA DI STAPHYLOCOCCUS AUREUS MEDIANTE L'APPLICAZIONE DELL'ELETTROFORESI PULSATA (PFGE) E DELL'AMPLIFICAZIONE DI POLIMORFISMI (AFLP)
La presenza di Staphylococcus aureus meticillino-resistente (MRSA), in medicina, è stata segnalata poco dopo che la meticillina era stata introdotta nella clinica per la cura di infezioni sostenute da tali microrganismi. La capacità colonizzante e l'attiva moltiplicazione degli stafilococchi rappresentano caratteri di virulenza. I fattori di rischio che contribuiscono all'attecchimento dell'infezione sono rappresentati dalla lentezza della guarigione di alcune infezioni ricorrenti, da trattamenti antibiotici prolungati, da utilizzazione di cateteri ed ancora dalla presenza di ferite. S. aureus è uno dei più frequenti agenti responsabile di mastite nella bovina da latte, nella pecora e nella capra ed inoltre è spesso coinvolto in infezioni cutanee nel suino ed in altre specie animali. Le perdite economiche causate dalle mastiti ad eziologia stafilococcica sono rappresentate dalla diminuita produzione di latte, costo dei medicinali, costi per la rimonta e per il personale tecnico, oltre che dalla produzione di un latte con caratteristiche organolettiche scadenti. Malgrado nei paesi industrializzati il latte venga sistematicamente risanato prima del consumo, tuttavia è importante rilevare che molti degli agenti batterici causa di mastite, e tra questi in modo particolare Staphylococcus aureus, possono contagiare l'uomo, come in un passato recente, in cui il latte ha rappresentato un pericoloso veicolo di infezioni tubercolari e brucellari.
Nell'uomo S. aureus è il principale agente eziologico delle infezioni purulente localizzate a carico dei tessuti molli, delle ossa e di altri organi. E' responsabile soprattutto di infezioni di natura esogena in funzione della sua capacità di diffondere nell'ambiente causando epidemie in comunità chiuse come ospedali, case di cura e scuole.
Il microrganismo, in determinate condizioni, esprime una elevata virulenza in grado di esasperare il processo infiammatorio fino a portare a morte l'ospite.
Durante il trattamento terapeutico delle infezioni da stafilococchi con meticillina e beta-lattamici in generale può verificarsi l'insorgenza di ceppi MRSA tanto che sono stati segnalati MRSA nel cane, nel cavallo e nelle bovine da latte.
Nell'uomo i ceppi MRSA sono temibili patogeni specialmente in campo ospedaliero.
La resistenza alla meticillina insorge per la presenza del gene mecA che codifica per una Penicillin Binding Protein (PBP2a) che ha una bassa affinità per i composti beta-lattamici. Sulla base di tali considerazioni è stato ritenuto opportuno studiare il genoma di Staphylococcus aureus applicando metodiche di biologia molecolare come la elettroforesi pulsata (PFGE) e l'amplificazioni di polimorfismi del DNA (AFLP). <<<