RICERCA ITALIANA     

Approcci fisiologici e molecolari per migliorare l'efficienza del biorisanamento da cromato

Università degli Studi di Firenze

Abstract

Tra i metalli pesanti il cromo è uno dei più usati trovando applicazione in vari settori industriali (metallurgico, chimico, produzione di refrattari, ecc.) ed è considerato uno dei più importanti e pericolosi inquinanti ambientali, sia a livello nazionale che internazionale. Infatti grandi quantità di cromato [Cr(VI)], che è solubile in acqua, altamente tossico, mutageno e cangerogeno, sono state e sono rilasciate nell'ambiente in seguito ad attività come la cromatura dei metalli, la conservazione del legno, la produzione di pigmenti. Generalmente il risanamento di siti contaminati da cromato è attuato tramite l'applicazione di metodologie fisico-chimiche che, oltre ad essere considerate molto costose specialmente per interventi su aree vaste, spesso a loro volta provocano danni ambientali. Pertanto vari gruppi di ricerca si stanno impegnando per mettere a punto una strategia basata sull'uso di microrganismi capaci di ridurre il cromo esavalente in cromo trivalente, forma poco solubile e meno tossica. Tuttavia per giungere a progettare ed applicare, su larga scala, un efficiente sistema di biorisanamento da cromato c'è la necessità di approfondire i complessi rapporti che esistono tra cromo e microrganismi. E' all'interno di questa problematica che si inserisce il presente progetto di ricerca che prevede la selezione di ceppi batterici con migliore fitness per un loro uso in processi di risanamento da cromato, l'analisi dei loro trascrittomi per l'identificazione dei geni coinvolti nei processi di resistenza/riduzione del cromato e la ricerca di promotori attivi in condizioni di affamamento per un loro possibile impiego nel controllo dell'espressione di cromato-riduttasi.
I risultati conseguibili potranno avere un interesse scientifico di base, portando ad un approfondimento della conoscenza dei meccanismi di resistenza e riduzione del cromato, e forniranno utili informazioni che potranno essere utilizzate per la progettazione di sistemi di disinquinamento. Saranno disponibili ceppi batterici dotati di peculiari caratteristiche che, poiché sono indigeni di siti contaminati da cromo, potrebbero essere utilizzati in processi di biorisanamento in situ alleviando problemi legali ed etici sollevabili con l'introduzione di microrganismi ingegnerizzati nell'ambiente. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Luciana GIOVANNETTI Università degli Studi di FIRENZE

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il cromato [Cr(VI)] costituisce uno dei maggiori problemi legati all'inquinamento ambientale da metalli pesanti sia per la sua elevata pericolosità per salute dell'uomo (è altamente tossico, mutageno e cancerogeno) che per la sua mobilità (responsabile di una rapida diffusione dal sito di inquinamento). Le tradizionali strategie impiegate per il recupero di suoli e/o acque contaminate da cromato si basano su approcci fisico-chimichi, che sono proibitivi a livello economico, soprattutto per il trattamento di vaste aree, e spesso creano a loro volta problemi ambientali. Pertanto, sia a livello nazionale che internazionale, è nata l'esigenza di mettere a punto un'efficiente strategia di biorisanamento, accettabile dal punto di vista economico e a basso impatto ambientale, di siti contaminati da cromato. In questa problematica si inserisce il presente progetto di ricerca che ha come principale obiettivo quello di acquisire informazioni indispensabili per la realizzazione di un sistema biologico in grado di ridurre il Cr(VI) a Cr(III), forma meno tossica e poco solubile, in presenza di elevate concentrazioni di cromato.
Lo scopo sopra riportato sarà raggiunto mediante il conseguimento dei seguenti obiettivi intermedi:
--Individuazione di ceppi batterici che presentano fitness idonee (elevata MIC di Cr(VI) e Cr(III), alto tasso di riduzione del Cr(VI), elevata attività a basse temperature, flessibilità metabolica) per un loro impiego in processi di biorisanamento.
--Identificazione dei geni coinvolti nei processi di resistenza/riduzione del cromato nei ceppi selezionati.
--Ottenimento di una libreria di promotori, da ceppi selezionati, che sono attivi in condizioni di affamamento
Fino ad oggi, molti studi condotti al fine di approfondire le conoscenze sui meccanismi di resistenza e riduzione del cromato hanno utilizzato essenzialmente batteri tolleranti basse concentrazioni di Cr(VI), quindi uno degli aspetti innovativi del progetto consiste nella disponibilità di una collezione di ceppi batterici con peculiari caratteristiche, tra le quali alta resistenza e capacità di riduzione del Cr(VI), isolati nell'arco di diversi anni di attività di ricerca da ambienti contaminati cronicamente da Cr(III) e Cr(VI) e da microcosmi contaminati artificialmente con cromato. Inoltre in fase progettuale particolare attenzione è stata rivolta alla scelta di approcci metodologici adeguati per condurre un'analisi sui geni coinvolti nella risposta alla presenza di cromato. Poiché l'analisi dei trascrittomi è un valido strumento per identificare i geni coinvolti in un processo e comprenderne le funzioni, tra i metodi disponibili è stato scelto l'approccio cDNA-AFLP che è un potente ed innovativo mezzo. La sua sensibilità e specificità è stata paragonata a quella dei microarray, ma a differenza di quest'ultimo approccio consente di studiare l'espressione genica di microrganismi dei quali non si conoscono le sequenze genomiche. Infine le informazioni acquisibili sui geni coinvolti nella risposta al cromato e sui promotori attivi in condizione di affamamento potranno portare, a lungo termine, a microrganismi e/o enzimi migliorati per il biorisanamento da cromato.
Il raggiungimento degli obiettivi proposti è garantito dalle capacità delle due Unità di Ricerca coinvolte nel progetto, costituite da ricercatori che, oltre ad aver un'esperienza consolidata nel settore dell'ecologia microbica e della biologia molecolare, hanno acquisito competenze specifiche che consentono loro di integrarsi e completarsi, e dalla disponibilità presso l'Unità di Ricerca 1 di una piattaforma di genomica e proteomica dotata di strumentazione ad alta processività. <<<

Risultati parziali attesi

--Disponibilità di una collezione di ceppi caratterizzati per MIC di Cr(VI) e di Cr(III), per capacità di riduzione del cromato ed efficienza di riduzione in presenza di differenti condizioni colturali, per la presenza di plasmidi.
--Protocollo ottim <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La contaminazione ambientale da metalli pesanti, sostanze tossiche per gli organismi, rappresenta uno dei maggiori problemi da risolvere soprattutto perché, da molti anni, un'intensa attività industriale e l'uso di pratiche agronomiche che impiegano ammendanti e fertilizzanti, che derivano da biomasse di scarto di varia natura (fanghi di depurazione, compost, residui di conceria), hanno fortemente contribuito ad una larga diffusione di questo tipo di inquinanti sia nei suoli che nelle acque. Pertanto da alcuni anni molta attenzione è stata rivolta a tutti processi industriali che portano al rilascio di materiali solidi e/o liquidi contenenti metalli pesanti e la legislazione per la protezione dell'ambiente da tali sostanze è diventata più severa, sia a livello italiano che internazionale (Benedetti, 1998; Chen and Hao, 1998).
Tra i metalli pesanti il cromo è uno dei più usati, la sua produzione mondiale è di circa 10 milioni di tonnellate all'anno, e trova applicazione in molti settori industriali: metallurgico, chimico, produzione di refrattari, ecc.(Cervantes et al., 2001). Il cromo, sebbene possa esistere sotto varie forme di ossidazione, nell'ambiente si trova soprattutto nelle forme trivalenti [Cr(III)] ed esavalenti [Cr(VI)] che sono le più stabili e che esercitano sugli organismi effetti diversi. Infatti, a differenza di altri metalli, il grado di pericolosità del cromo dipende dal suo stato di ossidazione, la forma esavalente è altamente solubile, tossica, mutagena e cancerogena; la forma trivalente è un micronutriente per molti organismi superiori, è poco solubile e cento volte meno tossica del Cr(VI) (Francisco et al., 2002).
Il cromato, forma di Cr(VI) maggiormente rilasciata nell'ambiente come prodotto di rifiuto di attività come la cromatura dei metalli, la conservazione del legno, la produzione di pigmenti etc., è considerato dall'USEPA (United States Environment Protection Agengy) uno dei contaminanti più pericolosi a causa della sua azione mutagena e cancerogena (Kamaludeen et al., 2003) e sta creando gravi problemi in molti paesi. L'attenzione rivolta al cromato non è dovuta solamente alla sua elevata pericolosità per la salute dell'uomo, ma anche alla sua mobilità: essendo solubile, una volta disperso nell'ambiente, è difficile da contenere e si diffonde velocemente dal sito contaminato attraverso le acque superficiali e profonde.
L'Italia fa parte dei Paesi che si trovano a dover intervenire in processi di bonifica da cromo in quanto presenta sia per il numero sia per il livello di contaminazione dei siti una situazione allarmante. In tal senso basta pensare all'inquinamento drammatico da Cr(VI) che si è avuto nella falda freatica ed in più di cento pozzi di acqua sorgiva del quartiere di San Felice (Asti) riconducibile ad attività industriali legate agli stabilimenti ARVIN, ditta produttrice di ammortizzatori per auto; non meno importante è stato il disastro ambientale causato dall'attività della Stoppani (Cogoleto, Genova) che ha portato ad una elevatissima e diffusa contaminazione di cromo esavalente delle acque sotterranee, superficiali e di battigia per molti Km2 intorno alla fabbrica. Inquinamento delle falde freatiche da cromo esavalente sono state individuate nel 2001 sia nel territorio comunale di Fontaniva sia nei comuni di Cittadella e di Tezze sul Brenta. Dal controllo compiuto dalla Commissione Regionale Veneta, istituita appositamente, risulta che nei mesi di maggio-giugno 2003 i valori di cromo esavalente presente nelle acque sono ricominciati a salire rispetto a quelli riscontrati all'inizio del 2003. Recentemente, (fine settembre 2003) nel Nolano (Napoli) sono state rilevate concentrazioni superiori ai limiti di legge di cromo esavalente e cromo totale nel terreno sul quale è situata una fabbrica che effettua verniciature e assemblaggio per importanti aziende aeronautiche nazionali. Gli esempi potrebbero continuare, ma per stigmatizzare l'importanza a livello italiano dei problemi ambientali connessi al cromo e della necessità di risanare siti contaminati, è sufficiente citare la giornata di studio, organizzata dal Gruppo di Scientifico Italiano di Studio e Ricerche (GSISR), tenutasi a Milano il 9 febbraio 2004, su "esperienza di applicazione del D.M. 471/99, valori di fondo, serbatoi interrati, inquinamento da cromo, movimentazione, materiali di scavo" nella quale il cromo è stato trattato insieme con i maggiori problemi legati alla contaminazione dei suoli.
Il recupero di siti inquinati da cromato oggi è attuato mediante metodi fisico-chimici che si basano sull'escavazione o il pompaggio del materiale contaminato seguiti dalla riduzione chimica che porta alla precipitazione e/o sedimentazione del cromo ridotto [Cr(III)]. Tuttavia, in questi ultimi anni, sia a livello nazionale che internazionale, molta attenzione è stata rivolta alla possibilità di sfruttare la capacità di ridurre il Cr(VI) a Cr(III) presente in determinati gruppi microbici (batteri, funghi, microalghe) per il recupero di siti contaminati da cromato, poiché le strategie tradizionali oltre ad essere molto impegnative dal punto di vista economico e di difficile se non impossibile applicazione su larga scala, frequentemente creano a loro volta problemi ambientali (Blowes, 2002; Gonzalez et al., 2003). E' certo che lo sviluppo di un efficace sistema biologico per il risanamento da cromato è allettante ed auspicabile presentandosi come una strategia poco invasiva per l'ambiente, proponibile per il trattamento di vaste aree, competitiva a livello economico rispetto ai sistemi fisico-chimici (Lovley and Coates, 1997; Chen and Hao, 1998; Tseng and Bielefeldt, 2002). Tuttavia, a nostra conoscenza non è stato ancora definito il reale grado di efficienza del biorisanamento da cromato su larga scala, per passare da una fase potenziale all'applicazione di strategie che prevedono l'impiego di microrganismi per il recupero di ambienti contaminati con cromato è prima necessario approfondire la conoscenza delle complesse relazioni che esistono tra cromo e microrganismi e dei meccanismi di resistenza e riduzione che consentono ai microrganismi di sopravvivere in presenza di elevate concentrazioni di cromato (McLean et al., 2000; McLean and Beveridge, 2001; Francisco et al., 2002).
Tra i procarioti, considerati come il gruppo microbico più promettente per l'impiego in processi di biorisanamento da cromato (Cervantes et al., 2001), la capacità di ridurre il Cr(VI) a Cr(III) è stata riscontrata in vari generi tra i quali troviamo Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus Achromobacter, Microbacterium Arthrobacter, Corynebacterium (McLean et al., 2000; Pattanapipitpaisal et al., 2001; McLean and Beveridge, 2001; Viti et al., 2003; Megharaj et al., 2003). Alcune specie sono in grado di ridurre il cromato sia in anerobiosi che in aerobiosi, mentre altre o in aerobiosi o in anaerobiosi. I meccanismi mediante i quali i batteri riescono a ridurre il cromato sono diversi e specie dipendenti (McLean et al., 2000). I batteri anaerobi possono utilizzare il cromato come ultimo accettore di elettroni nella respirazione (Tebo and Obraztova, 1998) o ridurre il cromato nello spazio periplasmatico mediante idrogenasi o tramite il coinvolgimento del citocromo c (Michel et al., 2001; Puzon et al., 2002), mentre nei batteri aerobi la riduzione del cromato può avvenire tramite agenti cellulari riducenti (principalmente glutatione) e cromato riduttasi NADH-dipendenti (Suzuki et al., 1992; Shen and Wang, 1993; Garbisu et al., 1998). Ancora non è chiaro, sebbene ipotesi siano state fatte, se in aerobiosi il processo di riduzione enzimatico sia dominante su quello non enzimatico e se le cromato riduttasi NADH-dipendenti siano specifiche per il cromato. In anaerobiosi è da chiarire se la sola presenza del cromato come accettore finale di elettroni sia sufficiente per sostenere la crescita microbica oppure se la riduzione del cromato sia legata a un processo cometabolico o ad un metabolismo secondario come succede per il batterio Shewanella onoidensis MR-1 (Middleton et al., 2003).
Da quanto sopra riportato è chiaro che la presenza in un batterio di una buona capacità di riduzione del cromato, sebbene possa essere dovuta a sistemi anche molto diversi, rappresenta una stimolante attrattiva per lo sviluppo di un efficiente sistema per detossificare un sito contaminato, ma dobbiamo sottolineare che concentrazioni elevate di cromato, come quelle che spesso si ritrovano nei siti contaminati, inibiscono l'attività di trasformazione del Cr(VI) in Cr(III) (Lovley and Coates, 1997; Megharaj et al., 2003). Infatti resistenza al cromato e riduzione del cromato non sono necessariamente correlate: il Cr(VI) può essere ridotto sia da batteri resistenti che sensibili al cromato e non tutti i batteri resistenti sono in grado di ridurlo. La riduzione del Cr(VI) può essere considerata come un meccanismo aggiuntivo detossificante ai sistemi di resistenza al Cr(VI) che coinvolgono geni plasmidici e/o cromosomici (Nies, 1999; Cervantes et al., 2001); in anaerobiosi può essere un processo collaterale di attività di riduttasi che si sono evolute per altri substrati (Kamaludeen et al., 2003).
Un aspetto che può limitare l'applicazione su larga scala di strategie di biorisanamento da cromato può essere costituito dal fatto che gli ambienti contaminati sono generalmente poveri di nutrienti e non consentono il rapido sviluppo di batteri indigeni. L'aggiunta dall'esterno di nutrienti, oltre ad essere laboriosa e dispendiosa, porta alla produzione di una notevole quantità di biomassa che potrebbe prevedere strategie di smaltimento (Tseng and Bielefeldt, 2002; Gonzalez et al., 2003). Questo ostacolo potrebbe essere rimosso tentando di applicare a ceppi batterici indigeni, da usare nel processo di risanamento ambientale da cromato, la strategia impiegata con successo in Escherichia coli per il biorisanamento da tricloroetilene (si è avuto una riduzione del 100% della biomassa prodotta per unità di tricloetilene degradato) (Matin et al., 1995). Tale approccio, che si basa sull'impiego di promotori attivi in condizioni di affamamento, consente di disaccoppiare l'alto livello di espressione di un gene dalla crescita, fornendo l'espressione massima del gene in condizioni di lenta crescita (Kim et al., 1995). Se sarà possibile giungere alla fusione di un gene che codifica per una efficiente cromato-riduttasi con un promotore tipo affamamento (Gonzalez et al., 2003) potrebbero essere intraprese importanti opere di biorisanamento ambientale da cromato a basso costo e con basso impatto.
Da quanto fino ad ora esposto si può concludere che ci sono importanti presupposti, nonostante i notevoli progressi compiuti in questi ultimi anni, che debbono essere verificati per arrivare ad applicare con successo su larga scala strategie che impiegano i batteri per il recupero di ambienti contaminati da cromato. Diversi ricercatori ritengono che tale obiettivo possa essere raggiunto seguendo due vie. Una è quella di approfondire, partendo da microrganismi, isolati da ambienti naturali e appartenenti a differenti specie, resistenti ad elevate concentrazioni di cromato (fino ad ora molti studi sono stati condotti su ceppi con bassa tolleranza al cromo esavalente) e dotati di una buona attività riduttrice, i meccanismi coinvolti nei processi di resistenza e comprendere come alcuni fattori abiotici (iniziale concentrazione del cromato, pH, temperatura, fonte di carbonio, accettori di elettroni) interferiscano con il tasso di riduzione. L'abilità di batteri indigeni di ridurre il cromo esavalente in cromo trivalente deve essere quantificata e le condizioni ottimali per la loro espressione debbono essere definite per migliorare l'efficienza dei processi di disinquinamento. L'altra via, probabilmente realizzabile in un tempo più lungo, prevede l'uso dell'ingegneria genetica e proteica al fine di ottenere batteri e/o famiglie di proteine da utilizzare in processi di biorisanamento da cromato. <<<