RICERCA ITALIANA     

APPROCCIO TEORICO-SPERIMENTALE AGLI STATI NON-NATIVI DELLE PROTEINE: FORMAZIONE DI FIBRILLE AMILOIDI, PROTEINE DISORDINATE E DENATURATE

Università degli Studi di Padova

Abstract

Capire il processo con il quale le proteine si ripiegano nel loro stato nativo e' l'essenza stessa della moderna biologia cellulare e molecolare.
Come fa una catena non strutturata di ammino-acidi , priva di ogni attività biologica, a ripiegarsi in una ben definita struttura tridimensionale (lo stato nativo) perfettamente funzionante ? Capire il protein folding implica decifrare la seconda metà del codice genetico ovvero i complessi meccanismi che sono necessari per la conversione di una sequenza unidimensionale di amino acidi in una attività biologica.
La presenza di svariate catene proteiche può indurre un folding non corretto (misfolding) che porta alla formazione di aggregati non solubili, le fibrille amiloidi, che sono coinvolte in molte terribili malattie. I meccanismi di aggregazione e la struttura stessa degli amiloidi sono molto poco conosciute e qualsiasi nuova scoperta in questo campo può portare a cruciali aiuti nello sviluppare nuove strategie mediche e farmaceutiche. Altri aspetti non nativi delle proteine, come la struttura degli stati denaturati e le proteine intrinsecamente non strutturate possono nascondere importanti informazioni per svelare il problema del folding.
I più recenti sviluppi dei mezzi di calcolo hanno permesso di ipotizzare una analisi numerica realistica di situazioni nelle quali tutti i gradi di libertà di piccole proteine e del solvente vengano tenuti in considerazione per tempi sufficientemente lunghi. Tuttavia, anche l'ancor remota possibilità di simulare (in silico) la dinamica del folding non necessariamente implica la capacità di comprendere i fattori chiave che guidano folding/unfolding, misfolding e aggregazione.
Un aspetto che sembra emergere in maniera preponderante e' quello di utilizzare modelli meccanico statistici integrati da informazioni sperimentali per individuare questi aspetti chiave che soggiacciono ad un fenomeno così complesso. Per questa ragione crediamo che i prossimi sviluppi in questo campo verranno solamente se esperimenti, modelli teorici e simulazioni al computer verranno orchestrati simultaneamente.
Questo e' proprio lo scopo di questo programma di ricerca: combinare due gruppi sperimentali e tre teorici per sviluppare un set completo di tecniche atte ad affrontare svariati problemi biologici con particolare attenzione ad alcuni aspetti non nativi del folding quali appunto il misfolding, l'aggregazione, gli stati non strutturati e quello denaturato con lo scopo di raggiungere una più profonda comprensione dell'intero problema. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Amos MARITAN Università degli Studi di PADOVA

Obiettivo del Programma di Ricerca

L'argomento di ricerca comune di questo gruppo di ricerca e' il problema del ripiegamento delle proteine. I risultati di questi studi potrebbero avere applicazioni in molti campi della biochimica, della medicina e della biotecnologia.
Negli ultimi anni, grazie ai grandi sviluppi della biotecnologia, c'e' stato un incredibile aumento nel numero delle sequenze proteiche determinate e rese disponibili alla comunità scientifica. Queste informazioni, tuttavia, non sono sufficienti per capire il ruolo di queste molecole all'interno della cellula, poiché è noto che la funzione della proteina è strettamente legata alla sua struttura tridimensionale. Attualmente, solo l'un per cento delle strutture corrispondenti a sequenze note e' stato risolto ed il numero di sequenze note cresce ad una velocità superiore rispetto a quello delle strutture.
La conoscenza del processo di folding darebbe anche utili informazioni su come trattare alcune malattie, quali l'Alzheimer, la fibrosi cistica, il morbo di Creutzfeld-Jacob. In tutti questi casi, la cellula viene danneggiata dalla formazione di aggregati non solubili chiamati fibrille amiloidi, che nascono dalla aggregazione di proteine mal ripiegate. L'impatto sociale di queste malattie è enorme: sintomatico il caso dell'Alzheimer che colpisce l'un per cento della popolazione sopra i sessantacinque anni e la metà della popolazione sopra gli ottantacinque.
Negli ultimi anni si è cominciato a pensare che lo studio di queste situazioni patologiche che portano al non corretto ripiegamento delle proteine e alla loro aggregazione possa essere una strategia alternativa per capire almeno alcuni aspetti del folding. Analogamente si pensa che informazioni interessanti si possano ottenere dallo studio dello stato denaturato (nel quale è già stato visto sperimentalmente che esiste una grande concentrazione di strutture secondare) e delle proteine non strutturate, che sono soggette ad una ripiegamento solo quando in contatto con un substrato.

Inoltre, è sempre più chiaro che ulteriori progressi in questo campo possono avvenire solamente combinando strettamente esperimenti, modelli teorici e calcoli computazionali.
Questo infatti lo scopo del nostro progetto: unire due gruppi sperimentali e tre teorici per sviluppare un insieme di tecniche per affrontare diversi problemi biologici.

La descrizione degli obiettivi specifici verrà fatta nella ultima sezione del programma di ricerca e maggiori dettagli si potranno trovare nei programme delle singole unità.
L'esperineza di tutti i gruppi coinvolti, sia teorici che sperimentali, e' assolutamente necessaria per affrontare queste tematiche (ulteriori collaborazioni esterne sono segnalate nelle varie sezioni).

Gli obiettivi che vogliamo raggiungere sono principalmente i seguenti:

1. Studi teorici e sperimentali di misfolding e aggregazione di proteine;
2. Studi teorici e sperimentali dei primi eventi durante il folding e caratterizzazione dello stato denaturato.
3. Studi teorici e sperimentali di stati di transizione ed intermedi;
4. Proteine intrinsecamente destrutturate;
5. Studio del disegno e del folding delle proteine da un punto di vista fondamentale;
6. Studio del profilo di energia libera in vicinanza dello stato nativo e sviluppo di modelli a grana grossa;
7. Fasi di tipo cristalli liquidi e proteine;
8. Studio di sistemi meccano-chimici;
9. Traslocazione di polimeri e proteine attraverso stretti canali proteici;
10. Studio di filamenti citoschetrici: microtubuli ed actina;
11. Sfere rigide adesive anisotrope e aggregazione di particelle. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il funzionamento degli organismi biologici si basa sul comportamento di migliaia di differenti proteine, la cui funzione è strettamente legata alla loro struttura tridimensionale. Una proteina è una catena lineare formata da una particolare sequenza di unità monometriche, dette ammino-acidi. Questa sequenza e' codificata nei genomi degli organismi. I recenti processi di decodificazione sequenziando i genomi hanno permesso la quasi completa decodificazione di tutte le sequenze presenti negli organismi. Il prossimo passo in questo campo emergente di ricerca potrebbe essere il NIH (Iniziativa per la struttura delle proteine: http://www.nigms.nih.gov/psi) il cui scopo è quello di rendere disponibile la struttura a livello atomico della maggior parte delle sequenze conosciute. Auspicabilmente, la completa determinazione della struttura di proteine che sono rappresentative di una data famiglia potrà aiutare la determinazione di tutte le sequenze omologhe. Questo può essere visto come un compresso tra la necessità di una completa caratterizzazione delle strutture e la difficoltà a capire il processo (protein folding) attraverso il quale la proteina raggiunge il suo stato nativo. In effetti il problema del protein folding è tuttora una delle più affascinati sfide della biologia molecolare.

Le unità di ricerca coinvolte in questo progetto (Bari, Firenze, Padova, Roma e Venezia) e quelle che con loro collaborano molto strettamente (Cambridge (Prof. Dobson), Lausanne (Prof. Stasiak), Munich (Prof. Frey), PennState (Prof. Banavar), ENS-Parigi (Proff Croquette and Bensimon) and Ancona (Prof. Mariani)) hanno una considerevole esperienza nel settore è offrono una interessante combinazione di tecniche teoriche e sperimentali.

A. Ripegamento di proteine, loro malripegamento e aggregazione
In vitro, il processo di folding è solitamente un processo reversibile, almeno per proteine corte: esperimenti di refolding, in condizioni fisiologiche, riproducono sempre la stessa conformazione con la stessa funzionalità biologica dello stato nativo. Tuttavia i percorsi di folding sono caratterizzati da un numero di stati transienti la cui identificazione e caratterizzazione strutturale è estremamente difficile. Alcuni di questi stati possono aggregare (Kelly, 1998) e sono quindi responsabili della formazione di aggregati fibrillari insolubili, le fibrille amiloidi, che sono responsabili a numerose malatti umane quali i morbi di Alzheimer, di Parkinson e di Creutzfeld-Jacob, il diabete di tipo II e di altre condizioni patologiche (Selkoe, 2003). E' oramai accettato che l'aggregazione amiloide avvenga a step (Bitan et al., 2003), partendo da un parziale/totale unfolding che attiva il processo di aggregazione. Il gruppo di Firenze ha contribuito molto alla comprensione dei meccanismi che soggiacciono a questo fenomeno (Chiti et al. 2002a, 2002b). E' in effetti chiaro che la formazione degli amiloidi è una tendenza generica delle proteine naturali che può essere virtualmente riprodotta in vitro per ogni proteina. Questo ha sollevato la questione che ogni proteina per ripiegarsi e rimanere stabile nello stato nativo deve essere capace di evitare questi processi di aggregazione (Dobson 2003. Il gruppo di Padova ha dato un supporto teorico a questa congettura, mostrando come alcuni modelli presentino la struttura amiloide come un possibile minimo energetico per sistemi di proteine multiple (Hoang et al. 2004,2005, Banavar et al. 2004). Inoltre, l'aggregazione proteica è responsabile di altre architetture cellulari come i filamenti citoscheletrici, l'actina ed i microtubuli, che sono stati selezionati dai processi evolutivi per garantire specifiche proprietà elastiche alla cellula. La comprensione delle relazioni fra le strutture proteiche ed i filamenti di aggregati proteici è essenziale per spiegare le stimolanti osservazioni sperimentali fatte recentemente dal gruppo di Bari in collaborazione con altri gruppi sperimentali (Pampaloni et al. 2005).

B. Eventi iniziali nel processo di folding
L'identificazione e la caratterizzazione strutturale degli stati conformazionali che popolano il processo di folding è una enorme sfida sia teorica che sperimentale. Sperimentalmente, questo scopo può essere conseguito con studi cinetici usando una varietà di differenti tecniche spettroscopiche. A questo riguardo l'unità di Roma ha contribuito a capire il ruolo fondamentale giocato dalle strutture che si formano nei primi istanti del processo, come il collasso idrofobico e/o la formazione di strutture secondarie(Gianni et al. 2003, Welker et al. 2004).
Un cruciale aspetto di questa analisi è la caratterizzazione degli stati iniziali (stato denaturato); in questo contesto è importante distinguere la differenza fra lo stato denaturato sotto condizioni che favoriscono il folding (Dphys) e lo stato completamente sfoldato (U) che è una specie molto aperta che si vede solo ad alte concentrazioni di denaturante e a alte temperature. Il ruolo preciso svolto dagli stati Dphys è molto dibattuto in letteratura; non è chiaro se esso rappresenti un transiente en-route verso lo stato nativo (Capaldi et al. 2001), od una risposta conformazionale aspecifica dello stato U quando variano le condizioni del solvente.
Metodiche di mescolamento a flusso interrotto e continuo sono tipiche per esplorare i processi di folding e unfolding poiché esse permettono un rapido cambio delle condizioni del solvente e l'utilizzo di diverse misure spettroscopiche. In commercio gli strumenti a mescolamento a flusso interrotto sono disponibili solo su scale del millisecondo e sono quindi inadatte agli scopi che ci prefiggiamo. Solo un gruppo molto limitato di laboratori al mondo sono riusciti a sviluppare strumenti a mescolamento super-rapido con risoluzione di microsecondi (Shastry et al. 1998, Khan et al. 2003, Akiyama et al. 2000).
Sperimentalmente, la miglior strategia per descrivere la struttura degli stati intermedi a livello atomico è quella della analisi dei valori phi (Fersht et al. 1992) che utilizza tecniche di ingegneria proteica e di cinetica. Usando questa strategia è stato mostrato che proteine utilizzanti un meccanismo di folding a due stati possono esibire stati di transizione "polarizzati" ( poche interazioni native presenti in una specifica regione della proteina, Itzhaki et al. 1995) o "diffusi" (le interazioni native sono sparpagliate su tutta la struttura, Gianni et al. 2003). La pittura generale emergente da questi studi sembra indicare che una differenza nella struttura degli stati di transizione può essere correlata con meccanismi di folding diversi: in un caso si ha la formazione di elementi di struttura secondari indipendenti, nella seconda la formazione di un nucleo stabilizzato da interazioni non locali. A tale proposito, studi preliminari su dominio PDZ fatti dalla unità di Roma hanno già dimostrato l'esistenza di differenti barriere di attivazione, entrambe studiabili con la tecnica dei valori phi.

C. Profilo di energia libera in vicinanza dello stato nativo e sviluppo di modelli a grana grossa
È particolarmente importante che lo studio sperimentale di singole proteine che ne caratterizza in dettaglio le proprietà di ripiegamento e la funzionalità biologica vada di pari passo con una sempre maggiore comprensione, da un punto di vista sia fisico, sia chimico, sia biologico, dei criteri che hanno condotto alla selezione di sequenze amminoacidiche funzionali all'esistenza di organismi viventi.
L'importanza di un approccio meccanico statistico è decisiva per comprendere quali debbano essere le caratteristiche generali e gli ingredienti essenziali nello sviluppo di modelli teorici che tentino una comprensione unitaria del problema. Il gruppo di Padova ha già ottenuto diversi risultati interessanti in questo ambito, molti dei quali in collaborazione con altri partner di questo progetto di ricerca. È stata per esempio da loro sviluppata una strategia generale per il disegno di proteine (la determinazione delle sequenze che ripiegano su di una struttura preassegnata) (Seno et al., 1998); ed è stato proposto, sempre dal gruppo di Padova, un metodo per stimare i potenziali efficaci d'interazione fra amminoacidi, poi utilizzato per studiare lo stato nativo di proteine globulari (Micheletti et al., 2001), per predire l' impacchettamento di eliche nelle proteine transmembranarie (Dobbs et al., 2002) e per simulare il processo di ripiegamento (Hoang et al., 2003). Più di recente, il medesimo gruppo ha cercato di comprendere il ruolo di poche caratteristiche fisico-chimiche comuni a tutte le proteine, quali gli effetti sterici di volume escluso, la geometria implicata nella formazione di legami idrogeno fra la catena principale, e l'effetto idrofobico, mettendone in luce il ruolo fondamentale sia nell'ambito del processo di ripiegamento sia in quello di ancora più ampio respiro dell'origine delle strutture proteiche. Questo tipo di approccio è basato sul convincimento che si possa raggiungere una comprensione più profonda del problema, da un lato tralasciando dettagli a livello della struttura atomica del sistema che si rivelano poi inessenziali, dall'altro catturandone le proprietà geometriche essenziali.
Il gruppo di Padova ha contribuito in maniera significativa allo sviluppo di questo tipo di approccio, mostrando l'importanza del cosiddetto modello di Go (Go et al., 1976). In tale modello si assume che il processo di ripiegamento venga influenzato solo dalle interazioni presenti nella struttura nativa. Questo approccio è stato applicato con successo a diverse problematiche importanti, quali l'esatta localizzazione, in accordo con esperimenti di mutagenesi, del "nucleo" del ripiegamento per due proteine (2CI2 e barnase) (Micheletti et al., 1999), lo studio di proteine di grande interesse biomedico, quali il prione e il doppel (Settanni et al., 2001,2002), l'inserzione e il ripiegamento di proteine elicoidali transmembranarie nella membrana lipidica (Orlandini et al., 2000).
Un altro risultato importante ottenuto di recente dallo stesso gruppo di Padova (Maritan et al., 2000; Banavar et al., 2002) è basato su di un modello "a grana grossa" nel quale la proteina è rappresentata per mezzo di un tubo di spessore finito ed è priva di ogni specificità dovuta alla particolare sequenza amminoacidica. Lo studio di tale modello ha evidenziato che qualora lo spessore del tubo sia comparabile a quello della distanza tipica dell'interazione idrofobica, gli stati fondamentali sono caratterizzati da una degenerazione marcatamente ridotta. Tali stati sono inoltre marginalmente compatti, ricchi di strutture secondarie quali eliche e foglietti planari, in accordo con motivi geometrici comunemente osservati nelle strutture proteiche. Un polimero con spessore ripiega in maniera rapida e riproducibile in conformazioni che condividono la flessibilità funzionale delle proteine. Questo modello è stato di recente arricchito con caratteristiche più specifiche di una catena polipeptidica (Hoang et al., 2004), ma che sono comunque comuni a tutte le proteine, quali il volume escluso, i legami idrogeno, e l'effetto idrofobico.
Il risultato principale ottenuto in questo ambito dal gruppo di Padova insieme ai propri collaboratori è la caratterizzazione di un profilo di energia libera prescolpito dalla presenza di relativamente pochi minimi anche in assenza di ogni specificità dovuta alla sequenza amminoacidica. Tali minimi corrispondono a conformazioni marginalmente compatte ottenute componendo eliche e foglietti planari, che possono poi essere selezionate come stati nativi da una data sequenza. Questo risultato implica che l'insieme delle possibili strutture native è predeterminato da principi generali di geometria e simmetria, prima ancora della scelta di una sequenza specifica, razionalizzando l'osservazione che esista in natura solo un insieme limitato di possibili architetture topologiche native che sono evolutivamente conservate (la stessa topologia nativa è presente in diverse specie).
Lo sviluppo di modelli di proteine "a grana grossa" è auspicabile non solo per meglio comprendere il meccanismo di ripiegamento, ma anche per approfondire la relazione fra struttura e funzionalità biologica delle proteine. Un confronto con modelli che tengono conto di tutto il dettaglio della struttura atomica ha ulteriormente rafforzato la credibilità dei modelli "a grana grossa", dando allo stesso tempo indicazioni per un loro possibile sviluppo. In questo ambito, i gruppi di Bari e Padova hanno già studiato i cosiddetti "modelli Gaussiani" e le loro implicazioni per l'evoluzione delle architetture proteiche, applicandoli allo studio della chinesina (Micheletti et al., 2002; Lattanzi, 2004).

D. Misture colloidali, proteine globulari e cristalli liquidi
Le sfide teoriche poste dalla ricerca nel campo delle proteine possono essere affrontate anche sfruttando conoscenze generali nel campo del fisica della matteria condensata soffice. Il gruppo di ricerca di Venezia ha particolarmente contribuito in questo campo riuscendo ad ottenere la semplificazione dei potenziali a molti componenti di Baxter che sono attualmente usati per modellare la "polidispersione" di miscele colloidali (Gazzillo et al. 2004, Fantoni et al. 2005), ovvero la compresenza di macroparticelle con differenti dimensioni e/o con una dispersione nei parametri che definiscono la forza delle interazioni. Inoltre, questa unità di ricerca ha già lavorato sul importante problema dato dall'effetto del solvente sulla struttura delle proteine, problema che condivide molte somiglianze con le problematiche dei sistemi colloidali. In particolare il gruppo di Venezia, in collaborazione con Ancona, ha recentemente proposto una semplice strategia che può essere utilizzata per interpretare le funzioni di scattering a basso angolo (Spinozzi et al. 2002, Giacometti et al. 2005). Il gruppo di Venezia, assieme all'unità di Padova, ha anche contribuito alla caratterizzazione dei diagrammi di fase dei cristalli liquidi , in particolare in situazioni dove viene introdotto del disordine tramite micelle. I risultati concordano con risultati Monte Carlo esistenti e con informazioni sperimentali (Bellini et al. 2003, Cagioni et al. 2005)

E. Studi di sistemi meccano-chimici.
Negli ultimi anni vi è stato un impressionante sviluppo delle tecniche sperimentali atte ad analizzare il comportamento individuale di macro-molecole biologiche (esperimenti a singola molecola). Queste macro-molecole sono proteine singole o complessi di proteine che possono svolgere differenti attività nella cellula ed il cui malfunzionamento è responsabile di numerose patologie. La dinamica di molti esperimenti può essere descritta in termini di una particella che si muove su di uno spazio bidimensionale, nel quale la prima dimensione rappresenta la coordinata meccanica (la posizione della molecola) mentre la seconda è specificata come una coordinata chimica (sistemi meccano-chimici). Le unità di ricerca di Bari e Padova hanno recentemente proposto un nuovo schema teorico (Lattanti et al. 2002), la cui idea centrale si basa su una ben definita procedura a grana grossa che è capace di colmare il divario fra formulazioni continue e modelli su reticolo. Il principale risultato di questo studio è la definizione di probabilità di transizione che sono dipendenti dalla forza. Lo schema è stato applicato con successo alla interpretazione di dati sperimentali sulla cinetica della cinesina (Lattanti et al. 2002,2004), un motore molecolare coinvolto nel trasporto di materiale negli assoni neuronali. Successivi dati sperimentali hanno poi confermato le previsioni da noi fatte. Altri esperimenti hanno messo a disposizione informazione di notevole importanza biologica che necessita di interpretazione, pensiamo per esempio a miosina V, miosina II, il motore F0-F1 Atpase, la translocazione di polimeri attraverso pori stretti e l'impacchettamento di DNARNA nei virus. <<<