RICERCA ITALIANA     

Processi chimici e modificazioni strutturali nella neurodegenerazione

Università degli Studi di Pavia

Abstract

La ricerca che si propone affronta il problema dell'origine delle modificazioni chimiche e delle variazioni conformazionali che subiscono le proteine coinvolte nella patogenesi di due importanti malattie neurodegenerative, il mobo di Parkinson (PD) e il morbo di Alzheimer (AD). Si studieranno gli effetti prodotti da vari agenti, come stress ossidativo e nitrativo, metalli redox attivi e dopammina. Ci si propone di chiarire la natura e i siti specifici di modificazione in diverse proteine per reazione con dopamminochinoni (DAQ) e altre specie reattive generate da enzimi o agenti chimici in condizioni di stress ossidativo e nitrativo.
In particolare verranno caratterizzati gli addotti proteine-DAQ formati nei neuroni dopaminergici e il loro ruolo nella sintesi della neuromelanina e nella neurodegenerazione. Colture neuronali e tessuti cerebrali di scimmia saranno impiegati come modelli in vivo. In parallelo verrà condotta un'analisi delle variazioni strutturali, conformazionali e di stabilità prodotti da metalli sui peptidi tossici dell'amiloide beta 1-42 (Abeta 1-42) e del frammento N-terminale della proteina prionica umana (PrP 84-114), all'origine di AD e delle encefalopatie trasmissibili. Le attività di ricerca si svilupperanno lungo le seguenti linee principali.
1) Espressione della tirosinasi umana e di altre proteine, generazione di addotti proteine-DAQ con tirosinasi e perossidasi e loro caratterizzazione.
Addotti proteine-DAQ verranno generati per ossidazione della dopammina da parte della tirosinasi in presenza dei bersagli proteici mioglobina, alfa-sinucleina, tirosina idrossilasi e PINK1, allo scopo di stabilire la reattività dei residui e il pattern globale di modificazione. I sistem di espressione della mioglobina umana, dell'alfa-sinucleina e della tirosina idrossilasi sono disponibili, mentre si sta sviluppando quello della tirosinasi umana. La modificazione dell'alfa-sinucleina verrà anche studiata in un ambiente membrano-mimetico, e si studierà la sua interazione con la tirosina idrossilasi.
2) Stabilità e aggregazione degli addotti proteine-DAQ.
Le variazioni strutturali subite dalle proteine modificate verranno esaminate su campioni omogenei isolati per HPLC. Si studierà la loro capacità di assumere strutture parziali amiloidogeniche e di generare fibrille. Si studieranno inoltre gli effetti strutturali e chimici causati dall'interazione delle proteine con eccesso di metalli redox.
3) Studio degli addotti proteina-DAQ in colture cellulari ed animali.
Livelli citosolici elevati di dopammina verranno indotti in colture neuronali e tessuti cerebrali di scimmia tramite trattamento con metanfetamina, L-Dopa e 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina. Nei tessuti cerebrali gli addotti proteina-DAQ verranno identificati nella sostanza nera, che è la principale regione contenente neuroni dopaminergici ed il bersaglio del PD. Questi esperimenti consentiranno di studiare la cascata di eventi: eccesso di dopammina citosolica-proteina-DAQ-formazione di vacuoli autofagici-accumulo di neuromelanina, cruciale nei processi patogenici del PD.
4) Effetto dei metalli sulla stabilità, struttura e conformazione di peptidi fibrillogenici.
Verranno sintetizzati in fase solida i peptidi Abeta 1-42, il suo frammento 1-16 e l'analogo mutato Y10-A, PrP 84-114 e vari analoghi mutati in cui His 85, 96 e 111 saranno sostituiti con Ala. Per aumentare la solubilità essi verranno coniugati con PEG. Di questi peptidi si studieranno gli equilibri di complessazione di rame(II) e zinco(II), la speciazione, la conformazione, la stabilità, le proprietà di coordinazione e la reattività. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Luigi CASELLA Università degli Studi di PAVIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Lo scopo del progetto di ricerca proposto è di chiarire le basi molecolari dei processi che inducono il misfolding e l'aggregazione delle proteine coinvolte in due importanti malattie neurologiche, il morbo di Parkinson (PD) e il morbo di Alzheimer (AD). Il punto di partenza della nostra ricerca è l'osservazione, che risulta da una grande varietà di esperimenti, che molte reazioni di ossidazione e nitrazione accompagnano i processi di misfolding e di aggregazione delle proteine neuronali, anche se ancora non è chiaro se questi processi sono all'origine delle modificazioni strutturali che avvengono nelle proteine o se si tratta invece di fenomeni secondari che compaiono solo in uno stato avanzato delle malattie. La comprensione dei meccanismi che inducono le modificazioni delle proteine sono perciò di enorme importanza per chiarire l'origine dei processi neurodegenerativi e programmare delle strategie per prevenirne l'induzione. La ricerca che si propone in questo progetto sfrutta le competenze complementari delle tre UO per condurre uno studio interdisciplinare delle modificazioni chimiche subite da alcune proteine neuronali e la loro rivelazione in modelli cellulari e animali. Competenze complementari sono assolutamente indispensabili a questo livello perchè la copertura di tutti gli aspetti implicati nella ricerca è impossibile all'interno di un singolo gruppo. La reattività delle specie chimiche coinvolte nella modificazione delle proteine (DAQ, ROS e RNS) richiede infatti la definizione di metodologie e protocolli per l'analisi e l'identificazione dei siti dove avvengono le reazioni, degli effetti strutturali e conformazionali prodotti dalle modificazioni chimiche e la scelta dei bersagli proteici fisiologicamente rilevanti che possono subire modificazioni chimiche in vivo. Gli obiettivi specifici principali del programma di ricerca sono descritti in dettaglio nel seguito.

1) Caratterizzare le forme chimiche in cui i dopamminochinoni (DAQ) prodotti per ossidazione enzimatica o chimica si legano ai residui proteici polari della mioglobina, dell'alfa-sinucleina, della tirosina idrossilasi e di PINK1 e caratterizzare i siti dove avvengono le reazioni con queste specie reattive. In particolare ci si propone di:
a) definire il ruolo potenziale dell'enzima tirosinase nell'induzione della tossicità della dopammina e confrontare i meccanismi e l'efficienza nell'ossidazione della dopammina da parte della tirosinasi e della perossidasi, entrambe competenti a catalizzare reazioni di ossidazione di composti fenolici;
b) studiare gli effetti paralleli e competitivi delle reazioni di nitrazione delle proteine da parte delle perossidasi in condizioni di stress nitrativo;
c) determinare i parametri cinetici di formazione di addotti proteine-DAQ, una informazione importante in quanto non tutti gli addotti formati possono avere effetti in vivo.

2) Determinare la stabilità e le proprietà di aggregazione degli addotti proteine-DAQ (ed altri derivati di proteine risultanti da reazioni di ossidazione e nitrazione), stabilire come le modificazioni influenzano la propensione delle proteine ad assumere conformazioni amiloidogeniche parzialmente folded e determinare la cinetica di formazione di fibrille.

3) Confrontare la modificazione subita dall'alfa-sinucleina in condizioni fisiologiche con quella in un ambiente che mima l'intorno di una membrana, allo scopo di correlare le modificazioni conformazionali con il potenziale ruolo protettivo esercitato dalle membrane contro il processo di oligomerizzazione della proteina indotto dai DAQ.

4) Fornire indicazioni per correlare la natura delle modificazioni con DAQ dell'alfa-sinucleina e l'effetto di inibizione della fibrillazione che si osserva per gli addotti alfa-sinucleina-DAQ. Questo aspetto è di particolare rilevanza in quanto entrambi gli effetti possono contribuire all'aumento di concentrazione degli intermedi protofibrillari che si ritengono essere le forme tossiche delle proteine nel PD.

5) Studiare l'effetto di formazione di addotti sull'attività della tirosina idrossilasi, in presenza dei potenziali agenti neurotossici ROS, RNS e DAQ.

6) Mappare le regioni proteiche di interazione tra l'alfa-sinucleina e la tirosina idrossilasi, tramite l'identificazione dei resiui delle due proteine coinvolti.

7) Stabilire la rilevanza fisiologica degli esperimenti proposti in modelli di sinaptosomi.

8) Studiare il ruolo della cascata di eventi: eccesso di dopamina citosolica  proteina-DAQ  formazione di vacuoli autofagici  accumulo di neuromelanina  perdita neuronale, per stabilire se questa può essere una via patogenica cruciale nel PD, tramite le seguenti valutazioni:
- Determinazione delle concentrazioni di dopamina e di 5-S-cisteinil-dopamina nelle colture neuronali mesencefaliche trattate con L-DOPA e metanfetamina.
- Identificazione degli addotti proteina-DAQ formatisi nelle colture neuronali trattate con L-DOPA e successivo confronto con quelli generati nelle stesse colture cellulari trattate con metanfetamina. Dato che la neuromelanina si forma solo in colture trattate con L-DOPA questo confronto indicherà quali specifiche proteine-DAQ sono coinvolte nella sintesi di neuromelanina.
- Determinazione della concentrazione di dopamina e di 5-S-cisteinil-dopamina nella sostanza nera di scimmia.
- Identificazione degli addotti proteina-DAQ nella sostanza nera di scimmia.
Determinazione della concentrazione di addotti proteina-DAQ, di vacuoli autofagici e di neuromelanina nella sostanza nera di scimmia. Correlazione della cascata di eventi eccesso di dopamina citosolica  proteina-DAQ  formazione di vacuoli autofagici  accumulo di neuromelanina con la perdita di neuroni dopaminergici nella sotanza nera di scimmia durante l'invecchiamento.

9) Sintetizzare con metodi in fase solida i peptidi amiloidogenici rilevanti in AD e nelle malattie da proteine prioniche (PrP):
a) Abeta 1-42 e il suo PEG coniugato, Abeta 1-16 e il suo PEG coniugato, Abeta 1-16 (Y10-A) in cui Tyr in posizione 10 è sostituito da Ala.
b) Prp 84-114, PrP 84-114 (H85-A), PrP 84-114 (H96-A), PrP 84-114 (Hiii-A), in cui residui His in posizione 85, 96 e 111 saranno rimpiazzati da Ala; PrP 91-115 e PrP 94-97.

10) Studiare la formazione di complessi di questi peptidi con ioni rame(II) e zinco(II), la loro speciazione, conformazione, stabilità, proprietà di coordinazione e la loro reattività.

11) Disegnare e sintetizzare nuove molecole bioconiugate dotate di attività antiossidanti, antiaggreganti e chelanti. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Nell'ultimo decennio si sono accumulate molte evidenze del fatto che il misfolding e l'aggregazione di proteine sono la causa più probabile di varie malattie neurologiche che, per questo motivo, sono spesso raggruppate sotto il nome comune di malattie da disordine conformazionale di proteine (PCDs) (Dobson, 1999; Soto, 2003). Questo gruppo comprende il morbo di Alzheimer (AD), quelli di Parkinson (PD) e di Huntington, l'encefalopatite spongiforme trasmissibile (TSEs), il diabete di tipo II, la sclerosi laterale amiotrofica e più di 15 altre malattie meno note (Martin, 1999). La caratteristica che contraddistingue i disordini conformazionali è che una particolare proteina si struttura in una diversa conformazione che, nella maggior parte dei casi, comporta la sua aggregazione e accumulo nei tessuti come depositi fibrillari. Questi depositi hanno caratteristiche morfologiche, strutturali e colorazione simili ma depositi di proteine diverse hanno differenti caratteristiche biochimiche in funzione della loro origine e della loro localizzazione intra- o extra-cellulare. In genere gli aggregati proteici hanno strutture che possono variare da amorfe ad aggregati altamente ordinati in beta-sheet. Il termine amiloide, originariamente usato per indicare depositi extracellulari di proteine trovati nell'AD e il disordine sistemico di amiloide è ora usato con un senso più largo in riferimento agli aggregati proteici organizzati in strutture cross-beta-sheet, resistenti alla degradazione proteolitica e che, osservate per microscopia elettronica, hanno aspetto fibrillare.
Nell'uomo si sono identificate circa 20 proteine che causano questo tipo di malattie. E' sorprendente che queste proteine non hanno omologia di sequenza e sono strutturalmente diverse.
La prima indicazione che il misfolding di proteine fosse coinvolto in malattie neurodegenerative deriva da studi neuropatologici post-mortem. La caratteristica neuropatologica che contraddistingue l'AD, placche amiloidi neuritiche e grovigli neurofibrillari, fu descritta circa un secolo fa da Alois Alzheimer. Le placche amiloidi sono depositate extracellularmente nel parenchima del cervello e attorno alla corteccia cerebrale. Il loro componente principale è un peptide di 40 o 42 residui chiamato proteina beta amiloide (Abeta) (Glenner and Wong, 1984). I grovigli sono localizzati nel citoplasma dei neuroni degenerate e contengono aggregati della proteina tau iperfosforilata (Grundke-Iqbal et al., 1986). Nei pazienti affetti da PD il citoplasma dei neuroni della substantia nigra contiene aggregati chiamati corpi de Lewy (Forno, 1996). I costituenti principali di questi aggregati sono frammenti della proteina alfa-sinucleina (Spillanti ed al., 1997). I cervelli degli uomini e degli animali che sono stati affetti da varie forme di TSE sono caratterizzati dall'accumulo di aggregati della proteina prione (PrP), in alcuni casi in una forma simile alle placche amiloidi della AD (Bolton ed al., 1982).
Sono stati proposti molti meccanismi per collegare il misfolding di proteine e l'aggregazione (Soto, 2001). Studi cinetici hanno mostrato che l'aggregazione dell'Abeta, dell'alfa sinucleina, del PrP e di altre proteine segue un meccanismo di seminazione/nucleazione (Jarrett et al., 1993; Wood et al., 1999; Soto, 2003). L'evento critico è la formazione di oligomeri proteici che possano agire da agenti nucleanti per l'ulteriore crescita degli aggregati. Sono stai individuati due tipi di intermedi nel processo dalla proteina nativa alla struttura di aggregati fibrillari. Il primo sono oligomeri solubili (da dimeri a decametri) trovati nel caso dell'Abeta sia in esperimenti in vitro sia in omogenati di cervello umano. (Kuo et al., 1996; Walsh D. M. Et al., 2002; Bernstein et al., 2005). I secondi intermedi sono strutture corte, flessibili e a forma di bacchetta chiamate protofibrille; esse sono larghe da 3 a 6 nm e lunghe fino a 100 nm (Walsh ed al., 1999). Le protofibrille sono in equilibrio dinamico con le Abeta oligomeriche e sono i diretti precursori delle fibrille di tipo amiloide. Studi sulla struttura secondaria mostrano che le protofibrille hanno un elevato contenuto di beta-sheet e legano coloranti specifici per amiloidi come il rosso congo e la tioflavina T (Walsh et al., 1999). Le protofibrille sono state anche osservate nel processo di aggregazione dell'alfa-sinucleina (Conway et al., 1998). I veri composti tossici potrebbero essere queste protofibrille piuttosto che i corpi di Lewy o i grovigli neurofibrillari stessi (Conway et al., 2001; Soto, 2003).
Ma perché le proteine vanno incontro a variazioni strutturali che comportano un loro diverso stato di aggregazione, che in alcuni casi può avere effetto tossico? Le evidenze che si stanno accumulando da una grande varietà di studi indicano che lo stress ossidativo e nitrativo, attraverso la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e dell'azoto (RNS), sono i principali eventi, tipicamente collegati all'età, responsabili delle modificazioni chimiche sulle proteine neuronali (Ischiropoulos and Beckman, 2003). Le modifiche da danno ossidativo o nitrativo possono infatti avvenire su vari residui proteici e queste modificazioni portano all'accumulo di aggregati proteici anormali, che sono coinvolti nella patogenesi e nella progressione di numerose malattie neurodegenerative, tra cui l'AD (Butterfield ed al., 2003) e il PD (Dawson e Dawson, 2003). L'accumulo di metalli redox attivi, in particolare il ferro, nell'invecchiamento cerebrale può generare ROS e altri ossidanti, causando così neurodegenerazione. Il ruolo patogenico del ferro nell'invecchiamento cerebrale coinvolge la triade: accumulo del ferro, invasione cellulare e aumento di reattività (Zecca ed al., 2004). Il ruolo degli ioni metallici è però più complesso, come nel caso dell'Abeta in cui la proteina lega il rame(II) con alta affinità e il legame induce sia l'aggregazione del peptide (Atwood ed al., 1998) sia l'attività catalitica di tipo ossidasico che produce la specie neurotossica perossido di idrogeno (Opazo ed al., 2002). Il ferro può interagire con le proteine, tra cui l'alfa-sinucleina, ed indurre la formazione di aggregati intracellulari con l'effetto conseguente della morte neuronale nel PD (Ostrerova-Golts et al., 2000). Il legame del rame nel caso della PrP assicura un effetto benefico, in condizioni normali, di attività superossido dismutasica (Brown ed al., 1999); la conversione nell'isoforma tossica riduce però marcatamente la capacità della proteina di legare il rame e rende le cellule infette più suscettibili allo stress ossidativo (Rachidi ed al., 2003). Nel danno neuronale è stato confermato il ruolo degli RNS, che possono venir generati dalla reazione tra ossido di azoto e anione superossido (Huie and Padmaja, 1993) o dai metaboliti dell'NO per catalisi da parte di metalloenzimi (Monzani ed al., 2004). Infatti si osserva spesso un aumento della quantità di proteine nitrate associato a vari disordini neurologici come l'ischemia, il morbo di Parkinson (PD) e il morbo di Alzheimer (AD) (Good et al., 1998; Giasson et al. 2002; Lyras et al., 1998).
Nonostante vi sia una documentazione sufficiente a porre lo stress ossidativo e nitrativo al centro dei meccanismi della patogenesi che porta alla perdita neuronale e alla neurodegenerazione, rimangono ancora da chiarire sia la conoscenza dei siti prossimali di generazione delle specie reattive sia l'insieme delle modifiche indotte da queste specie reattive. Come conseguenza le cause di quasi tutti i casi di PCD sono ancora ignote.
L'osservazione che uno dei principali segni distintivi del PD sia la notevole perdita di neuroni dopaminergici nella substantia nigra, che causa un esaurimento della dopamina nello striato, suggerisce che, oltre al suo possibile ruolo nella generazione di ROS per autossidazione, la dopammina possa avere un ruolo più diretto nella modificazione delle proteine. L'ossidazione della dopammina infatti produce specie chinoniche (DAQ) che sono potenzialmente molto reattive verso i gruppi nucleofilici presenti nelle catene laterali di molti residui amminoacidici polari. Sono stati individuati molti meccanismi responsabili dello stress ossidativi indotto dall'ossidazione della dopammina (Asanuma, 2003). Un aspetto chiave è la quantità di dopammina presente nel citoplasma e quindi al di fuori delle viscicole sinaptiche dove, in condizioni fisiologiche, il neurotrasmettitore è prevalentemente confinato. Il livello citoplasmatico di dopammina è il risultato di almeno tre processi: la sua ossidazione chimica o enzimatica a DAQ, il suo trasporto attraverso i diversi comparti cellulari e la sua biosintesi da parte della tirosina idrossilasi. E' stato dimostrato che sia il trasportatore di dopammina nell'uomo (Whitehead ed al., 2001) sia la tirosina idrossilasi (Xu et al., 1998; Kuhn et al., 1999) sono inibiti dal legame covalente di specie DAQ. Però i DAQ hanno molti possibili bersagli per la modificazione chimica; in particolare è stato mostrato che essi si legano all'alfa-sinucleina rallentandone la conversione delle protofibrille in fibrille (Conway ed al., 2001). Le protofibrille di alfa-sinucleina rendono permeabili le vescicole sintetiche e formano degli assembramenti simili a pori sulle vescicole derivate dal cervello. Questa scoperta suggerisce che la dopammina citosolica presente nei neuroni dopaminergici promuove l'accumulo di protofibrille tossiche di alfa-sinucleina; ciò potrebbe spiegare perché questi neuroni siano più vulnerabili alla degenerazione in PD (Rochet ed al., 2004).
Si pensa che l'ossidazione della dopammina giochi un ruolo in un numero di modelli che mimano il PD in cui il danno dei neuroni dopaminergici è indotto da tossine (Sulzer and Zecca, 2000). La tossicità indotta dalla metanfetamina comporta una perdita di terminali della dopammina e la tossicità è stata collegata alla presenza di dopammina e ad una aumentata modificazione, da parte dei DAQ, di residui proteici di cisteina in residui di cisteinil-dopammina (Larsen et al., 2002). Sono stati riportati livelli maggiori di cisteinil-dopammina anche in topi trattati con 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina; ciò supporta l'osservazione che l'ossidazione della dopammina giochi un ruolo nello stress ossidativo associato alla tossicità in vitro dello ione 1-metil-4-piridinio (Lotharius and O'Malley, 2000). L'iniezione intrastratiale di dopammina esogena genera la modificazione delle proteine da parte di DAQ e la perdita selettiva dei terminali della dopammina che può essere bloccata dalla co-somministrazione di antiossidanti (Hastings et al., 1996).
Un fattore chiave associato alla vulnerabilità selettiva dei neuroni nel PD è la neuromelanina la cui sintesi dipende dalla dopammina (Sulzer ed al., 2000). Le specie DAQ generate dall'ossidazione della dopammina possono infatti ciclizzare a dare il dopacromo e quindi polimerizzare in vari modi a dare neuromelanina. Infatti la sintesi della neuromelanina può essere indotta nella substantia nigra dei ratti e nella colture di cellule PC12 tramite esposizione a L-Dopa, che viene velocemente convertita a dopammina nel citosol. Il pigmento prodotto in questo modello è simile alla neuromelanina umana. Inoltre esso è localizzato in organelli caratteristici circondati da una doppia membrana, come nel caso della neuromelana naturale umana. Questi organelli sono apparentemente organelli autofagici formati come risposta allo stress cellulare e si pensa sequestrino citosol e organelli danneggiati per il trasporto verso il processo di degradazione (Sulzer ed al., 2000). Quindi la sintesi della neuromelanina sembra sia guidata da un eccesso di dopammina citoplasmatica che non è accumulata nelle vescicole sinaptiche: questo potrebbe essere un processo protettivo in quanto previene l'accumulo tossico di dopammina, chinoni e addotti con DAQ nei neuroni dopaminergici (Sulzer ed al., 2000). Anche altre specie come lipidi e peptici partecipano a questo processo a più stadi (Zucca ed al., 2004). Ci sono aspetti importanti in comune tra il meccanismo patogenico del misfolding/aggregazione di proteine e quello di formazione di proteine DAQ/neuromelanina. In entrambi i processi patogenici proteine misfolded o modificate da DAQ possono indurre degenerazione neuronale (Xu et al., 2002; Wirths et al., 2004). Inoltre le proteine aggregate come Abeta e la neuromelanina possono attivare la microglia e quindi causare neurodegenerazione (Ikezu et al., 2003; Zecca et al., 2003). <<<