RICERCA ITALIANA     

Sistemi colloidali e chimici avanzati per il trattamento di patologie neurodegenerative del SNC.

Università degli Studi di Catania

Abstract

Le patologie neurodegenerative del SNC rappresentano uno dei settori per i disperately needed drugs. L'invecchiamento della popolazione nei Paesi occidentali e la maggior esposizione a non ben conosciute fonti di stress ossidativo e di inquinamento ambientale provocano una maggior incidenza di molte affezioni che, sebbene diagnosticate sul piano clinico e sintomatologico, tuttavia non godono dell'applicazione di programmi terapeutici realmente efficaci. Ciò perché in parte le reali cause eziologiche di alcune patologie non sono ancora completamente chiare e definite; ovvero perché anche molti dei rimedi terapeutici utilizzati ormai da tempo, come diversi farmaci usati nel Parkinson, non presentano ancora un profilo farmacocinetico, biofarmaceutico e tossicologico ottimale.
Da qui la continua richiesta di interventi di tipo chimico e tecnologico miranti a migliorare stabilità, biodisponibilità e compliance dei pazienti sottoposti a tali terapie – in genere di lunga durata.
La moderna tecnologia farmaceutica offre diversi spunti formulativi che possono venire in aiuto di questo tipo di domanda: sistemi per il rilascio controllato di farmaci, nano- e micro-sistemi per il drug delivery ed il direzionamento selettivo al cervello, sistemi di inclusione in ciclodestrine, profarmaci e bioconiugati polimerici, sono alcuni degli esempi ritrovabili in letteratura – ma anche già in terapia – progettati per aumentare l'efficacia e la sicurezza di molecole attive nel SNC. Un aspetto ulteriore che questi approcci offrono, è quello di poter veicolare efficacemente anche sostanze di natura peptidica e proteica, anche per vie di somministrazione diverse da quella parenterale, quali molti dei prodotti che quotidianamente le nuove biotecnologie mettono a disposizione del clinico.
I componenti delle unità operative coinvolte nel progetto sono state lungamente impegnate negli ultimi anni in ricerche attinenti alla veicolazione ed al targeting cerebrale di farmaci ad attività antiossidante, nootropica, cerebrotonica, etc. Molte di tali ricerche sono state condotte nell'ambito di due progetti finanziati dal MIUR (Cofin2001 e Cofin2003 – Prof. G. Puglisi) ed i cui risultati hanno permesso di individuare e selezionare, tra i diversi approcci proposti, sistemi di veicolazione di farmaci ed approcci chimici (profarmaci) idonei al presente progetto.
La base di partenza scientifica di questo progetto, dunque, è in gran parte rappresentata dalle esperienze acquisite dalle diverse U.O. nei due bienni precedenti. Tali evidenze sperimentali consentiranno, nella presente ricerca, di ridurre la fase di messa a punto e validazione dei sistemi tecnologici e chimici proposti, e di valutarne immediatamente l'applicazione alle molecole proposte.
A questo riguardo, si è pensato di focalizzare l'attenzione su alcuni farmaci già utilizzati o proposti per la cura dell'AD e del Parkinson, così come pure di altre patologie neurodegenerative del SNC. In particolare melatonina, L-DOPA, rivastigmina, leupeptina, D-cicloserina. Queste ultime due molecole rappresentano in qualche modo anche due farmaci modello di natura peptidica/amminoacidica che ci consentiranno di valutare l'applicabilità degli approcci adottati a sostanze di tale natura.
Verranno seguiti due percorsi paralleli nella messa a punto di strategie di drug delivery al cervello: da un lato la sintesi di profarmaci e bioconiugati lipofili di farmaci e neurotrasmettitori, in grado di assicurare un targeting attivo o passivo al SNC. Dall'altro, l'inclusione dei farmaci scelti, e dei loro profarmaci di cui sopra, in sistemi carrier colloidali: nanoparticelle polimeriche biodegradabili, SLN, liposomi direzionati.
Tutte le sostanze e i sistemi sopramolecolari preparati saranno caratterizzati da un punto di vista fisico-chimico e tecnologico e ne verrà valutato il profilo biofarmaceutico e, ove risultasse interessante, l'attività farmacologica in vitro ed in vivo. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Giovanni PUGLISI Università degli Studi di CATANIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Come ulteriore perfezionamento di precedenti progetti di ricerca finanziati dal MIUR (Cofin2001 e Cofin2003), si intende applicare le conoscenze di base acquisite nella realizzazione di drug delivery systems di natura colloidale (nanoparticelle, solid lipid nanoparticles-SLN, liposomi), così come nella realizzazione di profarmaci selettivi per il SNC, a molecole di farmaci e neurotrasmettitori utilizzati o proposti per la cura di affezioni neurodegenerative del SNC, prime fra tutte il morbo di Alzheimer (AD) ed il Parkinson.
Sono stati pertanto identificati alcuni farmaci in comune tra le cinque unità di ricerca che saranno utilizzati per la veicolazione nei diversi carrier di trasporto o per una modifica chimica bioreversibile. Scopo finale di entrambi i tipi di approcci - tecnologici e chimici- è quello di migliorare sia la distribuzione intracerebrale di questi agenti terapeutici, sia di ottimizzarne il profilo farmacocinetico e biofarmaceutico e l'attività terapeutica complessiva. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Le patologie neurodegenerative a carico del SNC rappresentano oggi uno dei settori di disperately needed drugs. L'invecchiamento medio della popolazione nei Paesi occidentali e la maggior esposizione a non ben conosciute fonti di stress ossidativi e di inquinamento ambientale provocano una maggior incidenza epidemiologica di molte affezioni che, sebbene diagnosticate sul piano clinico e sintomatologico, tuttavia non godono dell'applicazione di programmi terapeutici realmente efficaci. Ciò perché in parte le reali cause eziologiche di alcune patologie, quali il morbo di Alzheimer (AD), non sono ancora completamente chiare e definite; ovvero perché anche molti dei rimedi terapeutici utilizzati ormai da molti anni, quali diversi farmaci usati nel morbo di Parkinson, non presentano ancora un profilo farmacocinetico, biofarmaceutico e tossicologico ottimale.
Da qui, la continua richiesta di interventi di tipo chimico e tecnologico miranti a migliorare stabilità, biodisponibilità e compliance da parte dei pazienti sottoposti a tali terapie – in genere di lunga durata.
Appare inoltre plausibile ipotizzare che in tutte le forme neurodegenerative esista una comune via, la quale, una volta scoperta, può condurre ad una comprensione del meccanismo di una ampia varietà di malattie che conducono a necrosi tissutale, e che si prestano ad essere oggetto dell'intervento terapeutico. Recentemente sono stati compiuti notevoli progressi nel chiarimento di questa via comune grazie allo studio del ruolo esercitato dalla Calpaina in questo processo (Ard et al., 1996). La proteolisi incontrollata indotta dalla Calpaina, iniziata dalla mancata regolazione dell'omeostasi degli ioni calcio, partecipa alla patogenesi di una ampia gamma di malattie quali ischemia, danni al midollo spinale ed al tessuto nervoso, sclerosi laterale amiotrofica, Morbo di Alzheimer, distrofia muscolare, e costituisce potenzialmente il loro meccanismo patogenetico unificante (Stracher, 1999).
Le Calpaine sono proteasi intracellulari calcio-dipendenti che sono attivate in un gran numero di condizioni patologiche. E' stato dimostrato che la capacità di inibitori delle proteasi, come la leupeptina, di proteggere dalla degenerazione neuronale indotta dalla ipossia o dalla ischemia cerebrale transitoria (Arai et al., 1997). Tuttavia l'impiego terapeutico della leupeptina e di altri inibitori delle proteasi non è attualmente possibile a causa della incapacità di tali sostanze di attraversare la barriera ematoencefalica (Kuki et al., 1996).
La barriera ematoencefalica (BEE) rappresenta un ostacolo alla penetrazione di molti farmaci nel cervello ed alla loro efficacia terapeutica. Di qui l'interesse ad individuare nuovi approcci per la cura di patologie cerebrali, che rappresenta un campo di ricerca molto importante anche per l'industria farmaceutica. Infatti, sia a livello accademico sia a livello di ricerca industriale, molti sforzi sono stati fatti nello studio del rilascio al SNC di farmaci e neurotrasmettitori coinvolti in molte delle citate patologie.
La moderna tecnologia farmaceutica offre diversi spunti formulativi che possono venire in aiuto di questo tipo di domanda. Sistemi per il rilascio controllato di farmaci, nano- e micro-sistemi per il drug delivery ed il direzionamento selettivo di farmaci al cervello, sistemi di inclusione in ciclodestrine, profarmaci e bioconiugati polimerici, sono alcuni degli esempi ritrovabili in letteratura – ma anche già in terapia – progettati per aumentare l'efficacia e la sicurezza di molecole attive nel SNC. Un aspetto ulteriore che questi approcci offrono, è quello di poter veicolare efficacemente anche sostanze di natura peptidica e proteica, anche per vie di somministrazione diverse da quella parenterale, quali molti dei prodotti che quotidianamente le nuove biotecnologie mettono a disposizione del clinico.

I componenti delle unità operative coinvolte nel presente progetto sono state lungamente impegnate negli ultimi anni in ricerche attinenti alla veicolazione ed al targeting cerebrale di farmaci ad attività antiossidante, nootropica, cerebrotonica, etc. Molte di tali ricerche sono state condotte nell'ambito di due progetti finanziati dal MIUR (Cofin2001 e Cofin2003 – Resp. Prof. G. Puglisi) ed i cui risultati, dei quali alcuni ancora parziali, hanno permesso di individuare e selezionare, tra i diversi approcci proposti, sistemi di veicolazione di farmaci ed approcci chimici (profarmaci) idonei al presente progetto.
La base di partenza scientifica di questo progetto, dunque, è in gran parte rappresentata dalle esperienze acquisite dalle diverse U.O. nei due bienni precedenti. Tali evidenze sperimentali consentiranno, nella presente ricerca, di ridurre la fase di messa a punto e validazione dei sistemi tecnologici e chimici proposti, e di valutarne immediatamente la applicazione alle molecole proposte.
A questo riguardo, si è pensato di focalizzare l'attenzione delle diverse UO su alcuni farmaci già utilizzati o proposti per la cura dell'AD e del Parkinson, così come pure di altre patologie neurodegenerative del SNC. In particolare, le UO applicheranno le diverse strategie da esse sviluppate alla melatonina, L-DOPA, rivastigmina, leupeptina, D-cicloserina. Queste ultime due molecole rappresentano in qualche modo anche due farmaci modello di natura peptidica/amminoacidica che ci consentiranno di valutare l'applicabilità degli approcci adottati a sostanze di tale natura, come sopra discusso.
Per alcuni di questi farmaci, come nel caso della melatonina, il ricorso a vettori chimici o tecnologici ha la finalità prevalente non tanto di aumentare la disponibilità nel SNC – dato che questa molecola è fisiologicamente capace di superare la BEE – quanto di ottenere un rilascio controllato e prolungato nel tempo, che ne consenta di sfruttare in maniera più efficace le diverse azioni biologiche, non ultima l'attività antiossidante a livello cellulare, di potenziale interesse nella prevenzione e cura di patologie neurodegenerative. Nonostante gli studi di farmacocinetica sull'uomo siano limitati è oramai appurato che, per quanto riguarda la biodisponibilità, esistono notevoli differenze individuali dovute a diversità nell'assorbimento della melatonina. Indipendentemente da queste differenze, dagli studi di farmacocinetica emerge chiaramente che una terapia sostitutiva, che preveda la somministrazione di una singola dose di melatonina, anche se elevata, a rilascio rapido, non sarebbe sufficiente per ottenere e mantenere una concentrazione fisiologica nel tempo tale di essere in grado di assicurare un effetto terapeutico. Inoltre, essendo il profilo di concentrazione ematico della melatonina caratterizzato da due picchi, un preparato a lento rilascio non sarebbe in grado di emulare le concentrazioni naturali. Di conseguenza si impone la necessità di una terapia sostitutiva di melatonina con formulazioni a rilascio controllato (Ditgen e Hoffman, 1998).
Anche la L-DOPA è caratterizzata da una breve emivita plasmatici, che richiede frequenti somministrazioni orali nel corso della giornata per garantire livelli costanti ed efficaci di dopamina nel cervello. Sistemi tecnologici e/o chimici capaci di mantenere costante il rilascio del farmaco nel sangue possono dunque contribuire a migliorare la compliance dei pazienti ed, in definitiva, l'efficacia terapeutica del principio attivo.

Uno dei vari approcci utilizzabili per il rilascio di sostanze biologicamente attive al S.N.C. è rappresentato dalla somministrazione di un valido profarmaco lipofilo, ottenibile mediante appropriata modificazione chimica del composto farmacologicamente attivo.
In precedenti ricerche sono ad es. stati descritti composti imidazopiridinici analoghi dell'Alpidem, in grado di attraversare la BEE e legarsi con alta selettività ed affinità ai recettori benzodiazepinici (Trapani et al., 1999; Serra et al., 1999). Le porzioni imidazopiridinacetiche sono state coniugate con glicina e con il GABA al fine di conseguire un rilascio mirato di questi neurotrasmettitori al SNC (Trapani et al., 2003). Successivamente, mediante coniugazione della dopamina, del suo bioprecursore L-Dopa o dell'estere etilico di quest'ultimo composto con i predetti acidi imidazopiridinacetici sono stati ottenuti nuovi analoghi dell'Alpidem. Alcuni di questi risultano caratterizzati da un alto valore di logBB e di conseguenza potrebbero attraversare piuttosto facilmente la BEE. Di questi ultimi composti, che non risultano avere affinità per il recettore dopaminergico, sono state inoltre accertate la capacità di permeare i monostrati cellulari BBMEC, mimanti la BEE, e l'affinità per i recettori gabaergici. Questi ultimi risultati, che riguardano una ricerca già cofinanziata dal MIUR (COFIN 2003 Puglisi), ci inducono a coniugare la dopamina, la L-Dopa e l'estere etilico di quest'ultimo composto con residui imidazopiridinacetammidi aventi alta selettività ed affinità per i recettori benzodiazepinici. I composti risultanti potrebbero anch'essi attraversare la BEE ed interagire con recettori sia di tipo gabaergico che dopaminergico. Composti con tali proprietà potrebbero risultare particolarmente interessanti nel trattamento di patologie degenerative del SNC, come ad esempio la malattia di Parkinson, nelle quali sono coinvolti diversi sistemi di neurotrasmissione.

Una seconda strategia chimica utilizzata per ottenere profarmaci lipofili è stata quella della coniugazione di farmaci con residui di lipoammino acidi (LAA). I LAA sono delle molecole di alfa-amminoacidi derivatizzate in posizione -2 con residui di acidi alifatici lineari, il cui numero, tipo e lunghezza della catena consentono di modulare la lipofilia finale della molecola del coniugato (Toth, 1994). La coniugazione con LAA non aumenta solamente la lipofilia del farmaco ma, modificando l'anfifilicità dello stesso, gli impartisce un "membrane-like character" che ne può agevolare il superamento delle membrane biologiche, compresa la BEE. Inoltre, la presenza del residuo lipidico può ostacolare la degradazione enzimatica del farmaco nel plasma, conconseguente aumento dell'efficienza e della durata terapeutica e miglioramento della biodisponibilità della somministrazione.
La sintesi di coniugati con LAA è stata studiata per diversi farmaci, utilizzati o proposti nella prevenzione e nel trattamento di diverse patologie neurogenerative: il cloricromene (AD6), un farmaco con molteplici attività a livello del SNC (Pignatello et al., 2002), il riluzolo, farmaco di scelta nel trattamento della sclerosi laterale amiotrofica (dati non pubblicati), idebenone (Pignatello et al.2004; Puleo et al. 2004), un agente antiossidante proposto nella terapia di recupero dell'ischemia cerebrale, ed il flurbiprofen (Pignatello et al., in press), un FANS da poco proposto nella terapia dell'AD come inibitore della produzione del peptide beta-amiloide.
In particolare, in queste ricerche la coniugazione dei principi attivi è stata eseguita utilizzando, accanto ai LAA a lunga catena, impiegati nei lavori originali di Toth e coll., anche alchilammino acidi a corta e media catena alifatica (C-4 - C-10); ciò al fine di evitare che l'eccessiva lipofilia dei coniugati ottenuti potesse ridurre eccessivamente la solubilità dei composti nei media di coltura e nei fluidi biologici.

Una terza strategia chimica investigata nel corso dei due bienni precedenti è quella della sintesi di profarmaci sistemi chimici in grado di trasportare colina attraverso la barriera ematoncefalica e di liberarla nel cervello. Questo approccio trova fondamento nel noto fatto che il morbo di Alzheimer ed altre malattie Alzheimer-simili sono caratterizzate dal declino delle capacita' cognitive e perdita di memoria come conseguenza di disfunzioni in vari sistemi di neurotrasmissione, come ad esempio i sistemi serotononergico , noradrenergico, dopaminergico, gabaergico, con una maggiore compromissione del sistema colinergico (Whitehouse et al. 1982).
In quest'ambito sono stati messi a punto sistemi chimici costituiti da esteri della colina in grado di superare la barriera ematoencefalica producendo in idonei modelli animali positivi effetti comportamentali ed elettroencefalografici (Carelli et al. 2000; Rispoli et al., 2004a; Rispoli et al., 2004b); l'attività di tali composti è stata attribuita ad una attivazione del sistema colinergico esercitata sia per effetto dell'inibizione competitiva dell'acetilcolinesterasi sia per la liberazione della colina a seguito di idrolisi (Alcaro et al., 2002).
Un più recente approccio al trattamento terapeutico della malattia di Alzheimer (AD) deriva dalle conoscenze riguardanti il ruolo dei recettori glutammatergici, in particolare del sottotipo N-metil-D-aspartico (NMDA), nell'apprendimento e nella memoria. Composti come la cicloserina, un agonista parziale del sito glicinico B del recettore NMDA, hanno mostrato infatti effetti positivi sulle capacità cognitive in modelli animali di demenza aprendo così la strada allo sviluppo di derivati della cicloserina capaci di modulare il rilascio di aminoacidi eccitatori e quindi l'attivazione dei recettori NMDA a cui è legato lo sviluppo della potenziazione a lungo termine, un modello per l'apprendimento e la memoria.
Un'ulteriore possibilità di sviluppo terapeutico è rappresentata dalle proprietà di derivati della serotonina, come la melatonina, che hanno mostrato effetti mnemonici positivi e proprietà neuroprotettive nei confronti della neurotossicità indotta dal peptide beta-amiloide e da stress ossidativi (Bachurin et al, 1999; Pappolla et al., 2000). <<<