RICERCA ITALIANA     

Sistemi innovativi basati su un array di sensori di gas per il monitoraggio di biomarker a fini diagnostici

Università degli Studi di Messina

Abstract

E' noto che alcune patologie inducono l'emissione nell'espirato di composti specifici. Alla base di questo fenomeno risiedono alterazioni della normale fisiologia e metabolismo, che inducono nell'organismo malato la produzione di nuove e diverse specie chimiche, nonché il quasi istantaneo equilibrio, a livello degli alveoli polmonari, tra componenti ematiche volatili ed aria alveolare. Tale processo di scambio, regolato dalla legge di Henry, avviene ovviamente nelle due direzioni, dall'aria esterna verso il sangue e dal sangue verso l'aria esterna.
L'analisi dell'espirato, metodo diagnostico poco invasivo, si presta quindi sia al monitoraggio dell'esposizione dell'individuo a composti volatili esogeni, sia alla diagnosi ed al monitoraggio del decorso di malattie che diano luogo alla produzione di nuovi composti endogeni normalmente assenti nell'espirato. Tuttavia, al momento attuale ancora diversi ostacoli si frappongono al suo esteso utilizzo nella normale pratica clinica, tra i quali la mancanza di procedure standardizzate di campionamento ed analisi, il costo della strumentazione necessaria e la necessità di personale competente in grado di utilizzarla. Questi ostacoli, unitamente alla variabilità intra ed interindividuale, hanno fatto sì che solo per poche patologie siano noti marker specifici.
Il presente progetto vuole fornire un contributo per colmare questa lacuna conoscitiva e porre le basi per lo sviluppo di una strumentazione diagnostica potenzialmente a basso costo ed utilizzabile da personale non esperto basata su matrici di sensori di gas. In particolare, esso sarà articolato secondo tre linee di ricerca, ciascuna con un obiettivo specifico, che verranno portate avanti in maniera coordinata dalle tre unità operative:
1. Implementazione di metodologie analitiche per la caratterizzazione dell'espirato umano;
2. Messa a punto di un efficiente sistema di raccolta, trattamento e conservazione dei campioni di espirato;
3. Sviluppo di sensori specifici per i composti di interesse.
Attività trasversali alle tre linee di ricerca, che vedranno coinvolte tutte le unità operative, saranno lo sviluppo di metodi per la riduzione degli effetti degli interferenti chimici e la concentrazione delle specie di interesse (sviluppo di sensori con poca sensibilità al vapore acqueo e di interfacce per l'arricchimento selettivo dei marker individuati) nonché la verifica dei risultati. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Giovanni NERI Università degli Studi di MESSINA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Obiettivo generale del presente progetto di ricerca è lo sviluppo di un sistema di campionamento e analisi dell'espirato, metodo diagnostico poco invasivo, che si presti quindi sia al monitoraggio dell'esposizione dell'individuo a composti volatili esogeni, sia alla diagnosi ed al monitoraggio del decorso di malattie attraverso il monitoraggio di marker specifici nell'espirato. Il presente progetto vuole porre le basi per lo sviluppo di una strumentazione diagnostica potenzialmente a basso costo basata su matrici di sensori di gas ed utilizzabile da personale non esperto. Questo obiettivo sarà perseguito attraverso l'unione delle competenze specifiche e complementari disponibili presso le Unità operative impegnate nel progetto.
In particolare, il progetto sarà articolato secondo tre linee di ricerca, ciascuna con un obiettivo specifico, che verranno portate avanti in maniera coordinata dalle tre unità operative:
1. Implementazione di metodologie analitiche per la caratterizzazione dell'espirato umano;
2. Messa a punto di un efficiente sistema di raccolta, trattamento e conservazione dei campioni di espirato;
3. Sviluppo di sensori a semiconduttore specifici e array di sensori per i composti di interesse.
Attività trasversali alle tre linee di ricerca, che vedranno coinvolte tutte le unità operative, saranno lo sviluppo di metodi per la riduzione degli effetti degli interferenti chimici e la concentrazione delle specie di interesse (sviluppo di sensori con poca sensibilità al vapore acqueo e di interfacce per l'arricchimento selettivo dei marker individuati), la realizzazione di una adatta elettronica di supporto che gestisca il funzionamento del dispositivo nel suo complesso, l'aquisizione dei dati nonché la verifica dei risultati e la validazione del sistema. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Negli ultimi anni promettenti risultati hanno rivelato le potenzialità del monitoraggio biochimico non invasivo del respiro umano a fini diagnostici [1,2,3,4,5,6,7,8]. Infatti, grazie all'equilibrio quasi istantaneo fra il sangue e l'aria presente negli alveoli polmonari [7], il campionamento di sostanze organiche nell'aria espirata può fornire informazioni sui processi biochimici in atto. Più di 500 di questi composti sono stati descritti [1]. Queste sostanze volatili possono essere di origine endogena, ossia essere generate dall'organismo stesso oppure esogena e provenire da contaminazioni ambientali. Al fine di monitorare i processi organici metabolici o patologici, è fondamentale riuscire ad individuare le sostanze endogene. I composti endogeni includono gas inorganici come NO e CO, composti organici volatili (VOC) come etano, pentano e isoprene e altre sostanze di cui alcune di queste correlabili a diverse patologie [1, 2-5]. La letteratura medica riporta numerosi e-sempi di correlazione tra patologie e marker chimici presenti nell'espirato [1,3]: acetone per il diabete [9,10], ammoniaca per disfunzioni del metabolismo degli amminoacidi [11], dimetilammina per le disfunzioni renali [11], dimetilsolfuro per le disfunzioni epatiche [11], idrogeno per disfunzioni nella metabolizzazione del lattosio [12], isoprene legato al metabolismo del colesterolo ed al degrado ossidativo dei liquidi polmonari [12].
Particolarmente interessante è la presenza di idrocarburi quali ad esempio etano, pentano, esano, metilpentano e derivati benzenici, originati da un'alterazione dell'attività di perossidazione lipidica (stress ossidativo). Questo tipo di disfunzione metabolica è comune a numerose patologie: cancro ai polmoni [1,6,13,15], rigetto di organi trapiantati (fegato, cuore). La concentrazione di composti solforati nell'espirato è un'altro esempio in quanto questa cresce significativamente nei casi di disfunzioni epatiche e nel rigetto di organi trapiantati. E' ben documentata ad esempio la presenza di solfuro di carbonile nell'espirato di pazienti con crisi di rigetto post-trapianto del polmone [1,16].
Quindi l'analisi del respiro può essere annoverato come un potenziale strumento di diagnosi e monitoraggio di diversi aspetti del metabolismo legati a patologie come la sintesi del colesterolo, lo stress ossidativo e la chetoacidosi. Tale tecnica potrebbe inoltre avere interessanti prospettive applicative nel settore oncologico, cardiologico e nella diabetologia.
Attualmente però, nonostante le potenzialità, un test del genere è ancora una sfida. I maggiori ostacoli di natura tecnica sono il campionamento e l'analisi dei composti volatili, mentre il principale problema metodologico rimane la standardizzazione delle procedure. Standard generalmente accettati non esistono, per cui la riproducibilità e l'affidabilità dei metodi di campionamento e delle procedure analitiche di misura assumono un'importanza critica.
Durante la respirazione la composizione dell'espirato non è costante e nel processo di espirazione possono essere individuate due fasi. Durante la prima fase viene espulsa l'aria contenuta nel volume morto anatomico funzionale; questa parte di espirato, il cui volume è mediamente 150 ml su un totale di 500 ml, ha una composizione sostanzialmente uguale a quella dell'aria inspirata e non contiene sostanze organiche volatili di natura endogena. Durante la seconda fase viene espulsa parte dell'aria contenuta negli alveoli, caratterizzata, oltre che dalla massima concentrazione di CO2, anche dalla massima concentrazione di sostanze volatili presenti nel sangue. Il monitoraggio della concentrazione di CO2 nell'aria espirata permette di distinguere tra le due fasi.
In letteratura sono descritte metodologie che prevedono sia il campionamento del totale dell'aria espulsa durante la fase di espirazione, sia il campionamento del solo espirato alveolare. Molto spesso viene utilizzato il primo approccio per la sua maggiore semplicità, anche se è bene tenere presente che la diluizione dovuta all'aria del volume morto dipenderà comunque dal modo di respirare di ciascuna persona. La raccolta del solo espirato alveolare permette di ottenere campioni a maggiore concentrazione di analita oltre a portare significativi miglioramenti alla riproducibilità delle misure e ridurre eventuali contributi dell'aria ambiente respirata dal soggetto in esame. Infatti, una difficoltà che si incontra in questo tipo di misure è la distinzione delle sostanze endogene dai contaminanti esogeni. A livello degli alveoli, attraverso un processo di diffusione, l'ossigeno fluisce nel sangue ed il biossido di carbonio ed i metaboliti negli alveoli. Il volume delle vie aeree superiori, nelle quali non avvengono scambi, viene definito spazio morto anatomico (VD). Fatta l'ipotesi che nell'atto espiratorio non avvenga miscelamento tra aria alveolare e aria contenuta nel volume morto, si pone il problema di distinguere l'una dall'altra. Esistono due metodi usati comunemente: il metodo di Fowler ed il metodo di Bohr [17,18,19]. Nella figura seguente è riportato l'andamento tipico della concentrazione della CO2 in funzione del volume di aria espirata (VE) per un singolo atto espiratorio.

Fowler ha dimostrato che lo spazio morto anatomico può essere determinato dalla curva della concentrazione della CO2 rispetto al volume totale espirato come il punto in cui le zone ombreggiate "a" and "b" hanno la stessa area. Sono stati sviluppati degli algoritmi che facilitano e velocizzano la risoluzione di questo metodo [20]. Con il metodo di Bohr si misura lo spazio morto fisiologico che include lo spazio morto anatomico più quello spazio alveolare non coinvolto nello scambio gassoso. Bohr ha dimostrato la relazione esistente fra lo spazio morto fisiologico (VD,Bohr) ed il volume espirato in condizioni di normale espirazione (VT). Alcuni ricercatori hanno mostrato come la curva della CO2 rispetto al volume espirato sia uno strumento estremamente utile nella pratica clinica, in quanto permette una misura computazionale non invasiva ed accurata dello spazio morto di Bohr [21]. Alcuni fattori quali il volume dei polmoni, la corporatura, patologie polmonari e così via possono influire sulla misura dello spazio morto. In questo caso tecniche di monitoraggio quali la pletismografia induttiva respiratoria e la tomografia ad impedenza possono essere usate per valutare il volume dei polmoni in modo non invasivo [19].
Attualmente in letteratura ed in commercio si trovano dispositivi di campionamento che non tengono però conto di tutte le problematiche di natura tecnica e metodologica sopra menzionate [22-33]. L'orientamento della ricerca è rivolto verso lo sviluppo di dispositivi automatici in grado di separare lo spazio morto dall'aria alveolare [34] da interfacciare a strumenti in grado di effettuare un'analisi diretta dell'espirato.
I'aria espirata viene raccolta in un contenitore inerte ed analizzata [35-40]. Comunque, l'analisi del respiro presenta delle difficoltà tecniche legate alle concentrazioni estremamente ridotte della maggior parte dei componenti volatili da monitorare. Molte sostanze sono infatti presenti nel respiro in concentrazioni nell'intervallo nmol/l-pmol/l (ppbv-pptv), per cui è necessario uno stadio di preconcentrazione. E' possibile preconcentrare l'aria per mezzo di trappole assorbenti costituite da fibre rivestite quali quelle usate per la microestrazione in fase solida (SPME) [39-41]. La maggior parte delle metodologie analitiche descritte in letteratura prevedono il campionamento dell'espirato e la sua successiva analisi mediante tecniche analitiche di laboratorio tradizionali quali ad esempio la gas-cromatografia accoppiata alla spettrometria di massa [9,11,42]. Informazioni sulla composizione dell'espirato possono essere ottenute anche da misure dirette effettuate mediante strumentazioni basate su tecniche di spettrometria di massa o su sensori specifici per le molecole di interesse [11].
In considerazione dell'elevato numero di molecole presenti nell'espirato umano e della necessità di una loro identificazione la strumentazione analitica utilizzabile in questo tipo di misure non può essere che la gascromatografia combinata con la spettrometria di massa (GC-MS). L'utilizzo di sistemi strumentali che garantiscano un'elevata capacità separativa ed una notevole capacità di identificazione di composti incogniti oltre allo studio dei marker già noti darà la possibilità di individuare eventuali nuove sostanze chimiche utilizzabili come marker per le patologie esaminate.
Attualmente, le analisi di laboratorio effettuate su campioni di aria espirata sono quindi condotte tramite l'impiego di tecniche complesse, costose e non immediate ma utili per l'individuazione univoca di specifiche sostanze organiche. Ciò ovviamente giustifica la ridotta diffusione di tale tecnica nell'analisi medica. Le cose sarebbero di gran lunga differenti se fosse possibile effettuare l'analisi del respiro in ambito ambulatoriale in maniera rapida e a basso costo. Questo, associato alla non invasività della tecnica, potrebbe farne uno strumento davvero efficace per la diagnosi di un gran numero di patologie e per l'effettuazione di rapidi check-up.
Accanto alle tecniche analitiche tradizionali, negli ultimi anni si stanno infatti sviluppando tecniche strumentali innovative che vanno sotto il nome di sensori e nasi elettronici che possono essere implementate nella pratica medica [3,43-46].
I sensori di gas di tipo MOS (ossido metallico semiconduttore) rappresentano un valido approccio metodologico all'analisi del respiro per l'ampia gamma di gas rilevabili, per l'elevata sensibilità, la rapidità di risposta e la semplicità realizzativa dei dispositivi. Il principio su cui si basanoi sensori di gas resistivi tipo MOS sono fondati sulle variazioni di resistenza dell'elemento sensibile a seguito dell'adsorbimento su di esso di molecole dalla fase gas. Dal punto di vista pratico, ci si aspettano grandi vantaggi in termini di dimensioni, costi e semplicità di impiego rispetto alle tradizionali tecniche analitiche. Inoltre, l'uso di dispositivi MOS è compatibile con la microelettronica e la microlavorazione e ciò assicura miniturizzabilità e possibilità di integrazione in sistemi più complessi. Nell'ultimo ventennio l'introduzione dei sensori MOS ha aperto la nuova opportunità della progettazione di strumenti per la diagnostica che fondano il proprio funzionamento sullo sfruttamento delle informazioni di tipo chimico relative ai composti organici contenuti nel respiro.
Comunque, a dispetto di questi vantaggi, essi generalmente presentano scarse prestazioni in termini di selettività e stabilità a lungo termine. Infatti questi dispositivi non sono in grado di discriminare i componenti presenti nel campione di respiro analizzato, in quanto non risultano sensibili ad un numero limitato e prefissato di specifiche molecole, ma, piuttosto, a una grande quantità, talvolta imprecisata, di composti volatili. Comunque,poichè le proprietà dei sensori MOS (in termini di selettività e sensibilità) dipendono da molteplici parametri (natura, microstruttura, trattamento termico e drogaggio) dell'ossido metallico [47,48], le loro performance possono essere modulate in molti modi. In ogni caso, sebbene certe informazioni possano essere ottenute da un singolo sensore, l'assenza di selettività rimane uno dei maggiori inconvenienti dei sensori chimici. Questo aspetto è stato tenuto in considerazione come la base per la realizzazione di una strumentazione innovativa in grado di fornire informazioni globali circa la composizione dei campioni di respiro analizzati e superare il suddetto limite. Si cerca, in definitiva, di imitare quanto fa l'olfatto umano nella discriminazione degli odoranti [49]. La strumentazione in questione è costituita da una matrice (o array) di sensori non selettivi.In questi dispositivi il segnale in uscita dal sensore può essere ricondotto, previa accurata analisi dei dati, a una differenza tra i campioni. In tal genere di misure le basi chimiche da cui scaturiscono le riscontrate differenze e/o analogie tra campioni, sono spesso sconosciute e ciò comporta la necessità di affiancare ai sensori MOS le tradizionali metodiche di analisi al fine di ottenere una comprensione più profonda della questione.
La peculiarità dell'array di sensori è la cooperazione dei sensori e l'applicazione di un'analisi multivariabile per avere la possibilità di estrarre il maggior numero possibile di informazioni. Infatti, la risposta dei sensori dell'array non è univocamente correlabile alla concentrazione di un singolo composto (come nel caso classico dell'analisi chimica), quanto piuttosto alla combinazione di tutte le informazioni chimiche contenute in ciascun campione. Ciò significa che, sebbene ciascun sensore sia sensibile ad un'ampia gamma di composti volatili, tale sensibilità è differente rispetto a quelle di altri sensori dell'array. In tal modo è possibile individuare le differenze nella composizione dei campioni e classifi-care i differenti campioni sulla base di caratteristiche macroscopiche [50]. Di recente array di sensori sono stati presi in considerazione per applicazioni in campo medico, in particolare per la diagnosi di diverse patologie. Per esempio, l'analisi del respiro si è dimostrata potenzialmente utile per la diagnosi del diabete, utilizzando l'acetone come marker [43,44,51]. L'analisi dell'espirato è anche un test non invasivo per le crisi di rigetto nei soggetti sottoposti a trapianto di cuore, riducendo il numero di biopsie e quindi conseguentemente il disagio del paziente e il costo della cura. Il rigetto è accompagnato da uno stress ossidativo risultante da una sovraproduzione di specie ossigeno-reattive, in grado di causare la perossidazione dei lipidi e, quindi, generare alcani che sono presenti nel respiro come composti organici volatili (VOC). Di Natale et al. hanno dimostrato recentemente l'utilità dell'impiego di array di sensori nel monitoraggio del tumore al polmone attraverso l'analisi dei VOC nell'espirato. Essi trovarono che il respiro di soggetti affetti da cancro al polmone è differente rispetto a quello di soggetti sani [52], confermando la possibilità di classificare correttamente gruppi di persone mediante un array di sensori. I primi studi riguardo lo stress ossidativo avevano centrato l'attenzione quasi esclusivamente su due alcani indicatori, l'etano e il pentano. Comunque, il respiro contiene diversi altri alcani indicatori della perossidazione dei lipidi e dello stress ossidativo. Questi VOC possono rappresentare degli indicatori migliori della intensità del rigetto ma la separazione e l'individuazione con le tecniche tradizionali è un processo lungo. In questo caso l'uso di array di sensori potrebbe dare le corrette informazioni sulla malattia in un tempo molto più breve. <<<