RICERCA ITALIANA     

Genomica strutturale di metalloproteine e delle loro interazioni funzionali

Università degli Studi di Firenze

Abstract

Il presente progetto si prefigge la determinazione della struttura di un certo numero di metalloproteine coinvolte in importanti processi biochimici, e quando possibile, mira a proporre modelli strutturali per le interazioni proteina-proteina rilevanti per tali processi.
Le proteine coinvolte nel trasporto del rame saranno l'oggetto principale di questa ricerca per il loro coinvolgimento nell'omeostasi del rame e per la rilevanza che specifiche interazioni proteina-proteina hanno nel processo di trasferimento di questo ione metallico. Saranno studiati inoltre alcuni aspetti del trasporto del nichel. Le proteine di "signalling" dipendente dal calcio rappresenteranno anch'esse oggetto di studio perché il legame con il calcio induce cambiamenti conformazionali che permettono la realizzazione di interazioni proteina-proteina. Nel corso dei due anni di attività altri sistemi interessanti potrebbero attrarre la nostra attenzione. La caratterizzazione strutturale sarà principalmente portata avanti via NMR con il supporto, quando necessario, della spettroscopia a raggi-X (XAS) e della cristallografia a raggi-X. Ci si prefigge l'automazione e l'accelerazione del processo di determinazione strutturale in soluzione via NMR, così come lo sviluppo di software e hardware per lo studio di proteine o complessi macromolecolari ad elevato peso molecolare. Saranno sviluppati strumenti bioinformatici per la selezione delle metalloproteine da caratterizzare e la previsione della loro funzione. Saranno implementate le tecnologie per l'ottenimento delle proteine prescelte attraverso grazie alla loro espressione eterologa. Tutte queste attività contribuiranno a far avanzare la frontiera delle scienze biologiche affrontando la sfida rappresentata dallo studio dell'interazione fra proteine, nello sforzo di contribuire alla definizione dell'intero interattoma. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Ivano BERTINI Università degli Studi di FIRENZE

Obiettivo del Programma di Ricerca

I primi progetti di genomica strutturale sono iniziati nel 1998 con lo scopo di determinare la struttura tridimensionale di tutte le proteine codificate nei genomi sequenziati. Tuttavia, è stato presto chiaro come l'ottenimento della struttura di un elevato numero di proteine sia di per sé relativamente poco interessante, mentre invece sia di fondamentale importanza la scelta mirata dei sistemi da studiare. Il Centro di Risonanze Magnetiche (CERM) dell'Università di Firenze ha contribuito fin dall'inizio alla genomica strutturale concentrandosi sulle metalloproteine come target principali.
Le metalloproteine sono proteine capaci di legare uno o più ioni metallici, essenziali per la loro funzione biologica, per la regolazione della loro attività o per la stabilizzazione della struttura. Nel corso della ricerca precedentemente svolta al CERM (e parzialmente finanziata dai precedenti progetti COFIN) ci siamo resi conto che la definizione di una proteina come metalloproteina non è ovvia. Infatti, il fatto che la forma purificata di una proteina contenga uno ione metallico non implica necessariamente che tale ione sia legato in vivo. Allo stesso modo, il fatto che la forma purificata di una proteina non contenga ioni metallici non è condizione sufficiente per affermare che non si tratta di una metalloproteina. Per valutate se una proteina richiede un certo ione metallico per la sua funzione sono necessarie una serie di informazioni biologiche, che possono essere in larga parte ottenute attraverso analisi bioinformatiche. Una prima prioritizzazione dei target può quindi avvenire attraverso analisi bioinformatiche ortologhe a parologhe delle banche dati dei genomi. Tuttavia, è sempre più evidente che la funzione di una proteina emerge dalla sua interazione con altri partner proteici o leganti. Pertanto, un altro criterio importante per la selezione del target per successivi studi strutturali è quello di verificare le possibili interazioni proteina-proteina significative per un determinato processo biologico. Le interazioni proteina-proteina sono infatti alla base dei più importanti processi di regolazione nella cellula, governano percorsi metabolici intracellulari, la comunicazione intercellulare, il "signaling", e la regolazione dell'espressione genica. Il riconoscimento proteina-proteina è inoltre alla base del trasporto dei metalli, così come del "folding" assistito da ciaperonine o della degradazione delle proteine mediata dall'ubiquitina. In sostanza, la complessità di un organismo non deriva solo dal numero di proteine codificate dal suo genoma, ma anche dalle possibili interazioni fra esse. Quindi, in una visione più avanzata, la caratterizzazione completa dell'interattoma è un requisito fondamentale per capire appieno la funzione sulla base dell'informazione genomica.
Il presente progetto si prefigge la caratterizzazione di numerose nuove metalloproteine allo scopo di identificarne il ruolo in processi biochimici. La caratterizzazione strutturale sarà estesa ai complessi proteine-proteina facenti parte di specifiche reti di interazione che coinvolgono una o più metalloproteine.
Da un punto di vista metodologico, in linea con quelle che sono le competenze ed il ruolo del nostro centro di ricerca, l'NMR rappresenterà la tecnica preferenziale per la caratterizzazione strutturale e dinamica delle singole proteine. La cristallografia a raggi X sarà applicata nei casi di sistemi a più elevato peso molecolare e per l'analisi di complessi macromolecolari stabili. Le competenze e la strumentazione necessarie per la cristallografia ai raggi X sono a disposizione degli scienziati del CERM, quando necessario. Più spesso comunque i sistemi di interesse saranno rappresentati da addotti transienti che si formano attraverso deboli interazioni fra partner proteici. In questo caso, l'NMR in soluzione è la tecnica principe grazie alla sua capacità di rilevare cambiamenti anche sottili nelle zone di interazione fra proteine, quali variazioni di chemical shift, cambiamenti delle proprietà dinamiche, ecc. Nel caso di interazioni macromolecolari mediate da ioni metallici, saranno sviluppati approcci ad hoc per sfruttare l'informazione strutturale ottenibile con tecniche spettroscopiche basate sullo ione metallico.
Questo progetto di ricerca consisterà nella selezione delle metalloproteine, nella loro espressione e nella determinazione della loro struttura tridimensionale. Pertanto sarà basato su uno sforzo integrato di diverse competenze quali la bioinformatica, la biologia molecolare e la chimica di proteine, la spettroscopia NMR e la chimica computazionale. Inoltre, la tecnica NMR sarà applicata alla caratterizzazione di interazioni deboli in soluzione fra alcune coppie selezionate di macromolecole.
L'uso di sistemi di espressione di proteine high throughput sarà fondamentale per l'ottenimento di un elevato numero di campioni proteici, con alta resa e con gli schemi di arricchimento isotopico necessari per i diversi esperimenti NMR. Il processo di produzione di proteine comprenderà il clonaggio, la progettazione di costrutti per l'over-espressione, l'espressione con diversi schemi di arricchimento isotopico, e la successiva purificazione. Ciascuno di questi passaggi necessita di avanzamenti tecnologici.
Dal punto di vista strutturale, gli avanzamenti teorici e sperimentali saranno accoppiati alla strumentazione NMR di avanguardia disponibile al CERM (alti campi magnetici, criosonde). Lo sviluppo di nuove metodologie NMR rappresenterà uno dei punti chiave del progetto, e ci aspettiamo di poter portare un contributo significativo in questo senso.
Ci prefiggiamo inoltre di arrivare a definire validi strumenti bioinformatici per l'identificazione non solo di nuove metalloproteine ma anche dei loro potenziali partner. Saranno inoltre necessari approcci computazionali innovativi per la determinazione high throughput delle strutture in soluzione delle proteine isolate, per l'analisi dei cambiamenti nei parametri NMR in seguito all'interazione con partner, e per un opportuno modelling dei complessi macromolecolari.
Tra i sistemi da caratterizzare nel corso del progetto ci saranno: a) le proteine coinvolte nel trasporto del rame e le interazioni proteina-proteina rilevanti per questo processo; b) i sensori calcio-dipendenti e i loro partner; c) le proteine coinvolte nell'assemblaggio dei cofattori a nichel ed i loro complessi funzionali. Ci proponiamo di caratterizzare non solo sistemi proteici che siano già noti dare luogo a interazioni reciproche, ma anche di identificare nuovi potenziali partner.
Nonostante il core del progetto sia rappresentato dai sistemi elencati sopra, è possibile che nel corso della ricerca, in presenza di sviluppi interessanti, l'attenzione si rivolga anche agli zinco enzimi metalloproteinasi (MMP) e alle loro interazioni con substrati costituenti il tessuto connettivo e con altre proteine attivate dalle MMP. Altri candidati ipotizzabili a questo stadio sono il citocromo c umano e i suoi partner nella respirazione aerobica e nel processo di apoptosi. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il sequenziamento dei genomi ha portato all'ottenimento di liste quasi complete delle macromolecole presenti in un numero elevato di organismi. Come conseguenza di questa nuova informazione, a livello mondiale sono nate iniziative volte alla determinazione di un numero elevato di strutture di proteine con un approccio high throughput, e questo nuovo campo di ricerca è stato denominato "genomica strutturale" [1]. Il vantaggio di combinare l'informazione strutturale con quella genomica deriva dall'idea di base che la funzione dipende dalla forma. I primi progetti di genomica strutturale sono partiti negli USA nel '98, con il finanziamento dell'NIH e del DOE. Sempre nel '98 il Giappone ha iniziato un progetto di genomica strutturale al Riken Center e, infine, nel 2002 anche l'Europa ha avuto un suo progetto chiamato SPINE (Structural Proteomics in Europe). La definizione "proteomica strutturale" fu scelta per porre enfasi sul fatto che col tempo gli scienziati avevano rivolto un'attenzione crescente alla scelta delle proteine di cui determinare la struttura, operando una selezione basata sul possibile ruolo del target proteico. Noi, come CERM, siamo coinvolti dall'inizio nella genomica strutturale (vd. www.oecd.org/dataoecd/24/31/2105118.pdf) con il compito specifico di determinare la struttura di metalloproteine. Questo perché siamo un laboratorio accreditato, che opera nel settore degli ioni metallici in biologia.
Molti dei progetti di genomica strutturale si concentrano sullo sviluppo di nuove metodologie per la determinazione high throughput, con l'obiettivo primario di velocizzare il processo di risoluzione della struttura attraverso l'ottimizzazione di ciascun passaggio. I passaggi coinvolgono la selezione del target, la produzione della proteina, la sua purificazione, l'eventuale cristallizzazione, e l'analisi strutturale [2-4]. Solitamente questi progetti si presentano come un approccio integrato con competenze che spaziano dalla bioinformatica alla biologia strutturale (X-ray o NMR) attraverso la biologia molecolare e la chimica di proteine. Altri progetti invece sono focalizzati su alcuni target specifici, come per esempio fattori di virulenza, o proteine di genomi batterici completamente sequenziati come quello dell' H. influenzae, ecc. Una lista estesa di questi progetti è disponibile nel sito www.rcsb.org/pdb/strucgen.html.
L'attuale strategia dei programmi di genomica (o proteomica) strutturale richiede che si operi una selezione dei sistemi concentrandosi su quelli che sembrano appartenere ad uno stesso processo biologico, così da inquadrarli in un contesto funzionale comune. La capacità di una proteina di legare un certo ione metallico dà indicazioni sul suo possibile ruolo inquadrandola automaticamente all'interno di uno o più processi di trasporto di quel determinato ione.
L'originalità del CERM deriva essenzialmente dalla sua radicata esperienza e dalla strumentazione di assoluta eccellenza in biologia strutturale via NMR, e non ultimo, dalla sua competenza unica nell'identificare e caratterizzare strutturalmente metalloproteine. La presenza di uno o più ioni metallici legati alla matrice proteica richiede infatti un approccio ad hoc per la determinazione della struttura in soluzione. L'NMR è una tecnica potente, e praticamente l'unica, per l'ottenimento di strutture di proteine in soluzione. Ma quando si ha a che fare con una metalloproteina, lo ione metallico rappresenta un punto di discontinuità rispetto alla rete di vincoli strutturali e per la caratterizzazione del suo intorno sono necessari metodi specifici. La spettroscopia di assorbimento X-ray (XAS) è adatta per fare da complemento alla determinazione strutturale in soluzione perchè fornisce informazioni sullo ione metallico. La sinergia di XAS e NMR è stata verificata ed utilizzata ampiamente per la determinazione strutturale delle proteine di trasporto del rame batteriche (questo aspetto ha costituito parte del nostro progetto COFIN2003)[5-6].
Quando lo ione metallico è paramagnetico la zona "cieca" per l'NMR può estendersi al di là della prima sfera di coordinazione come conseguenza dell'aumentata velocità di rilassamento dovuta alla presenza di spin spaiati. La capacità di risolvere strutture in soluzione di metalloproteine paramagnetiche risale al 1994, quando alcuni degli scienziati che poi fondarono il CERM pubblicarono la struttura NMR in soluzione della proteina paramagnetica HiPIP (high potential iron-sulfur protein) I da E. halophila, che fu la prima struttura in soluzione di una proteina paramagnetica [7]. Da allora il gruppo si è dedicato allo sviluppo di vincoli strutturali NMR basati sul paramagnetismo [8-10]. In virtù della presenza di uno o più centri paramagnetici è possibile ottenere nuovi vincoli di distanza o angolari definendo così la posizione dei metalli all'interno della matrice proteica e ottenendo strutture ad alta risoluzione anche nell'intorno del centro paramagnetico. Nell'ultimo decennio gli scienziati del CERM hanno esplorato l'uso di effetti sempre più sofisticati per la determinazione strutturale. In particolare, hanno dimostrato che il contributo paramagnetico a R1 e R2 può essere utilizzato per ottenere vincoli a breve raggio che dipendono da r-6, dove r è la distanza tra il centro metallico e il nucleo osservato [11-13]. Una dipendenza geometrica più complessa dalla posizione relativa di un certo nucleo della proteina e il centro paramagnetico è invece contenuta nell'espressione dello shift di pseudocontatto [14-18]. Questo tipo di shift è un vincolo strutturale molto efficace e ad ampio raggio (r-3), il cui uso è ben documentato in letteratura per eme proteine ad alto e basso spin e per calcio-proteine sostituite con lantanidi. Una relazione matematica simile vale anche per gli accoppiamenti dipolari residui (rdc) misurabili ad alto campo magnetico in assenza di agenti orientanti esterni in molecole che possiedono anisotropia di suscettività magnetica [19-22]. Gli rdc possono anche fornire indicazioni sulla dinamica del sistema [23-25]. Infine, si è dimostrato possibile l'utilizzo di vincoli che derivano da fenomeni di cross-correlazione fra interazioni internucleari dipolo-dipolo e il valore mediato sul tempo del momento magnetico dell'elettrone (spin di Curie) [26,27]. Una breve descrizione matematica di tutti questi osservabili NMR e una lista degli algoritmi di calcolo che sono stati sviluppati al CERM per trasformare questi effetti in vincoli strutturali è disponibile all'indirizzo web www.cerm.unifi.it/METHOD/method.html.
Molti sforzi sono anche concentrati nello sviluppo di hardware che consenta di estendere il limite di osservabilità di segnali intorno al centro paramagnetico. Recentemente, sono stati sviluppati anche nuovi esperimenti basati sulla detezione diretta del nucleo 13C, particolarmente efficaci per la caratterizzazione di sistemi con valori di R2 elevati [17,28-31]. Il CERM è impegnato nello sviluppo di una serie di sequenze che dovrebbero portare all'assegnamento degli spettri NMR indipendente dal protone per macromolecole diamagnetiche e paramagnetiche e all'ottenimento di vincoli strutturali 13C-13C [32-35].
L'obiettivo finale della genomica strutturale è quello di ottenere informazioni funzionali. Tuttavia, la semplice lista di prodotti del genoma dice poco sulla funzione dei sistemi biologici perché le unità funzionali sono in genere costituite da proteine interagenti. Quindi, ci possono essere migliaia di complessi macromolecolari biologicamente rilevanti la cui struttura deve ancora essere caratterizzata. Siccome le metalloproteine costituiscono circa il 30% delle proteine totali di un organismo, molti di questi complessi conterranno almeno una metalloproteina [36]. C'è quindi un numero incredibile di complessi per cui dobbiamo definire i dettagli dell'interfaccia proteina-proteina. Realisticamente, una conoscenza di questi dettagli non può arrivare solo dalle strutture ad alta risoluzione dei singoli componenti, perchè la struttura di per sé non contiene l'informazione su dove avviene l'interazione con il partner ed anche perché in alcuni casi la struttura della proteina cambia rispetto al sistema isolato per ottimizzare l'interazione. Esistono anche casi limite in cui uno dei partner è non strutturato in assenza dell'altro.
La cristallografia a raggi X è stata la tecnica più prolifica per l'analisi strutturale di proteine e complessi proteici e rappresenta il meglio del meglio in termini di accuratezza e precisione. Tuttavia, il numero di complessi tra macromolecole risolti via cristallografia a raggi X rimane relativamente piccolo rispetto al numero di strutture delle singole proteine. Questa discrepanza è dovuta principalmente alle difficoltà di cristallizzazione. Infatti non tutti i complessi interessanti sono capaci di dare luogo a cristalli, o magari non cristallizzano in una forma biologicamente rilevante. Questo succede in particolare quando le interazioni fra le proteine sono deboli.
L'NMR non è in grado di competere con i risultati spettacolari dei raggi X quali la determinazione strutturale di sistemi complessi come il ribosoma, il proteasoma, o l'apparato di trascrizione. Tuttavia, molte delle interazioni proteina-proteina sono interazioni deboli per necessità di reversibilità dei processi. L'NMR, benché non limitato allo studio di tali interazioni deboli, diventa la tecnica vincente proprio in questi casi che sono invece difficilmente affrontabili con i raggi X [37].
Lo studio delle interazioni proteina-proteina in soluzione via NMR è basato su una serie di metodi ben definiti. L'effetto Overhauser nucleare intermolecolare è un metodo ad alta risoluzione ma non troppo utile in quanto è applicabile esclusivamente per interazioni fra molecole relativamente forti (Kd < = 10-100 mM). In tutti gli altri casi, il mapping del chemical shift delle aree di interazione rimane il metodo migliore, in quanto il chemical shift è sensibile a variazioni minime dell'intorno del nucleo e può essere utilizzato per identificare interazioni anche di modesta entità (>10 mM)[37-39]. Esperimenti di cross-saturazione, perturbazioni della dinamica del sistema, accoppiamenti dipolari residui sono usati attualmente per la caratterizzazione di interazioni intermolecolari. Vantaggi e limiti di ciascuno di questi metodi sono discussi estesamente in letteratura [37,40,41].
La maggior parte dei metodi "diamagnetici" descritti sopra è correntemente applicata a complessi fino ad una massa totale di 60 kDa, utilizzando le recenti strategie per proteine ad alto peso molecolare che prevedono deuterazione estensiva del campione proteico e esperimenti TROSY e CRINEPT. I primi esempi di studio di sistemi fino a 1000 KDa cominciano ad apparire adesso in letteratura [42-44].
In letteratura esistono anche esempi sull'utilizzo di shift di pseudocontatto tra citocromi contenenti ferro(III) a basso spin e molecole partner, ma l'approccio richiede ulteriori sviluppi [45]. Il mapping dell'interazione usando vincoli NMR paramagnetici sarà oggetto di questo progetto nel caso di alcuni complessi macromolecolari e si avvantaggerà dell'esperienza sviluppata sui sistemi isolati. Gli shift di pseudocontatto sembrano particolarmente promettenti in quanto sono operativi a lungo raggio (dipendenza da r-3) e quindi possono essere misurati anche relativamente lontano dal centro paramagnetico.
Potenzialmente, le nuove sequenze di impulsi basate sulla detezione diretta del 13C, e ampiamente sviluppate nel nostro laboratorio, potrebbero rappresentare un nuovo approccio per lo studio di sistemi ad alto peso molecolare in quanto l'osservazione degli eteronuclei con basso gamma non soffre degli svantaggi legati al veloce rilassamento trasversale tipico del protone, che rende inutilizzabili gli esperimenti NMR standard. L'applicazione dell'approccio eteronucleare alla caratterizzazione strutturale di complessi macromolecolari sarà un'estensione ovvia di queste nuove metodologie.
Con la sola eccezione di quei casi in cui sono osservati NOE tra due macromolecole, gli altri approcci sperimentali sono metodi a bassa risoluzione che danno informazioni su dove si trova la zona di interazione tra le due proteine, ma non consentono di determinare come i partner interagiscono a livello di interazioni atomo-atomo [46]. Al fine di ottenere una struttura del complesso è quindi necessario combinare questi metodi sperimentali con opportuni metodi computazionali. Negli ultimi anni il nostro gruppo ha studiato alcuni sistemi modello e testato gli algoritmi disponibili, che sostanzialmente consistono in programmi di soft-docking al calcolatore validati sperimentalmente [47-48]. In questi programmi l'informazione NMR è usata come filtro per selezionare un numero limitato di conformazioni consistenti con il dato sperimentale da un più ampio insieme di strutture, possibili sulla base di semplici considerazioni energetiche. Questo progetto sarà un'ulteriore opportunità per migliorare i protocolli esistenti e per renderli più efficienti con l'introduzione di nuovi osservabili NMR come filtri.
La selezione del target per via bioinformatica e l'espressione e purificazione high throughput di proteine sono passaggi essenziali di qualsiasi progetto di genomica strutturale. Strategie per clonaggio ad alta efficienza, ottimizzazione di sistemi di espressione e sviluppo di espressione e purificazione automatizzata sono stati perseguiti da numerosi gruppi di ricerca portando a risultati medium-to-high throughput [49]. Per l'espressione di proteine batteriche i metodi sono ben sviluppati e standardizzati. Invece per l'espressione di proteine da eucarioti, ed in particolare di quelle umane, c'è bisogno di sforzi specifici. Sono disponibili al momento alcune strategie. Uno degli aspetti più importanti riguarda la scelta dell'organismo ospite per l'espressione. Oltre al comune E. coli, si lavora sull'utilizzo e ottimizzazione del metodo in altri tipi di cellule quali P. pastoris e Anabeana, così come su cellule da insetto transefttate con Baculovirus. Per aumentare le possibilità di successo sono state sviluppate strategie quali l'uso di GatewayTM.
Nel caso specifico delle metalloproteine, la formazione del cofattore metallico può necessitare di modifiche post-trasduzionali della catena polipeptidica e può pertanto richiedere un apparato dedicato per la biogenesi. Quest'aspetto deve essere considerato quando si esprimono proteine contenenti cofattori metallici speciali. D'altro canto, la caratterizzazione dell'interattoma che riguarda proteine ed enzimi coinvolti nella biogenesi di un cofattore metallico può essere di per sé un aspetto fondamentale dello studio funzionale delle metalloproteine.
Infine, ad oggi mancano strumenti adeguati per l'identificazione di metalloproteine nei database di sequenze geniche. Alcuni ricercatori del CERM sono dedicati allo sviluppo di un approccio basato sulle sequenze consenso per il legame di ioni metallici disponibili nel PDB combinato all'utilizzo degli strumenti di analisi di sequenza primaria allo scopo di identificare nuove potenziali metalloproteine nei database di geni [50]. Al momento questo tipo di approccio è stato applicato con successo alle proteine che legano il rame [51-52]. L'identificazione di un repertorio completo di metalloproteine capaci di legare un determinato metallo nel genoma di ciascun organismo (batterio o eucariota) potrebbe poi essere sfruttato per prevedere potenziali interazioni funzionali che riguardano quel determinato ione metallico. Dal punto di vista della ricerca di base, un simile repertorio permetterebbe la razionalizzazione delle relazioni tra l'intorno di coordinazione e le proprietà chimiche che definiscono l'attività catalitica, in classi di metalloenzimi. <<<