RICERCA ITALIANA     

Nanostrutture biominerali su interfacce di carbonati e solfuri

Università degli Studi di Torino

Abstract

Il programma è articolato sul lavoro sperimentale di due Unità di ricerca ( Università di Torino – Università di Cagliari) e sulla parte interpretativa dei risultati ottenuti che verrà gestita in comune con la terza Unità (Università di Milano).

Lo schema generale del programma prevede, per la parte sperimentale:

1a) - Nucleazione e crescita di cristalli ( in soluzione acquosa e in gel) di CaCO3 - calcite in presenza di impurezze specifiche inorganiche (Li+, Na+, Mg2+), di acidi carbossilici e di oligosaccaridi ritenuti profondi modificatori della sua morfologia, allo scopo di selezionare morfologie dominate alternativamente da una delle quattro forme {10.4}, {01.2},{00.1} e {11.0} che sono le più frequentemente riscontrate nelle calciti biogeniche in natura.
1b) - Esame delle loro strutture superficiali prima e dopo l' adsorbimento su di esse di ioni inorganici modificatori d'abito e di molecole di interesse biologico (acido aspartico, glutammico, serina e treonina ) con lo scopo di determinare la formazione di nano-strutture e delle loro eventuali auto-organizzazioni conseguenti all'adsorbimento. La presenza di gradini sulle facce cristalline, siano essi dovuti ad isole di crescita 2D o a spirali, la loro rugosità, la struttura kinked o stepped delle facce saranno messe in evidenza alla nanoscala mediante l'AFM, così come la presenza di strati epitassiali dovuti alla formazione di strutture 2D causate da impurezze specifiche durante la crescita del cristallo.

2a) - Precipitazione biologicamente indotta dell'idrozincite e co-precipitazione di altri carbonati idrati. Studio dell'ambiente coordinativo di metalli pesanti( Pb, Cd e Cu), coprecipitati con l'idrozincite, tramite assorbimento di raggi X (XAS), diffrazione anomala e risonanza elettronica paramagnetica (EPR solo per il Cu). L'analisi riguarderà diversi tipi di carbonati (ZnCO3 -Smithsonite, Zn5(CO3)2(OH)6 - Hydrozincite), sia sintetici che naturali (Rio Naracauli, Iglesiente, Sardegna). I campioni sintetici saranno preparati in funzione di diverse concentrazioni di metalli, sia con precipitazioni massive a caldo che con cinetica lenta.
2b) - Dissoluzione di PbS - Galena [ forma (001) ] ed FeAsS - Arsenopirite in presenza di ioni carbonato ed anioni organici presenti nei suoli. Essa avverrà in soluzioni sature in ossigeno in presenza o meno di molecole organiche e sarà studiata in un reattore a flusso continuo. In funzione dei risultati ottenuti, sarà investigata anche la cinetica in presenza di molecole organiche complesse quali quelle utilizzate per l'adsorbimento sulla calcite. La dissoluzione di galena ed arsenopirite sarà studiata mediante l'applicazione di tecniche analitiche innovative ed avanzate tra le quali il micro Raman in situ, la microscopia a forza atomica in cella a flusso e la spettroscopia di fotoelettroni a raggi X.

Per l' interpretazione dei risultati sperimentali si prevedono le seguenti tappe:

3a) - Determinazione del carattere strutturale delle facce dei cristalli in studio e dei loro profili superficiali più probabili assunti nella fase madre.
3b) - Calcolo delle energie di adsorbimento delle specie adsorbite e giustificazione dei cambiamenti morfologici osservati.
3c) - Modellizzazione delle cinetiche di reazione interfacciali e calcolo delle loro energie di attivazione con lo scopo parallelo del miglioramento delle teorie esistenti per la nucleazione e crescita in sistemi 3D chiusi e per la dissoluzione su superfici cristalline piane.
3d)- Simulazione e visualizzazione dei processi di auto-organizzazione molecolare all' interfaccia biominerale.

La validazione dei risultati e il confronto fra l'interpretazione per via analitica, le simulazioni e i dati sperimentali si svolgeranno in continua e stretta collaborazione tra tutte le Unità. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Dino AQUILANO Università degli Studi di TORINO

Obiettivo del Programma di Ricerca

L'obiettivo di questo progetto di ricerca consiste nell' individuare le nanostrutture che si formano all'interfaccia minerale/fase madre in presenza di molecole di interesse biologico , ricercare quelle che portano all'auto-organizzazione delle fasi adsorbite e comprenderne i meccanismi di formazione. L'intento è quello di fornire un contributo alla conoscenza dei complessi fenomeni di biomineralizzazione.
Essendo in sé un obiettivo piuttosto complesso la sua comprensione può essere facilitata da un'articolazione su più livelli.

Il primo livello riguarda la conoscenza delle superfici cristalline su cui si presume possa verificarsi l'adsorbimento organizzato delle biomolecole. L'acquisizione di quest'obiettivo preliminare non è banale, ma ha invece il carattere dell'essenzialità. Infatti le superfici in questione vanno conosciute nel loro stato reale prima che su di esse vengano adsorbite specie estranee al cristallo, sia mediante l'osservazione sia mediante una loro caratterizzazione teorica.
La mancanza di uno di questi due stadi costituisce un serio handicap per la prosecuzione della ricerca. Infatti, se manca l'aspetto osservazionale, non si conosce la configurazione della superficie a livello di nanoscala prima dell'adsorbimento e quindi il confronto con la stessa superficie dopo l'adsorbimento non ha senso. Se manca invece una conoscenza preliminare teorica delle caratteristiche intrinseche della superficie ( suo carattere, ristrutturazione e rilassamento, profilo più probabile, potenziale superficiale, tensione superficiale senza adsorbimento), risulta difficile comprendere come si possa passare ad una fase di interpretazione dei risultati sperimentali. Questi ultimi, nella migliore delle ipotesi, risulterebbero privi del loro aspetto più fruttuoso, e cioè il meccanismo di formazione delle fasi adsorbite, il loro peso sulla cinetica di crescita ( o di dissoluzione) e le conseguenti modificazioni d'abito dei cristalli supporto.
L'accoppiamento di entrambe queste condizioni raramente si ritrova nella letteratura della biomineralizzazione, nemmeno per specie cristalline importanti come i carbonati e i solfuri. Esso è più facilmente riscontrabile in ricerche su superfici cristalline che interessano la chimica fisica dello stato solido e dei materiali in generale. Noi riteniamo ragionevolmente possibile raggiungere quest'obiettivo mediante l'integrazione dell'esperienza delle tre Unità partecipanti al progetto che vede accomunati ricercatori con formazione originarie in Scienze Geologiche, in Chimica Fisica, in Fisica e in Matematica.

Il secondo livello riguarda l'acquisizione delle cinetiche interfacciali in presenza delle specie adsorbite ( sia inorganiche che organiche). Questo è l'obiettivo centrale del lavoro di ricerca: il suo raggiungimento si tradurrebbe in un passo significativo nella conoscenza dei fenomeni di biomineralizzazione e dell'alterazione minerale in presenza di composti organici. Infatti nella ricerca proposta i metodi sperimentali e le tecniche strumentali più avanzate che noi possiamo usare saranno messe a disposizione non soltanto per lo studio cinetico delle specie cristalline nel loro aspetto "as a whole", di per sé sicuramente importante, ma serviranno anche a studiare i meccanismi di reazione faccia per faccia.
Il vantaggio di questo approccio, per il quale le nostre due Unità sperimentali ( specie quella di Torino) hanno una consolidata esperienza, è di potersi liberare dal concetto di "valore medio" caratteristico del trattamento "as a whole". Infatti l'approccio "as a whole" in cui il cristallo è trattato come una sfera, può andare bene al massimo per rappresentare i fenomeni di nucleazione; esso maschera invece inevitabilmente i meccanismi di crescita ( o dissoluzione) delle singole forme cristalline, in quanto ne rappresenta al più una media ponderata di cui non è dato conoscere il criterio.
L'utilizzo di tecniche d'indagine operanti a livello di nanoscala, di cui l'AFM ex-situ ed in-situ rappresenta al momento la punta più avanzata, ci consentirà di dare una solida e raffinata base sperimentale ai nostri dati sia sulla cinetica delle differenti superfici sia sulla loro topologia in tempo reale, così come abbiamo già mostrato di poter fare in passato.
Infine, nell'ambito di questo obiettivo, potremo prendere in considerazione non solo le facce "celebri", come le facce del romboedro di sfaldatura della calcite o la (001) della galena, su cui si cimenta da tempo l'ampia letteratura esistente nell'ambito della biomineralizzazione . Ci proponiamo infatti come obiettivo di studiare anche la cinetica delle facce "scomode" la cui struttura superficiale è complessa e non univoca. Non casualmente tali facce sono abitualmente ricorrenti nei biominerali che intendiamo studiare e, nel caso della calcite, sono tra le più frequenti in ambiente geologico.

L'ultimo livello in cui si articola il nostro obiettivo riguarda i metodi di interpretazione dei risultati ed è quello che, nell'ambito del Progetto, riteniamo il più innovativo.
Esiste sicuramente al giorno d'oggi un consolidato bagaglio di teorie interpretative nel campo della "crystal growth" e della "surface science". Lo provano i risultati raggiunti nella Scienza dei materiali, specialmente nelle ricerche sulla cristallizzazione da fase vapore o da fuso. La situazione si presenta meno soddisfacente per la crescita da soluzione, in parte perché il sistema è generalmente più complesso e in parte perché, in campi quali la biomineralizzazione entrano in gioco non solo aspetti deterministici ma anche aspetti ( quali l'auto-organizzazione molecolare) in cui acquistano un ruolo fondamentale gli aspetti probabilistici.
L'ingresso di un'Unità di Matematici in questo progetto è essenziale per il conseguimento di questo obiettivo avanzato. Da un lato essi possono portare un contributo al miglioramento per la modellizzazione o per l'adattamento delle teorie correnti per l'interpretazione di fenomeni che seguono un percorso tradizionale ( cambiamento di morfologia dovuto all'azione di impurezze in fase di nucleazione, crescita, adsorbimento ). Dall'altro, qualora si tratti di comprendere l'auto-organizzazione di fasi estranee alle superfici del minerale di interesse, si devono inventare nuovi modelli esplicativi in funzione del problema probabilistico posto. La ben documentata esperienza del gruppo di Milano va esattamente in questa direzione. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il termine " biominerale " non è riducibile ai soli minerali prodotti dagli organismi viventi, ma si estende a tutte le strutture di materiali compositi in cui coesistono le due componenti: inorganica ed organica. Le fasi biominerali si formano in natura in condizioni controllate, e quindi spesso hanno proprietà come forma, taglia, cristallinità, contenuto in isotopi ed elementi in traccia molto diverse da quelle delle loro controparti cristallizzate in ambiente inorganico.
Noi ci occuperemo, in questa proposta, dell' " interfaccia biominerale" e cioè delle nanostrutture che si formano nella zona di transizione tra superfici cristalline di minerali (calcite, carbonati idrati, solfuri metallici) e il loro ambiente di crescita o di dissoluzione, quando in esso sono presenti molecole organiche di interesse biologico.
L'ampia letteratura sulla biomineralizzazione compie ormai i suoi 20 anni e ad essa si può fare riferimento in testi di rassegna fondamentali [1,20]. I requisiti fondamentali per la strutturazione di un'interfaccia biominerale risiedono nella capacità di riconoscimento che la superficie inorganica cristallina esercita nei confronti delle molecole organiche da adsorbire su di essa [1]. Se ciò si realizza, allora le proprietà termodinamiche dell'interfaccia ne sono condizionate al punto che la probabilità di nucleare, ad esempio, un polimorfo di CaCO3 piuttosto di un altro ne viene fortemente influenzata [2].
La conoscenza della superficie dei cristalli diventa allora strategica. All'inizio degli anni "90 incomincia a fiorire un interesse generalizzato per le acquisizioni che la crescita cristallina ha prodotto, in trent'anni, sulla modificazioni che le superfici minerali subiscono quando crescono da soluzione in presenza di impurezze, sia inorganiche che organiche [3]. Compaiono, nel frattempo, le prime osservazioni ottenute in microscopia a forza atomica sulle superfici dei cristalli, tanto ex-situ che in crescita da soluzione.


Nano- strutture e auto-organizzazione sulla calcite

Il romboedro di sfaldatura {10.4} della calcite, che è la forma cristallina più ricorrente negli studi sulla biomineralizzazione, diventa oggetto di studi dettagliati: in pochi anni si passa dal dato cinetico globale del cristallo alla misura di nanostrutture superficiali ( gradini di spirali o germi 2D) che si sviluppano sulla faccia determinandone la velocità di crescita e cambiano forma a seconda delle impurezze adsorbite sulla faccia stessa [4].
La necessità di interpretare i dati sperimentali stimola l'esigenza di conoscere le ragioni per cui una forma {hkl} è più stabile di un'altra: il calcolo delle tensioni superficiali per le forme più importanti della calcite (in presenza del solvente, di ioni e molecole adsorbite ) acquista grande interesse, insieme alla simulazione delle energie dei siti di superficie [5].
E' nella biomineralizzazione dei carbonati che si fanno le ricerche più avanzate: la nucleazione orientata della calcite viene condizionata dalla auto-organizzazione di monostrati di molecole organiche (SAMs - self assembled monolayers) a loro volta pre-adsorbite su altri supporti cristallini [6-8]. Aumentano le segnalazioni di nanostrutture interfacciali in posizione epitattica [16] e migliora la conoscenza dei meccanismi di crescita a livello molecolare [9,13,17] della {10.4} della calcite. La chiralità delle molecole adsorbite esalta le differenze nella velocità di avanzamento dei gradini complementari delle spirali di crescita presenti sul romboedro [18] e viene spiegato l'effetto inibitore sulla crescita della calcite dovuto ad adsorbati organici, mediante modellizzazione dell' interazione tra l' adsorbato e il substrato cristallino inorganico [19].
Nonostante la quantità e la qualità dei risultati raggiunti nel settore dei carbonati più stabili, esistono alcune questioni basilari da risolvere :
a) Lo studio delle interfacce calcite / adsorbato organico solo in rari casi va al di là della {10.4}. Questa forma è sicuramente la più nota e la più facile da studiare grazie all'unicità del profilo che essa presenta rispetto alla fase madre. Ma essa non è la più importante morfologicamente in ambito naturale, sia nei cristalli di origine inorganica che in quelli biogenici: ricorrono più frequentemente il prisma {10.0}, lo scalenoedro {21.4}, il romboedro acuto {01.2}, quello piatto {01.8} e il pinacoide {00.1}. Sarebbe quindi utile studiare l'influenza di specie biomineralizzanti sulla cinetica di crescita di queste forme.
b) Tra le superfici delle forme ora citate solo la {01.2} non è da ristrutturare, pur presentando due profili non equiprobabili. Le altre forme {10.0}, {21.4} e {01.8} hanno carattere stepped o kinked, come la {00.1} e devono essere ristrutturate prima di considerare le interazioni con lo strato adsorbito. Il solo rilassamento, finora considerato in letteratura, non è realistico, se non ambiguo.
c) Lo stato di perfezione delle superfici su cui vengono adsorbite le specie molecolari non viene generalmente esaminato, prima dell' adsorbimento. Vengono usate abitualmente superfici di sfaldatura, mentre per comprendere i cambiamenti di morfologia le superfici devono essere "as grown", quindi con i difetti e le nanostrutture dovuti alla crescita.
L'esperienza dell' Unità di Torino nella crescita cristallina in generale e nella specificità dei polimorfi del carbonato di calcio costituisce una solida base per una ricerca che dia una risposta organica a questi problemi. A questo scopo sono già stati affrontati:
- le morfologie teoriche di equilibrio e di crescita dei polimorfi più stabili ( aragonite e calcite) del carbonato di calcio [10],
- la perfezione di superfici di spessore nanometrico della calcite nucleata su supporto in presenza di bolle gassose e di impurezze specifiche [11],
- la competizione tra cinetiche di forme cristalline della calcite con differenti caratteri, sia in crescita da gel che da soluzione acquosa e l' individuazione di nanostrutture di crescita all'interfaccia cristallo / soluzione [12,14,15].


Biomineralizzazione e cinetica di superficie in idro-carbonati e solfuri metallici.

Comprendere i meccanismi che controllano l'interazione tra minerali e biosfera è centrale per predire sia la stabilità dei minerali che la reattività delle loro superfici. Ciò è molto utile se si devono affrontare problemi ambientali quali la mobilizzazione o l'intrappolamento di metalli pesanti. Infatti precipitazione e dissoluzione di minerali quali carbonati e solfuri regolano il rilascio ed il trasporto di inquinanti antropogenici, specialmente metalli pesanti, sia a scala locale che globale.
Idrocerussite ed idrozincite sono esempi di biomineralizzazioni indotte [20]. A valle di una miniera dismessa (Iglesiente, Sardegna), è stata rinvenuta dell'idrozincite in un corso d'acqua a pH circa neutro, in associazione con batteri fotosintetici (Scytonema) and microalghe (Chlorella) [21]. Questo ritrovamento era inatteso: infatti, per la termodinamica delle soluzioni acquose, l'idrozincite dovrebbe precipitare solo in soluzioni nettamente basiche. L'effetto di questa bio-mineralizzazione è l'attenuazione della dispersione dello Zn nelle acque superficiali circolanti nella zona. Poiché anche altri carbonati idrati precipitano contestualmente con l'idrozincite, anche la dispersione di altri metalli pesanti (Pb, Cd, Cu) risulta essere ridotta.
E' tuttavia noto che le costanti di stabilità di complessi in soluzione tra metalli ed anioni organici secreti da organismi viventi hanno valori alti, e l'interazione tra minerali e la biosfera può quindi essere vista come un processo di mobilizzazione di metalli pesanti, che risulta nell'inquinamento di acque superficiali durante l'interazione con suoli ricchi in solfuri metallici. Lo scambio di materia tra suolo e vegetazione avviene all'interfaccia tra superfici minerali ed essudati radicali. Gli acidi organici sono i principali componenti gli essudati radicali [22] e possono trovarsi in concentrazioni rilevanti anche in ambienti idrotermali e sedimentari.
Mentre esiste già una letteratura relativamente numerosa per le superfici di ossidi e silicati, poco si conosce circa l'interazione tra superfici di solfuri metallici e leganti organici in condizioni supergeniche.
In precedenti lavori dell'Unità di Cagliari è stato mostrato che la dissoluzione della forma {001} della galena (PbS) in contatto con soluzioni sature in ossigeno avviene tramite la formazione di fasi nanometriche che ricoprono la superficie [23]. Si trovano fasi composte da Solfo nativo e fasi con legami tipo Pb-O [24]. L'energia di attivazione apparente della reazione di dissoluzione, che è inferiore a 20 KJ / mole a pH minore di 3, e ha un valore intorno a 45 KJ / mole a pH intorno 4-5, in presenza dell'anione acetato diminuisce di circa 10 KJ / mole [25].
Le reazioni elementari coinvolte nelle bio-mineralizzazioni in ambienti carbonatici sono poco conosciute [26], così come poco si conosce delle reazioni elementari che controllano le reazioni tra
solfuri metallici ed acqua [27] in presenza o meno di leganti organici.
La simulazione su base molecolare rappresenta una tecnica molto promettente che permette di studiare separatamente le varie fasi del meccanismo di precipitazione (dissoluzione) e consente di ottenere informazioni spesso non accessibili sperimentalmente.
I metodi di calcolo "a principi primi" possono affrontare problemi che interessano decine di atomi (~ 200) e seguire processi che si svolgono in qualche picosecondo. Queste limitate scale temporali e dimensionali non inficiano l'importanza di questi metodi che sono in grado di fornire informazioni sulle prime fasi delle reazioni e particolarmente su proprietà legate al sistema elettronico, quali densità, trasferimenti di carica, centri di Wannier e orbitali di Boys.
Le simulazioni computazionali multiscala cercano di colmare il gap temporale e spaziale fra aspetti microscopici e mesoscopici. Un esempio è il cosiddetto QM/MM [28]. Con questa tecnica il sistema studiato viene suddiviso in due regioni. Le regioni di interesse chimico (come, per esempio, i siti attivi nei processi enzimatici ) vengono trattate a livello quantistico (parte QM) utilizzando metodi ab initio, mentre la parte rimanente (incluso il solvente) viene descritta basandosi su potenziali classici (parte MM).
L'Unità di Cagliari ha già applicato queste tecniche allo studio della reattività di superfici minerali. Calcoli "a principi primi" [29] hanno evidenziato un rilassamento della superficie (001) della galena che si estende su diversi piani atomici. Studi teorici recenti [30] hanno mostrato che la superficie ideale di PbS è scarsamente reattiva e ciò non muta neppure in presenza di difetti puntuali superficiali . Esistono tuttavia evidenze di un aumento del tasso di dissociazione dell'acqua in prossimità di gradini, segno di un'elevata reattività in presenza e prossimità di nanostrutture. Uno studio a livello microscopico basato su metodologie "a principi primi" permetterebbe di aumentare le conoscenze delle proprietà fisico-chimiche delle superfici di sfaldatura in soluzione acquosa.
La comprensione di mineralizzazioni di origine biologica coinvolge studi interdisciplinari a differenti scale, che vanno da studi di campagna a studi a scala molecolare [20]. Come mostrato da recenti simulazioni a scala molecolare [31], è attualmente possibile progredire nella comprensione dei meccanismi elementari dei processi di dissoluzione/precipitazione di minerali in presenza o meno di specie chimiche organiche.


Il supporto matematico ai processi elementari della cristallizzazione

La nucleazione e la crescita di cristalli avviene spesso in accoppiamento con campi esterni (di concentrazione, temperatura, pressione, etc. ), la cui evoluzione viene influenzata dagli stessi cristalli in crescita. Poiché la nucleazione è solitamente casuale ( nello spazio e nel tempo), il cambiamento di fase viene rappresentato matematicamente con un processo stocastico, fortemente accoppiato all'evoluzione del campo sottostante. L'accoppiamento, unito ad un basso coefficiente di diffusione, genera eterogeneità nel campo sottostante, che è causa quindi a sua volta di crescita anisotropa dei cristalli. Si pensi ad esempio alla cristallizzazione di polimeri, dove la velocità di crescita radiale dei singoli cristalli dipende dal campo di temperatura sottostante, il quale e' a sua volta influenzato dal rilascio di calore latente, che causa dunque un innalzamento locale della temperatura in prossimità dei bordi dei cristalli in crescita.
Nel Dipartimento di Matematica dell'Università di Milano è nata una forte competenza sullo studio di processi di nucleazione e crescita in presenza di eterogeneità spazio-temporali.
In [32] viene riassunto il lavoro svolto in questi anni dal gruppo sulla Matematica dei Processi di Cristallizzazione di Polimeri. In [33] viene descritto un metodo di simulazione di un processo di nucleazione e crescita accoppiato con un campo sottostante. La simulazione ha lo scopo di riprodurre realisticamente un processo di cristallizzazione e può essere usata sia come alternativa agli esperimenti in laboratorio, sia per la messa a punto di stimatori dei parametri caratteristici del processo, spesso basati sulle caratteristiche geometriche e morfologiche dei cristalli ottenuti.
I fenomeni di cristallizzazione sono spesso rappresentabili da modelli a scale multiple, attraverso sistemi di particelle interagenti alla scala microscopica e con modelli "mean field" a scale piu' alte, accoppiando così campi continui (temperatura, concentrazione, etc. ) la cui evoluzione avviene su scala macroscopica, con fenomeni stocastici alla scala microscopica. L'evoluzione di tali sistemi può essere rappresentata pertanto da modelli ibridi, che descrivono alla scala macroscopica l'evoluzione del fronte di crescita dei cristalli [34-36]. Tali modelli conducono alla formulazione e allo studio di opportune "leggi dei grandi numeri", che consentono di mediare i fenomeni stocastici alla scala microscopica per formulare modelli deterministici che spiegano l'evoluzione media del sistema alla scala piu' grande. Un modello di questo tipo e' stato studiato in [39].
I modelli sopra citati sono stati studiati con particolare riferimento alla cristallizzazione di polimeri, dove il campo sottostante è la temperatura, ma sono estendibili ad altri processi di cristallizzazione, dove, ad esempio, la crescita è accoppiata al campo di sovrassaturazione circostante.
I metodi di stima dei parametri collegati all'uso dei modelli geometrici sono basati sullo studio delle caratteristiche geometriche (stocastiche) dei cristalli ottenuti (dimensioni e forma). Le stime si ottengono applicando a tali geometrie alcune tecniche tipiche della Shape Analysis Statistica [40] e della Geometria Stocastica, su cui l'Unita' di Milano ha una pluriennale esperienza [37, 38, 42]. <<<