RICERCA ITALIANA     

Biologia strutturale e dinamica di proteine redox

Università degli Studi di Pavia

Abstract

L'obiettivo della ricerca è quello di studiare proteine redox accomunate dalla complessità strutturale e funzionale mediante: a) metodi cristallografici; b) indagine cinetica dei meccanismi di reazione; c) ESR, EPR, spettroscopia IR risolta in tempo e microspettrofotometria di cristalli proteici; d) spettroscopia NMR multinucleare; e) metodi computazionali applicati a simulazioni di dinamica molecolare. E mediante ogni altro metodo adeguato non solo a studiare le singole strutture molecolari, ma anche l'intero processo ossido-riduttivo lungo una traiettoria temporale definita dalle coordinate di reazione, nell'arco di tempo dai picosecondi ai secondi e il ruolo della struttura e della flessibilità conformazionale nel trasferimento intra ed inter-proteico di elettroni. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Alessandro CODA Università degli Studi di PAVIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

L'obiettivo e' lo studio di un selezionato gruppo di proteine redox "al lavoro" nella cellula, che svolgono vitali funzioni catalitiche in vie metaboliche, o fondamentali funzioni di deposito e trasporto, attraverso meccanismi elettronici complessi, spesso associati a rilevanti cambiamenti conformazionali (trasferimento elettronico a corta e a lunga distanza all'interno di una singola molecola o tra molecole-subunità diverse nel caso di enzimi multicentrici; catalisi di reazioni parziali all'interno di una reazione GLOBALE; intervento di cofattori diversi e loro sinergia; eccitazione elettronica).
"Al lavoro" esprime bene l'obiettivo dei proponenti: lo studio di sofisticati meccanismi cellulari a livello dinamico, da una parte mediante sofisticate tecniche sperimentali, e dall'altra mediante strumenti teorici avanzati che consentono di prevedere, entro certi limiti, il "pattern" delle reazioni. Questi ultimi suggeriscono percio' da un lato mirati esperimenti specifici, anche di conferma della teoria, e dall'altro prendono ispirazione dalle osservazioni per mettere a punto un bagaglio piu' raffinato e preciso di metodi computazionali.
La Biologia Strutturale è entrata nell'era della Genomica Strutturale e della Proteomica, che la proiettano in un futuro ricchissimo di sviluppi di straordinaria portata,
All' identificazione dei geni di un organismo deve necessariamente far seguito lo studio dei loro prodotti di espressione, le proteine in particolare. Perché questo avvenga è necessaria la partecipazione di laboratori altamente qualificati nel campo del clonaggio, espressione, purificazione e caratterizzazione di proteine: è infatti comunemente riconosciuto che lo studio del 'proteoma' comporta difficoltà notevolmente maggiori dello studio del 'genoma'. Lo studio di una proteina comporta il suo isolamento in forma attiva e stabile, la conoscenza analitica del suo meccanismo di azione unito alla risoluzione della sua struttura tridimensionale. Ciò richiede un approccio multidisciplinare e sinergico e una comprensione completa del prodotto genico e del suo ruolo funzionale nella cellula. Appare sempre più evidente come nel contesto cellulare le proteine lavorino sotto forma di complessi, il che rende ancor più arduo e il loro studio e quello delle loro interazioni.
L'universo di indagini abbracciato da questo approccio prevede come traguardi di riferimento da un lato un ancoraggio a una consolidata struttura teorica [9, 10], e, all'estremo opposto, esperimenti di frontiera, come quelli cristallografici risolti nel tempo [13,14], che permettono, solo per portare un esempio significativo, di evidenziare e seguire le transizioni conformazionali avviate dalla fotolisi di CO, a temperatura ambiente, su un mutante della mioglobina.
Il carattere unitario che permea i singoli progetti delle cinque unità di ricerca nella loro integrazione in un programma comune, nasce dall'intersezione in un preciso e vitale punto focale di almeno tre ordini di considerazioni:
(1) la complessità strutturale, anche elettronica, dei sistemi presi in esame;
(2) un'indagine dei problemi estesa a un orizzonte spazio-temporale molto ampio. I problemi sono esaminati e sotto l'aspetto statico-strutturale, e dal punto di vista della reattività e dinamica delle reazioni. Vengono studiate non solo le strutture di specie stabili, ma anche quelle di intermedi di reazione, e la dinamica non è vista come mera descrizione strutturale di stati transienti ecc., ma come delucidazione dei meccanismi elettronici coinvolti;
(3) la presenza di competenze specifiche ben diversificate che soltanto nel loro insieme comprendono tutte le esigenze richieste.
Ritorniamo più in dettaglio sui punti precedenti:
(1) Vengono prese in considerazione proteine "complesse" in cui il meccanismo catalitico è lungi dall'essere chiarito, e dove "l'interplay" di numerosi centri di ossido-riduzione all'interno della stessa molecola, e la presenza di più subunità, o di domini multipli, stimola cruciali quesiti di tipo biochimico ed evoluzionistico.
(2) Il modo tradizionale di studiare il cammino di reazione è quello di collezionare una sequenza di immagini statiche di molecole stabili agli "estremi" di una reazione o in stadi intermedi, e/o un insieme di relativi mutanti, per controllare le modificazioni nelle proprietà chimico-fisiche del sistema: una tecnica, per cosi' dire, cinematografica, che simula un fenomeno dinamico e continuo mediante una sequenza di immagini statiche.
L'approccio dinamico-strutturale in questo progetto, aggiunto a quello tradizionale, è di descrivere le tappe di una reazione nel loro cammino continuo e reale, attraverso le varie fasi, a livello strutturale, nell'arco di tempo dai picosecondi ai secondi.
Si propone, inoltre, di studiare il percorso spazio-temporale di una reazione da un punto di vista strutturale, termodinamico e cinetico, anche nel senso di tentare di cogliere la risoluzione nel tempo della funzione di una proteina NEI CRISTALLI . Lo scopo ultimo di questo approccio avanzato della dinamica strutturale è di descrivere la traiettoria temporale di una reazione biologico-enzimatica nel cristallo in termini di tutti gli atomi di proteina e di substrato, nell'arco dai picosecondi ai secondi. Le proteine studiate sono state accuratamente scelte al fine di conformare le singole ricerche al presente programma che, ripetiamo, mira a un miglioramento di conoscenza in profondità sul funzionamento del più vasto insieme delle proteine redox.
(3) Il valore strategico e innovativo di queste indagini nel settore della biologia strutturale, in cui si rilevano importanti ricadute di carattere e fondamentale e applicativo (enzimologia, immunologia molecolare, struttura dei virus, "drug design") è basato su un alto contenuto di metodologia e di strumentazione avanzata, e su un approccio fortemente interdisciplinare.
Quanto prima illustrato vale e per la collaborazione diretta e per la messa in comune di competenze e anche servizi. E' questo il caso del presente programma in cui sono attive non solo ampie collaborazioni specifiche fra più laboratori (il che non assicura ancora l'unitarietà del progetto), ma un insieme integrato e completo di competenze la cui interazione è essenziale per affrontare in modo esauriente i problemi e per "centrare" l'obiettivo. In altri termini, solo l'insieme delle competenze e delle tecniche delle cinque unita' consente di coprire tutte le esigenze richieste per il successo del programma di ricerca.
Le singole collaborazioni fra due o più laboratori sono precisate più avanti nella sezione 2.3 (Descrizione del ruolo delle Unità operative locali); qui si vuole soprattutto sottolineare la focalizzazione globale di competenze diverse e specifiche. Da un lato la cristallografia, e per essa vale la pena di mettere in evidenza il progresso raggiunto nella soluzione di strutture di "oggetti" di massa molecolare sempre più grande, l'automazione e la rapidità di raccolta dei dati sperimentali straordinariamente elevate, e una risoluzione spaziale spinta verso i suoi limiti teorici che sempre più coincide con la risoluzione atomica, ossia la cristallografia tempo-risolta. Dall'altro lo studio cinetico di meccanismi di reazione, attraverso metodi spettroscopici complessi quali ODMR e microspettrofotometria di cristalli. La Spettroscopia NMR multinucleare fornisce informazione cruciale per un confronto delle interazioni proteina-proteina in soluzione e nel cristallo. Infine vengono applicati metodi computazionali a simulazioni di dinamica molecolare.
Da tale integrazione deriva da una parte un valore "aggiunto" che costituisce la cifra di questo progetto, che non è affatto l'accostamento incoerente delle esperienze delle singole unità; dall'altra appare certo che il progetto non potrebbe neppure decollare senza che fosse assicurata l'integrazione di cui si è parlato. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il Programma nazionale qui descritto nasce dall'estinguersi della maggior parte degli obiettivi specifici di un Programma precedente (COFIN 2003) e dallo scaturire dalle sue tematiche di fondo di nuove linee di ricerca di altissimo interesse, come naturale evoluzione dello stesso.
(a) Il coordinatore scientifico del Programma nazionale proposto ha fondato e coordinato fin dal 1980, anno del varo della legge 382, a tutt'oggi, un gruppo MURST quota 40% comprendente in media 50 unità operative distribuite in tutto il territorio nazionale, e appartenenti ai due comitati CUN 03 e 05. All'inizio dell'attività egli aveva curato il regolamento e la messa a punto della modulistica insieme al funzionario del Ministero della PI (Dott. Luigi Sentinelli).
(b) Ha anche coordinato negli anni '90 un Gruppo Strategico CNR, di Biologia Strutturale..
(c) E' stato il Coordinatore scientifico di due consecutivi Programmi di ricerca biennali nazionali MURST, il primo con 17 unita' (COFIN 1999), e il secondo con 7 (COFIN 2001, ed e' attualmente coordinatore di un terzo Programma nazionale biennale MURST (COFIN 2003), che sta giungendo al suo termine, ancora con 7 unità. Entrambi rientrano nei campi della Biologia e Dinamica Strutturale.
(d) Come apparira' nel punto (e), il Programma qui presentato ha un VALORE AGGIUNTO molto spiccato ed essenziale rispetto alla somma delle unita' costituenti. Infatti solo dall'integrazione di tecniche, metodologie, approcci teorici e sperimentali si ottiene un avanzamento sistematico, coerente e intensamento produttivo, quali- e quantitativamente nella direzione degli obiettivi prefissati. Senza tale integrazione essi sarebbero fuori portata. Un esempio tipico e' costituito dalla convergenza di tecniche cristallografiche con raggi X, microspettrofotometria su cristallo e spettroscopia EPR su enzimi cristallini [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7].
(e) Per quanto riguarda i contenuti del Programma nazionale qui presentato, e per ciò che attiene alla base di partenza, è ben noto che la risoluzione delle strutture tridimensionali delle macromolecole biologiche a livello atomico, date le loro dimensioni, ha rappresentato uno dei problemi più complessi e uno dei successi maggiori nella Scienza moderna. Nei primi anni '50 J.C. Kendrew e M.F. Perutz risolvevano le prime strutture di proteine, e nello stesso Laboratorio di Cambridge, il lavoro di R. Franklin, J. Watson e F. Crick portava alla scoperta fondamentale nel campo della Biologia moderna e cioé la struttura a doppia elica del DNA. Queste due scoperte hanno fornito le basi iniziali per la descrizione e comprensione dei processi vitali a livello molecolare. Da allora è stato evidente a tutti che la conoscenza della struttura tridimensionale delle macromolecole biologiche costituisce una chiave di lettura fondamentale per la comprensione approfondita di processi biologici quali l'attivazione di geni, la trasduzione di segnali chimici e fisici, la catalisi enzimatica, la risposta immunitaria, e molti altri. Inoltre, il conoscere la struttura atomica di una macromolecola consente, in linea teorica e pratica, di progettare nuovi farmaci per il trattamento di patologie fra le più varie, riconducibili alla macromolecola stessa. Fino a tempi recenti, la determinazione della struttura tridimensionale di una proteina richiedeva anni di lavoro e grandissime risorse economiche; era perciò limitata a un piccolo numero di centri di ricerca e a pochi scienziati. Lo sviluppo tecnologico (che oggi risponde alla sfida delle esigenze crescenti della Proteomica) ha accelerato enormemente le procedure per risolvere la struttura tridimensionale di una macromolecola; dal 1959 ad oggi sono state risolte a livello atomico molte migliaia di differenti strutture.
E' utile ricordare alcuni esempi di importanti scoperte rese possibili negli ultimi anni dagli sviluppi della Biologia strutturale. Il meccanismo molecolare attraverso il quale si realizza il controllo dell'espressione genica è stato delucidato tramite analisi strutturale dei complessi tra repressori e sequenze di DNA da essi specificamente riconosciute. La scoperta dei determinanti strutturali che condizionano il processo di riconoscimento molecolare, per esempio nella formazione dei complessi antigene-anticorpo, ha portato a un nuovo campo di indagine scientifica, l'immunologia molecolare. L'importanza del concetto di specificità nella catalisi enzimatica, indiscussa in campo biochimico, è stata dimostrata con la risoluzione della struttura tridimensionale di un enzima e del suo complesso con inibitori specifici; la sintesi di nuovi inibitori è oggi progettata sulla base della struttura dell'enzima bersaglio. Tra i risultati di maggiore rilievo ottenuti dalle tecnologie strutturali, si devono anche menzionare la risoluzione della struttura tridimensionale di intere particelle virali e di ribosomi (gli oggetti biologici di maggiori dimensioni finora studiati) e quella del centro di reazione per la fotosintesi (la prima proteina di membrana).
Ma la Biologia strutturale deve i suoi straordinari recenti progressi, oltre che alla cristallografia, alla crescita di approcci concettuali e sperimentali fra loro complementari, basati in parte su strumentazioni complesse ad alta tecnologia, e in parte su metodologie della biochimica, della genetica e biologia molecolari, della chimica fisica e della biofisica. Varie tecniche spettroscopiche forniscono le informazioni dinamiche che sono essenziali per l'interpretazione dei meccanismi molecolari che sono alla base delle funzioni proteiche [8, 11, 12]. Ogni tecnica spettroscopica è rilevante, in questo senso, per un particolare dominio della dinamica che copre un ventaglio vastissimo, che va da quello delle ore e dei secondi delle reazioni lente a quello dei femto- e pico-secondi dei movimenti elettronici [13, 14]. Quando le tecniche sperimentali forniscono una quantità limitata di informazioni sulla struttura, le simulazioni al calcolatore rappresentano il metodo teorico più potente per studiare le proteine a livello atomico. Le simulazioni suggeriscono esperimenti mirati e gli esperimenti indirizzano le ricerche basate su tecniche computazionali, in una sorta di reciproco stimolo [9, 10].
Le tecniche spettroscopiche si prestano particolarmente nel caso delle proteine che sono l'oggetto di studio del programma: le proteine redox e fotoredox. E' la classe di proteine che costituiscono i principali componenti delle due catene di trasporto elettronico, basilari per le trasduzioni energetiche cellulari, quella respiratoria e quella fotosintetica [15, 16] ma si ritrovano altresì in numerosissimi altri sistemi enzimatici di estrema rilevanza teorica e pratica.
Queste proteine contengono cofattori (emi, flavine, porfirine, caroteni ecc.) le cui proprietà elettroniche consentono indagini spettroscopiche sia nel vicino UV e nel visibile, sia nella regione delle microonde attraverso la risonanza magnetica elettronica.
Un ulteriore importante aspetto è rappresentato dalla dettagliata analisi del meccanismo proteico in funzione del tempo e delle variazioni strutturali che ad esso si accompagnano (dinamica strutturale) [11, 12]. In tale contesto l'identificazione di intermedi di reazione attraverso misure spettroscopiche in un cristallo singolo e il loro confronto con i dati in soluzione è di primaria importanza.
Altrettanto importante è lo studio approfondito di proteine di deposito e trasporto dotate di centri redox.
Il Programma nazionale qui descritto risponde ad alcune linee guida, che rendono lo stesso aderente a criteri di priorità in campo nazionale e internazionale, e cioè:
(A) Il significato strategico e il valore innovativo, come dimostrato dagli straordinari risultati di carattere fondamentale e applicativo ottenuti in questo campo negli ultimi anni.
(B) L'alto contenuto tecnologico delle metodologie e delle strumentazioni, che si rinnovano ed evolvono con rapidità per ottenere risultati sempre più ambiziosi.
(C) Il carattere fortemente interdisciplinare, al quale contribuiscono ricercatori di diversa estrazione (cristallografia, cristallografia tempo-risolta, studio cinetico dei meccanismi di reazione, spettroscopie di risonanza magnetica - EPR, EPR risolto nel tempo, CW-EPR, TR-EPR, FT-EPR, ODMR -, complementarmente alla microspettrofotometria su cristallo singolo, spettroscopia NMR multinucleare, metodologie per studiare l'interazione proteina-proteina in soluzione e nel cristallo, simulazioni al calcolatore e sviluppo di nuove tecniche computazionali), unito all'importanza di un efficace coordinamento nazionale fra i gruppi attivi nel nostro Paese, peraltro già positivamente sperimentato nell'ambito di un Progetto strategico del CNR e di alcuni Progetti MURST nazionali.
(D) La ovvia consonanza con gli obiettivi della Unione Europea che ha considerato la Biologia strutturale un'area di punta da sviluppare, come testimonia l'iniziativa di un coordinamento europeo nel settore. <<<