RICERCA ITALIANA     

Ruolo della proteolisi intracellulare nella regolazione della risposta immunitaria innata ed acquisita.

Università degli Studi di Genova

Abstract

Il progetto si propone di sviluppare nuovi approcci interdisciplinari, mirati a stabilire il ruolo del sistema calpaina/calpastatina nella regolazione della risposta immunitaria. Il coinvolgimento della proteolisi in questo processo è suggerito dall'aumento della concentrazione di calcio intracellulare conseguente alla stimolazione cellulare, la presenza di specifiche isoforme di calpaina nei vari tipi cellulari interessati e dall'effetto citolitico espresso da alcune cellule immunocompetenti.
Il programma di ricerca affronterà i seguenti argomenti:
-Identificazione e caratterizzazione delle calpaine presenti in popolazione omogenee di linfociti o in linee cellulari con proprietà funzionali simili e caratterizzazione del sistema di regolazione della proteolisi calcio dipendente.
-Meccanismi di attivazione del sistema e substrati preferenziali ed identificazione dell'attivazione del sistema in cellule intatte, anche mediante preparazione di costrutti fluorescenti di diverse forme di calpaina e di calpastatina e loro transfezione in diverse linee o popolazioni cellulari.
-Studio dell'interazione tra calpaina e calpastatina, dell'attivazione e della localizzazione della proteasi utilizzando la tecnica FRET.
-Correlazione tra modificazione dell'omeostasi del calcio ed attivazione del sistema calpaina/calpastatina. Attivazione del sistema nella risposta immunitaria e nella regolazione delle funzioni delle cellule effettrici del sistema immunitario.
-Ruolo extracellulare delle calpaine e interazione con altri sistemi proteolitici intracellulari e crosstalk con altre vie di trasduzione del segnale.
Il progetto si prefigge di stabilire se il sistema proteolitico calcio dipendente presente nelle cellule immunocompetenti partecipa alle funzioni di queste cellule ed in particolare alla citotossicità da esse mediata. Questa indagine verterà sulla caratterizzazione e analisi delle proprietà dei componenti del sistema, valutazione delle condizioni che promuovono l'attivazione del sistema e l'interazione delle proteasi con strutture intracellulari. L'interazione della calpaina con il suo inibitore naturale e con i substrati bersaglio principali potrà essere studiata con metodologie di microscopia a fluorescenza e confocale e FRET (fluorescence resonance energy tranfer). Sarà possibile effettuare questi esperimenti mediante l'overespressione di proteasi ed inibitore di proteine bersaglio coniugate a fluorofori che potranno essere utilizzate sia per la FRET sia per l'identificazione di siti specifici di attivazione e di azione.
La presenza nella cellula di forme attive di proteasi calpaina potrà essere affrontato con un approccio innovativo che contempla la produzione ed utilizzo di anticorpi conformazione-specifici, cioè in grado di distinguere tra le forme inattive e attive della proteasi.
L'espressione delle isoforme di calpaina nei diversi tipi cellulari coinvolti nella risposta immunitaria sarà valutata mediante immunofluorescenza intracitoplasmatica e successiva analisi citofluorimetrica, utilizzando specifici anticorpi monoclonali in grado di discriminare le diverse forme di calpaina. In particolare, intendiamo approfondire le conoscenze attuali sulla distribuzione delle calpaine in cellule sia di tipo linfoide che mieloide. Inizialmente verrà analizzato un pannello di linee rappresentativo di diverse popolazioni cellulari coinvolte nella risposta immunitaria innata e acquisita e successivamente intendiamo confrontare i risultati ottenuti con la valutazione dell'espressione delle diverse forme di calpaina in cellule isolate dal sangue periferico.
Nel caso dei linfociti T e delle cellule NK, l'analisi dell'espressione delle calpaine potrà essere condotta su popolazioni cellulari e a livello clonale. Il ruolo delle calpaine nella citotossicità potrà essere valutato anche in linfociti T citotossici usando come cellule bersaglio cellule dendritiche autologhe caricate con i peptidi specificamente riconosciuti. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Edon MELLONI Università degli Studi di GENOVA

Obiettivo del Programma di Ricerca

In questo progetto si cercherà di rispondere a quesiti ancora da chiarire che riguardano da un lato la funzione del sistema proteolitico intracellulare calpaina/calpastatina e dall'altro il suo coinvolgimento nella regolazione della risposta immunitaria innata ed acquisita.
Il coinvolgimento della proteolisi in questi processi è suggerito da un aumento della concentrazione di calcio intracellulare conseguente alla stimolazione cellulare, la presenza di specifiche isoforme di proteasi nei vari tipi cellulari interessati, l'effetto citolitico espresso da alcune cellule immunocompetenti. Partendo da queste premesse, il progetto si propone di sviluppare nuove proposte e nuovi approcci sperimentali interdisciplinari, mirati all'identificazione e caratterizzazione del sistema proteolitico e delle sue funzioni intracellulari.
Molte delle limitazioni che non hanno ancora consentito fino ad oggi di definire la funzione del sistema proteolitico riguardano i modelli sperimentali da utilizzare, l'impossibilità di riconoscere in vivo l'azione di specifiche isoforme della proteasi, la mancanza di osservazioni in vivo sul meccanismo di attivazione e di regolazione, la pluralità di forme di proteasi che possono essere coinvolte e di proteine bersaglio. In questo progetto si intende chiarire alcune di queste problematiche anche mediante l'uso di metodologie innovative che permettano di affrontare questi argomenti direttamente nelle cellule sia in condizioni basali sia dopo stimolazione con induttori specifici e naturali. L'utilizzo di linee cellulari con espressione di forme isozimatiche diverse di calpaina e allo stesso tempo la selezione di popolazioni omogenee di cellule della serie bianca coinvolte nella risposta immune, potranno fornire informazioni dettagliate sul ruolo delle diverse isoforme di calpaina. L'attivazione delle cellule coinvolte nella risposta immune mediante la stimolazione di recettori specifici è un modello che non è ancora stato usato per stabilire il ruolo della proteolisi calcio-dipendente nella cellula. Un altro punto ancora da definire in dettaglio riguarda l'interazione della proteasi calpaina con il suo inibitore naturale calpastatina. La formazione del complesso enzima-inibitore, la tappa fondamentale del sistema di regolazione, è stata caratterizzata in sistemi ricostruiti, ma non in vivo. Il nostro approccio sperimentale prevede, data la disponibilità di sonde per la produzione di proteine ricombinanti e di anticorpi conformazione-specifici, di studiare l'interazione calpaina-calpastatina direttamente nella cellula attraverso l'identificazione di forme conformazioni selettive e caratteristiche e con la tecnica FRET. Queste nuovi approcci sperimentali sono possibili per la presenza nelle due Unità che partecipano al progetto di ricerca di competenze tra loro complementari che possono affrontare le tematiche descritte da punti diversi. Le evidenze sperimentali così prodotte potranno non solo integrarsi, ma costituire anche un valido sistema di verifica e di valutazione dei dati ottenuti. Inoltre, data la rilevanza del sistema anche in alcune condizioni patologiche umane (dalla neurodegenerazione, all'ischemia , fino all'ipertensione essenziale), la conoscenza del sistema e della sua regolazione potrebbe fornire nuovi strumenti per un trattamento farmacologico mirato. Il programma di ricerca proposto dalle due unità svilupperà i seguenti argomenti:
-Identificazione e caratterizzazione delle calpaine presenti in popolazione omogenee di linfociti o in linee cellulari con proprietà funzionali simili e caratterizzazione del sistema di regolazione della proteolisi calcio dipendente.
-Meccanismi di attivazione del sistema e substrati preferenziali ed identificazione dell'attivazione del sistema in cellule intatte, anche mediante preparazione di costrutti fluorescenti di diverse forme di calpaina e di calpastatina, loro transfezione in diverse linee o popolazioni cellulari.
-Studio dell'interazione tra calpaina e calpastatina, dell'attivazione e della localizzazione della proteasi utilizzando la tecnica FRET.
-Correlazione tra modificazione dell'omeostasi del calcio ed attivazione del sistema calpaina/calpastatina. Attivazione del sistema nella risposta immunitaria e nella regolazione delle funzione delle cellule effettrici del sistema immunitario.
-Ruolo extracellulare delle calpaine e interazione con altri sistemi proteolitici intracellulari e crosstalk con altre vie di trasduzione del segnale.
La complementarietà tra i programmi e le esperienze e le competenze dei vari gruppi afferenti al progetto favorirà il raggiungimento degli obiettivi prefissati, sommariamente indicati sopra.
Il progetto si prefigge di stabilire se il sistema proteolitico calcio dipendente presente nelle cellule immunocompetenti partecipa alle funzioni di queste cellule ed in particolare alla citotossicità da esse mediata. Potrà così essere valutato se molte delle risposte di queste cellule indotte dall'interazione di ligandi specifici a recettori esposti sulla loro superficie sono direttamente o indirettamente mediati dall'attivazione del sistema proteolitico. Questa indagine verterà sulla caratterizzazione e analisi delle proprietà dei componenti del sistema, valutazione delle condizioni che promuovono l'attivazione del sistema e l'interazione delle proteasi con strutture intracellulari. L'interazione della calpaina con il suo inibitore naturale e con i substrati bersaglio principali potrà essere studiata con metodologie di microscopia a fluorescenza e confocale e FRET (fluorescence resonance energy tranfer). Sarà possibile effettuare questi esperimenti mediante l'overespressione di proteasi ed inibitore di proteine bersaglio coniugate a fluorofori che potranno essere utilizzate sia per la FRET sia per l'identificazione di siti specifici di attivazione e di azione.
La presenza nella cellula di forme attive della proteasi calpaina potrà essere affrontato con un approccio innovativo che contempla la produzione utilizzo di anticorpi conformazione-specifici, cioè in grado di distinguere la forme inattive ed attive della proteasi.
L'espressione delle isoforme di calpaina nei diversi tipi cellulari coinvolti nella risposta immunitaria sarà valutata mediante immunofluorescenza intracitoplasmatica e successiva analisi citofluorimetrica, utilizzando specifici anticorpi monoclonali in grado di discriminare le diverse forme di calpaina. In particolare, intendiamo approfondire le conoscenze attuali sulla distribuzione delle calpaine in cellule sia di tipo linfoide che mieloide. Inizialmente verrà analizzato un pannello di linee rappresentativo di diverse popolazioni cellulari coinvolte nella risposta immunitaria innata e acquisita e successivamente intendiamo confrontare i risultati ottenuti con la valutazione dell'espressione delle diverse forme di calpaina in cellule isolate dal sangue periferico.
Nel caso dei linfociti T, intendiamo studiare sottopopolazioni cellulari con diverse caratteristiche fenotipiche e funzionali, quali linfociti CD4+ e CD8+. Per i linfociti T e le cellule NK, l'analisi dell'espressione delle calpaine potrà essere condotta sia su popolazioni cellulari che a livello clonale. L'attivazione delle cellule NK avverrà mediante l'oligomerizzazione dei recettori attivatori di membrana, quali CD16 e NCR. Infine, per quanto riguarda cellule della linea monocitaria, potremo valutare l'espressione delle calpaine durante la differenziazione e maturazione dei monociti in macrofagi o cellule dendritiche. Il ruolo delle calpaine nella citotossicità potrà essere valutato anche in linfociti T citotossici usando come cellule bersaglio cellule dendritiche autologhe caricate con i peptidi specificamente riconosciuti. Inoltre, valuteremo se cellule T CD4+, CD8+ o NK attivate in presenza dell'antigene o mediante stimoli policlonali siano in grado di produrre le stesso pattern di citochine in presenza e in assenza di calpastatina. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il sistema proteolitico calpaina/calpastatina (1-3) è espresso nel citosol di tutte le cellule di mammifero ed è costituito da uno o più membri della famiglia delle calpaine e da una o più forme dell'inibitore calpastatina. La famiglia della calpaine è costituita da circa 15 membri che hanno in comune una serie di proprietà catalitiche e regolatrici. Una delle caratteristiche comune a tutte le forme di calpaina è la suddivisione del dominio catalitico in due sottodomini. Questa disorganizzazione allontana i residui della triade catalitica (Cys, His e Asn) lasciando l'enzima in una condizione inattiva(3,4). E' cosi necessaria una modificazione conformazionale che generi il corretto allineamento della triade catalitica e renda la proteasi capace di catalizzare la sua reazione idrolitica. Un'altra caratteristica strutturale comune a molte forme di calpaine è la presenza di un dominio simile alla calmodulina contenente cinque strutture EF-hand capaci di legare ioni Ca2+. Questa proprietà e la dipendenza della proteasi dagli ioni calcio, da cui trae il nome l'enzima, è ulteriormente esaltata dalla presenza di altri siti che possono legare ioni Ca2+ distribuiti in altre regioni della proteina, tra cui anche il dominio catalitico. Molte calpaine sono proteine dimeriche, in cui la subunità pesante contenente il sito catalitico si associa ad una seconda subunità leggera, che contiene anch'essa cinque sequenze EF-hand. Due delle forme di calpaina note come μ(micro)- e m(milli)-calpaina, espresse in tutte le cellule di mammifero, sono eterodimeri e mostrano come ci si aspetta una dipendenza assoluta dagli ioni calcio (3, 5). Poichè sono state identificate le strutture tridimensionali di queste proteasi in assenza e in presenza di calcio, si è potuto definire in dettaglio il loro meccanismo di attivazione. Mediante la tecnologia SAX e la cristallografia ai raggi X (4, 5) si è potuto stabilire che queste proteasi possono passare reversibilmente da una forma inattiva ad una attiva per effetto del legame di ioni calcio. Nella forma attiva la proteasi espone regioni idrofobiche che sono poi utilizzate per interagire con proteine di regolazione o di ancoraggio in particolari localizzazioni intracellulari (3, 6).
L'altro componente del sistema proteolitico è la calpastatina, l'inibitore naturale della proteasi: è una proteina citosolica che presenta una struttura peculiare. E' costituita da cinque domini, di cui quattro sono omologhi e contengono regioni altamente conservate che interagiscono con il sito attivo della proteasi (7). La calpastatina è quindi un inibitore competitivo, ma i dettagli del suo meccanismo d'azione sono poco noti. La mancanza di precise informazioni ha generato il concetto di funzione patologica della calpaina che si accompagna all'alterazione dell'omeostasi del calcio intracellulare (8). È stato suggerito un possibile coinvolgimento della proteasi nella degradazione di strutture intracellulari responsabili del danno alle cellule o ai tessuti. In molti casi questa funzione dipende dal fatto che la regolazione del sistema proteolitico può diventare inefficiente. Una patologia in cui si osserva una condizione simile è l'ipertensione essenziale. In ratti geneticamente ipertesi abbiamo osservato che in tessuti come cuore, rene e globuli rossi i livelli di calpastatina sono diminuiti da circa il 50 % ad oltre il 90% rispetto ai controlli (8). Questo deficit di inibitore è una caratteristica acquisita, come dimostra il fatto che una terapia che riporta alla normalità la concentrazione di calcio intracellulare e abbassa la pressione arteriosa, ripristina anche i livelli normali di calpastatina. Abbiamo dimostrato anche che questo deficit è provocato dalla stessa calpaina in quanto la calpastatina non è completamente resistente all'enzima e così l'attivazione di grandi quantità di proteasi e della interazione prolungata tra i due componenti porta ad una digestione della proteina inibitrice e ad uno sbilanciamento del sistema di regolazione.Sperimentazioni condotte nel nostro laboratorio hanno dimostrato che la calpastatina subisce anch'essa una serie di modificazioni post-traduzionali che ne modificano efficienza, specificità e localizzazione intracellulare (8-12). Mediante processi di fosforilazione reversibile catalizzati dalle proteine chinasi A e C, la cellula sembra in grado di modulare i livelli di calpastatina citosolica. In condizioni basali di [Ca2+], la calpastatina è localizzata in aggregati perinucleari e ciò fa pensare alla presenza di proteine di ancoraggio specifiche. La forma di calpastatina presente negli aggregati è quella fosforilata dalla PKA, come dimostra l'effetto del dibutirril-AMP-ciclico e della forskolina in cellule neuronali. La mobilizzazione degli ioni Ca2+ promuove da un lato l'attivazione della calpaina e dall'altro la ridistribuzione della calpastatina a seguito della sua defosforilazione. In questo modo si può comprendere come la proteasi possa attivarsi e svolgere la sua funzione anche se è presente un eccesso di inibitore. Una volta libero l'inibitore è sottoposto ad una seconda regolazione da parte della PKC, che ,attraverso la fosforilazione a livello di siti specifici, modifica l'efficienza inibitoria della proteina. Quindi anche se la ridistribuzione rende "disponibile" una grande quantità di inibitore, questo secondo processo di modificazione post-traduzionale consente ugualmente alla proteasi di svolgere la sua funzione (13).
Recentemente abbiamo indirizzato la nostra attenzione verso cellule delle serie bianca del sangue per stabilire se queste potessero presentare caratteristiche idonee per studiare e caratterizzare una possibile funzione della calpaina e meglio definire il ruolo della calpastatina in processi di attivazione fisiologici. Con nostra sorpresa abbiamo osservato che i linfociti circolanti (PBMC) presentano tre attività proteolitiche Ca2+ dipendenti, anziché due, come gli altri tessuti. Grazie a tecniche di biologia molecolare e di biochimica classica abbiamo isolato e caratterizzato da queste cellule una nuova forma di calpaina (14). Questa nuova proteasi ha proprietà in comune con le calpaine classiche, ma altre che sono peculiari, come una ridotta sensibilità alla calpastatina e un processo di attivazione reversibile che non contempla la produzione di forme autoproteolizzate attive a basse concentrazioni di calcio. Dalla determinazione della sequenza è risultato che questo enzima deriva dal gene canp3, che codifica la calpaina 3, mediante uno specifico splicing alternativo. Poiché sono state individuate nella retina del ratto e dell'uomo altre forme di calpaina derivate dal gene canp3, è probabile che dal gene canp3 si possano generare mediante processi di splicing alternativo forme di calpaine espresse in specifici tessuti o cellule con altrettanto specifiche proprietà e funzioni (15). Da un esame di alcune sottopopolazioni leucocitarie, è risultato che la proteasi è espressa anche se a livelli diversi in quasi tutti i tipi cellulari, mentre è assente nei precursori dei globuli rossi e nei neutrofili. Questa distribuzione suggerisce una funzione specifica di questa forma di calpaina nelle cellule deputate al controllo della risposta immunitaria. Quindi ci si può aspettare che nelle cellule oltre alle calpaine considerate classiche, possono essere presenti altre forme di proteasi più correlate alle specifiche funzioni della cellula. Questa ipotesi apre un nuovo campo di ricerca, concernente il ruolo di questi nuovi enzimi in specifiche funzioni come l'induzione della risposta immune.

Tra le cellule che partecipano alla risposta immunitaria possiamo distinguere cellule responsabili dell'immunità innata, che contribuiscono alla prima linea di difesa aspecifica dell'organismo contro i patogeni, e cellule responsabili dell'immunità acquisita, coinvolte nell'induzione di risposte caratterizzate dalle proprietà della specificità e della memoria,
Le componenti cellulari dell'immunità innata sono le cellule fagocitiche (granulociti neutrofili, monociti, macrofagi tissutali e cellule dendritiche) e altri leucociti quali le cellule ad attività citotossica naturale, dette cellule Natural Killer (NK); i linfociti T e B sono invece gli "effettori" dell'immunità specifica.
Le cellule dendritiche (DC) sono cellule presentanti l'antigene professioniste (APC) e la loro funzione principale è quella di iniziare e modulare le risposte immuni. In base al loro stadio differenziativo/funzionale esse possono essere distinte in cellule dendritiche immature (iDCs) e cellule dendritiche mature (mDCs). Le iDCs sono presenti, sotto forma di precursori, nel sangue e in quasi tutti i tessuti dove internalizzano e processano sia antigeni solubili attraverso la macropinocitosi e l'endocitosi mediata da recettori, sia antigeni particolati (ad esempio corpi apoptotici) (16).
Le cellule effettrici coinvolte dell'immunità naturale e acquisita sono rispettivamente le cellule NK e i linfociti T CD8+. Le cellule NK costituiscono una sottopopolazione di linfociti presente nel sangue periferico e nei tessuti linfoidi, originariamente descritte come cellule in grado di uccidere cellule tumorali o infettate da virus senza una precedente stimolazione e attivazione (17). Le funzioni delle cellule NK sono finemente regolate da un bilanciamento tra segnali opposti che derivano dalla stimolazione di recettori inibitori e attivatori presenti sulla loro superficie. Dall'inizio degli anni ‘90 ad oggi il nostro laboratorio ha studiato molti recettori espressi dalle cellule NK, contribuendo alla loro caratterizzazione funzionale e molecolare (18, 19). Le cellule NK esprimono una serie di recettori inibitori specifici per diversi alleli HLA di classe I. L'interazione tra questi recettori e i rispettivi ligandi HLA determina il blocco dell'attività citotossica; grazie a questo sistema di controllo le cellule "self" dell'organismo, che esprimono normali livelli di molecole HLA di classe I, non vengono uccise dalle cellule NK. Cellule con diminuita espressione o mancanza di HLA di classe I diventano invece suscettibili alla lisi NK-mediata (20, 21); questa situazione può verificarsi in cellule tumorali o in cellule infettate da determinati virus. Le cellule NK esprimono inoltre diversi recettori attivatori coinvolti nell'induzione della citotossicità (18). L'attività citotossica delle cellule NK si esplica attraverso due meccanismi distinti: la citotossicità naturale e la citotossicità cellulo-mediata dipendente da anticorpi (ADCC). Attraverso quest'ultimo meccanismo, le cellule NK sono in grado di riconoscere e uccidere cellule bersaglio ricoperte da anticorpi. La molecola responsabile dell'ADCC è il CD16, il recettore a bassa affinità per la porzione Fc degli anticorpi di isotipo IgG, capace di trasdurre un segnale attivatorio all'interno della cellula in quanto associato alla catena ζ del CD3 e/o alla catena γ del recettore ad alta affinità per le IgE (18, 22). Per quanto riguarda invece la citotossicità naturale, i principali recettori responsabili sono i recettori NCR (Natural Cytotoxicity Receptors, e NKG2D (18, 23-27). I recettori NCR trasducono un segnale attivatorio all'interno della cellula in quanto sono associati a diverse molecole adattatrici, caratterizzate dalla presenza di motivi ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs); il "cross-linking" dei recettori NCR determina tre eventi precoci: l'attivazione di tirosinchinasi della famiglia src p56lck and p59fyn, la fosforilazione in tirosina delle catene associate ai recettori NCR e l'attivazione delle tirosinchinasi citoplasmatiche p72syk e ZAP70 (22, 28). Il recettore NKG2D è invece associato alla molecola trasduttrice DAP10, che in seguito a fosforilazione in tirosina lega la fosfatidilinositolo-3-chinasi (22).
Oltre all'induzione della citotossicità, l'attivazione delle cellule NK determina la produzione di citochine e chemochine che inducono infiammazione e modulano la differenziazione/maturazione di cellule dendritiche; le cellule NK sono quindi anche in grado di influenzare le risposte immunitarie acquisite (27, 29).
I linfociti effettori dell'immunità acquisita sono i linfociti TCRαβ+ CD8+ citotossici: tipicamente essi riconoscono peptidi antigenici presentati sulla cellula bersaglio nel contesto delle molecole HLA di classe I classiche (HLA-A, -B e –C). Inoltre, recenti evidenze sperimentali indicano che anche molecole HLA di classe I non classiche possono presentare antigeni a linfociti TCRαβ CD8+. In particolare, nel nostro laboratorio abbiamo identificato un particolare subset di linfociti T CD8+ TCRαβ citotossici specifici per peptidi virali derivati dalla proteina gpUL 40 del CMV e ristretti per la molecola HLA di classe I non classica HLA-E. Come per le cellule NK, anche i linfociti T CD8+ se attivati dal cross-linking del recettore per l'antigene (TCR) sono in grado mediare di la citotossicità e di produrre citochine (30-33)
Sia l'attivazione che le funzioni effettrici delle cellule NK e dei linfociti T citotossici CD8+ (CTL) sono regolate da sistemi proteolitici intracellulari. Durante l'interazione tra i ligandi naturali presenti sulla cellula bersaglio e i recettori attivatori (TCR sui linfociti T e NCR sulle cellule NK) si ha un incremento della quantià di calcio intracellulare libero [Ca2+]i che influenza sia l'attivazione di enzimi quali CAMKII e PKC (34-36) coinvolti nella trasmissione del segnale che l'attivazione del sistema proteolitico calpaina/calpastatina. Inoltre, la riorganizzazione delle proteine del citoscheletro che avviene dopo che le cellule effettrici hanno aderito alla cellula bersaglio, e che permette il rilascio di sostanze citotossiche e la secrezione di citochine nel sito di contatto, è mediata da proteasi calcio-dipendenti, quali le calpaine. Infine, l'uccisione della cellula bersaglio che avviene dopo il rilascio di granuli citotossici (perforine e granzimi) da parte dei linfociti T e NK, richiede l'attivazione di una famiglia cisteina proteasi dette caspasi che inducono l'apoptosi (37).
Molte delle tappe rilevanti delle vie di traduzione di segnali sono mediate da interazioni proteina-proteina. Processi analoghi sono pure coinvolti nella regolazione delle proteasi mediante l'associazione a proteine inibitrici. Anche se sono disponibili molti metodi per lo studio di queste interazioni in sistemi a cellula aperta, è molto più complicato affrontare questa problematica in vivo. La tecnologia "Fluorescence Resonance Energy Transfer" (FRET) può risolvere questi problemi identificando proteine che si avvicinano le une alle altre a distanze atomiche e quindi in grado di associarsi tra loro. La "green fluorescent protein" (GFP) insieme con i suoi differenti mutanti ha avuto un grande sviluppo come marker naturale fluorescente in cellule. Coppie di proteine fluorescenti sono usate come donatore e accettore nella FRET (38). La FRET è un efficace metodo di microscopia per ottenere informazioni sulla distanza tra complessi molecolari. Se un fluoroforo (donatore) ha uno spettro di emissione che si sovrappone significativamente con lo spettro di assorbimento di un secondo fluoroforo (accettore) e se i due sono fisicamente molto vicini tra loro, l'energia dal donatore può essere trasferita all'accettore in modo non radiativo, cioè senza emissione di fotoni dal donatore. Quando ciò avviene, la fluorescenza del donatore diminuisce mentre quella dell'accettore aumenta. Con tecniche di imaging digitale è possibile quantificare il rapporto tra l'intensità della fluorescenza del donatore e quella dell'accettore e quindi determinare l'efficienza della FRET che è proporzionale all'inverso della sesta potenza della distanza tra i due fluorofori. Le misure con FRET permettono di misurare la distanza tra le biomolecole ed è quindi un metodo efficace per studiare l'interazione proteina-proteina (39). <<<