RICERCA ITALIANA     

Generazione e caratterizzazione di nuovi sistemi di cellule staminali neurali

Università degli Studi di Milano

Abstract

Negli ultimi anni la ricerca ha profuso crescenti sforzi verso la possibilita' di sostituire le cellule ormai perdute nel corso di processi neurodegenerativi con delle cellule "nuove" in grado di ripristinare le funzioni compromesse. La scoperta delle Cellule Staminali Neurali ha senza dubbio costituito uno degli elementi trainanti di questo scenario. Le strategie che prevedono l'impiego di cellule staminali si basano (1) sulla possibilità di stimolare elementi cellulari presenti nei tessuti, affinchè si riproducano, migrino e differenzino in modo appropriato, oppure (2) sulla preparazione e
ottimizzazione di cellule staminali in laboratorio per poi trapiantarle nel tessuto danneggiato. In questo secondo caso si potrebbero utilizzare (2a) cellule staminali adulte oppure (2b) cellule staminali embrionali.
Allo stato attuale della ricerca, ed in virtu' della conoscenza limitata della biologia delle cellule staminali, nessuna di queste strategie presenta garanzie di successo assoluto e di futura efficacia clinica. E' pertanto di estrema importanza caratterizzare in vivo ed in vitro le proprieta' di tali cellule e gli aspetti molecolari in grado di influenzarne gli eventi di sopravvivenza/espansione/differenziamento.
Una delle Unita' di Ricerca di questo network ha recentemente messo a punto dei nuovi sistemi di linee di cellule staminali neurali (denominate "Cellule NS") che presentano caratteristiche innovative. Tali cellule, diversamente dalle neurosfere, vengono cresciute su monostrato e mostrano caratteristiche di stabilita' proliferativa e capacita' differenziative sorprendenti. Possiedono inoltre caratteristiche di uniformita' di comportamento in protocolli di differenziamento in vitro superiori rispetto ai sistemi basati sulle neurosfere attualmente disponibili.
Questo progetto di ricerca (durata 2 anni, 4 unità di ricerca coinvolte) e' focalizzato quindi allo studio di nuovi sistemi di CSN. In modo specifico, l''obiettivo di questo progetto di ricerca e' quello di utilizzare il nuovo sistema messo a disposizione da uno dei proponenti per accrescere le conoscenze sulla biologia delle CSN e di svilupparlo ulteriormente ottimizzandone le caratteristiche per future applicazioni terapeutiche. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Luciano CONTI Università degli Studi di MILANO

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il presente progetto di ricerca si propone di raccogliere le competenze scientifiche e tecniche di quattro Unita' di Ricerca (UR) e fonderle in un progetto che ne esalta la complementarieta' finalizzata alla creazione e all'ottimizzazione di modelli di cellule staminali neurali che si possano affiancare ai relativamente pochi modelli attualmente disponibili agli sperimentatori e agli operatori clinici.
Verranno considerati quattro approcci multidisciplinari: a) biologia cellulare dell'espansione e del differenziamento delle cellule staminali, b) tecnologie trapiantologiche, c) analisi e regolazione della migrazione neuronale e d) analisi delle proprieta' biofisiche delle popolazioni neuronali in vitro ed in vivo.
Il progetto si propone di aumentare le conoscenze relative alle caratteristiche biologiche di base delle cellule staminali neurali portando all'ottimizzazione dei processi di crescita/espansione e differenziamento neuronale finalizzate all'ottenimento di colture di neuroni definite dal punto di vista antigenico e funzionale.
In particolare, nell'ambito di questa proposta di ricerca, il network di ricerca si propone di ottenere i seguenti obiettivi:
1. definizione delle potenzialità in vitro delle cellule NS (caratterizzazione neurochimica, e neuroendocrina e farmacologica) che porta alla loro completa maturazione neuronale.
2. analisi delle proprieta' elettrofisiologiche delle cellule NS e dei loro derivati neuronali a diversi stadi di maturazione in vitro. I risultati di questa analisi saranno di aiuto alle ricerche che dovranno essere compiute durante lo sviluppo del progetto nel suo insieme al fine di ottimizzare i protocolli per ottenere la piena maturazione dei neuroni derivati dalle cellule NS. Sara' effettuata anche la caratterizzazione delle proprietà di eccitabilità delle cellule NS trapiantate nel cervello adulto per chiarire se esse possano efficacemente differenziare in neuroni in vivo.
3. analisi e caratterizzazione del ruolo esercitato da diversi fattori noti essere coinvolti nell'embriogenesi o nei processi infiammatori (fattori di crescita, citochine, ormoni) sull'attività migratoria di precursori neuronali.
4. analisi della capacita' di integrazione e differenziamento area-specifica delle cellule NS trapiantate nel cervello murino embrionale ed adulto. In seguito verranno anche contemplati esperimenti di trapianto in modelli animali di neurodegenerazione e/o lesione.
5. generazione di nuove linee cellulari da nuove fonti di potenziale interesse terapeutico: cervello adulto, midollo spinale, mesencefalo. Quale potenziale fonte, verranno eventualmente considerate anche cellule umane ES (linea hES4 acquistata da ESI srl, Australia; questa linea è stata generata prima del 2001 ed è inclusa nel registro NIH delle cellule umane ES sulle quali è consentito lavorare e ricevere fondi pubblici).Tali linee saranno caratterizzate per i parametri descritti ai punti precedenti ed in modo da effettuare un confronto diretto tra le potenzialita' delle diverse linee.
6. identificazione di molecole in grado di ottimizzare il controllo sulla proliferazione delle NS e sulla loro capacità differenziativa, nonchè capaci di realizzare l'espansione in vitro di progenitori del primitivo neuroectoderma Sox1 positivi (progenitori diretti delle cellule NS).
Le diverse UR si integreranno vicendevolmente dal momento che ciascuna si occuperà di caratterizzare aspetti singoli, ma correlati, del progetto e forniranno un supporto tecnico ed un approccio metodologico necessario al lavoro di ricerca delle altre Unità. Inoltre, lo sviluppo di diversi modelli sperimentali, linee cellulari e protocolli ottimizzati per l'espansione ed il differenziamento neuronale in vitro ed in vitro, potranno fornire importanti strumenti sia per il progetto in atto che per ricerche future. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La tecnologia delle cellule staminali è particolarmente importante per il sistema nervoso centrale dato che il trapianto di queste cellule potrebbe aiutare a superare la bassa capacità intriseca del tessuto nervoso di rimpiazzare gli elementi persi in seguito a traumi o malattie.
E' stato recentemente dimostrato che popolazioni di cellule staminali neurali (NSC) sono presenti anche in regioni ristrette dell'encefalo adulto dei mammiferi (zona subventricolare ed ippocampo) e che esse forniscono una riserva di neuroni che possano sostituire quelli persi durante il fisiologico turn-over cellulare ed a seguito di danno cerebrale. Di fatto, patologie neurodegenerative come la malattia diAlzheimer, di Parkinson e la corea di Huntington sono caratterizzate da una continua perdita di neuroni che non vengono sostituiti. Si potrebbe quindi ipotizzare che un deficit primario del pool di riserva di NSC (in termini di proliferazione, differenziamento, migrazione) possa contribuire alla progressiva neurodegenerazione presente in tali malattie. La dimostrazione sperimentale di tale ipotesi potrebbe migliorare le conoscenze sulla patogenesi di queste patologie ed avere profonde implicazioni per un eventuale approccio terapeutico.
Nei primi anni novanta fu fornita la prima dimostrazione dell'esistenza di cellule, nel sistema nervoso embrionale ed adulto, che potevano essere isolate e cresciute in vitro e che avevano caratteristiche di cellule staminali neurali (Reynolds &Weiss, 1992).
La possibilità di crescere queste cellule illimitatamente e di istruirle con i fattori necessari per la loro completa maturazione in accordo con il tipo di lesione cerebrale da curare, ha sostenuto e sostiene tuttora le speranze di scienziati e pazienti.
D'altro canto l'utilizzo terapeutico delle NSC per le malattie neurologiche è ancora un obiettivo lontano. Infatti, la loro integrazione nel tessuto cerebrale è difficile poichè la loro natura di cellule multipotenti appare specifica per singole regioni encefaliche o a causa di una scorretta interpretazione dei limitati segnali neurogenici presenti nel cervello adulto.
Per raggiungere tale ambizioso obiettivo, l'interesse della ricerca di base deve quindi necessariamente orientarsi verso lo studio delle proprietà in vitro di tali cellule. E' quindi importante condurre studi per identificare i meccanismi alla base sia del controllo della proliferazione che della piena maturazione neuronale (antigenica, neurochimica ed elettrofisiologia) delle NSC e della loro capacità di migrare ed integrarsi correttamente nella regione appropriata una volta riattivate endogenamente o trapiantate. Tali proprieta' biologiche fondamentali delle NSC, ancora poco conosciute sia allo sperimentatore che al clinico, rappresentano i presupposti per una piena trasposizione della tecnologia in campo terapeutico.
Al fine di poter raggiungere tali obiettivi, e' tuttavia necessario superare alcune limitazioni che la ricerca attuale sta incontrando. In particolare:
(i) il punto debole dell'attività di ricerca basata sull'utilizzo delle NSC è la mancanza di procedure efficienti e validate per il loro isolamento. In assenza di tali protocolli, molti autori isolano cellule dal cervello embrionale o adulto, sfruttando la capacità di crescita di tali cellule, in vitro, sottoforma di neurosfere.
(ii) le neurosfere rappresentano aggregati di cellule proliferanti che crescono in sospensione e che contengono al loro interno cellule a diversi stadi di maturazione, (dalla presunta cellula staminale, ai progenitori, fino ai neuroni ed alla glia, sia immaturi e maturi) e che sono capaci di differenziare producendo sia glia che neuroni, anche dopo parecchi passaggi. Questo determina una eterogeneità intrinseca della composizione che, come indicato precedentemente, viene propagata nei diversi passaggi. Inoltre, le neurosfere hanno anche lo svantaggio derivante dal fatto che la propagazione in vitro attraverso vari passaggi puo' causare cambiamenti delle proprietà biologiche delle cellule (Morshead, 2002).
(iii) conseguentemente, le attuali procedure di coltura non permettono di ottenere cellule staminali neurali con proprietà biologiche uniformi. Data la natura mista della coltura, il loro trapianto o lo studio del profilo di espressione genica potrebbe dare origine a risultati che possono essere ricondotti alla presenza di un grande numero di cellule mature e di progenitori immaturi nella stessa coltura.
In questi anni, le neurosfere si sono dimostrate essere un utile sistema di valutazione del numero di progenitori neurali staminali, tuttavia hanno mostrato i loro limiti per studi trapiantologici e di espressione genica (Rossi & Cattaneo, 2002). Anche se la loro scoperta risale a circa un decennio fa, si puo' quindi a ragione indicare come siano ancora poco chiari gli eventi che regolano le proprieta' biologiche, la propagazione ed il differenziamento delle CSN, rendendo quindi ancora lontana la possibilita' di sviluppare terapie sostitutive basate sulle cellule staminali o sulla stimolazione delle cellule staminali endogene rappresenta ancora un obiettivo assai lontano.
Nell'ambito di questo progetto, un primo importante obiettivo è costituito dallo sviluppo di sistemi di cellule staminali alternativi che si possano affiancare alle neurosfere e che permettano di superare le limitazioni legate alla loro eterogenita'. Questo aiuterà a far luce sulle proprietà biologiche delle CSN ed in particolare a sviluppare strategie di espansione in vitro per l'ottenimento di colture più omogenee rispetto a quelle attualmente disponibili, di modo da sviluppare in futuro metodi innovativi ed affidabili per identificare ed isolare le CSN.
Una fonte di cellule staminali neurali alternativa al tessuto nervoso è rappresentata dalle cellule staminali embrionali (cellule ES) ottenibili dalla blastocisti e dalle quali si e' dimostrato essere possibile derivare qualsiasi tipo di cellula fetale o adulta (Smith, 2001). I benefici sperimentali delle cellule ES risiedono nella loro propagazione in vitro che si e' dimostrata essere altamente omogenea e stabile nel tempo. Tuttavia, un problema tutt'ora irrisolto che ne limita l'utilizzo in approcci trapiantologici terapeutici è causato dal fatto che le cellule cerebrali che se ne derivano possano condurre a formazioni tumorali causate dal persistere di cellule ES nelle colture differenziate. Al riguardo, recentemente sono state individuate strategie sperimentali finalizzate a superare tale inconveniente. Una delle piu' promettenti si basa sulla "selezione della discendenza" (lineage selection). Tale strategia trova fondamento nell'utilizzo di cellule ES ingegnerizzate geneticamente in modo da inserire un gene reporter che fornisce autofluorescenza (ad es. la eGFP, enhanced Green Fluorescent Protein) e/o in grado di fornire la resistenza ad un antibiotico, la cui espressione e' sotto il controllo di un promotore cellulo-specifico. Particolarmente efficiente si e' dimostrato l'uso del promotore del gene Sox1 (esso rappresenta un marcatore precoce espresso dalle cellule neuroepiteliali ed assente nelle cellule staminali embrionali o nelle altre tipologie cellulari). L'utilizzo della strategia di selezione della discendenza basata sull'espressione del gene eGFP guidata dal promotore di Sox1, si e' dimostrato particolarmente efficace quando associato a processi di induzione neurale che prevedono l'esposizione delle cellule ES a fattori di crescita esogeni (Ying, 2003). Tale strategia ha permesso di seguire i processi di induzione neurale in vitro nel tempo e di isolare popolazioni cellulari fluorescenti positive per Sox1 mediante ‘cell sorting'.

In tale scenario, la generazione di popolazioni cellulari di CSN multipotenti propagabili stabilmente nel tempo offre molti vantaggi rispetto all'utilizzo di popolazioni transienti che si dimostrerebbero paragonabili alle colture primarie anche se con caratteristiche di omogeneita' superiore:
- Le linee cellulari generate avrebbero proprieta' omogenee e ciò permetterà di generare strategie utili per isolare quantità di materiali necessari per analisi biochimiche.
- L'utilità di strategie sperimentali applicate alle cellule staminali embrionali permetteranno studi di screenig genetico e farmacologico e lo sviluppo di modelli di malattie neurodegenerative.
- l'omogeneità di tali cellule potrà fornire una fonte cellulare ottimale per approcci terapeutici.


Recentemente, questa UR, alla ricerca di un sistema di cellule staminali neurali innovativo e complementare a quello classico delle neurosfere, ha ottimizzato un nuovo sistema per generare ed espandere colture pure di cellule staminali neurali (denominate "cellule NS") da cervello fetale e da cellule staminali embrionali (Conti, sottomesso; vedi Figure 1-2-3).
Le caratteristiche innovative di tale sistema sono rappresentate da:
- ESPANSIONE OMOGENEA tramite DIVISIONE SIMMETRICA
- crescita in adesione su MONOSTRATO che permette, al contrario di quanto accade con le neurosfere, di poter seguire il comportamento (antigenico, morfologico e di interazione con le cellule circostanti) in vitro di singole cellule
- MANTENIMENTO DEL POTENZIALE NEUROGENICO dopo prolungate espansioni in vitro
- sopravvivenza, integrazione e differenziamento neuronale dopo trapianto sia in cervello embrionale che adulto
- NESSUNA FORMAZIONE DI TUMORI
- espressione di marcatori fenotipici che identificano la popolazione come GLIA RADIALE NEUROGENICA (in accordo con le ultime evidenze che essa rappresenti nel cervello adulto ed embrionale il pool di precursori multipotenti)

Negli ultimi anni, le cellule di glia radiale, precursori embrionali noti per il loro ruolo guida della migrazione neuronale, hanno assunto sempre piu' importanza nel panorama della neurobiologia dello sviluppo. Esse originano durante la neurogenesi da cellule neuroepiteliali esprimenti Sox1 che formano il piatto neurale e di seguito il tubo neurale. Recenti studi sembrano dimostrare che le cellule della glia radiale, svolgono il ruolo di cellule progenitrici di molti neuroni piramidali corticali. La glia radiale sembra quindi modulare la produzione e la migrazione neuronale, e quindi l'architettura della corteccia cerebrale. Ulteriori studi ‘in vivo' ed ‘in vitro' hanno proposto che, durante lo sviluppo embrionale, le cellule di glia radiale possano fungere più in generale da precursori di molte popolazioni neuronali (Alvarez-Buylla, 2001; Gotz, 2003).
E' stato dimostrato che una porzione delle neurosfere è formata da glia radiale (Hartfuss, 2001) ed alcuni autori avanzano l'ipotesi che esse possano rappresentare la frazione di cellule staminali neurali presente nelle neurosfere (Gregg, 2003).
In accordo con queste evidenze, si e' riusciti a generare linee di cellule NS anche da colture di neurosfere murine fetali sia primarie che espanse in vitro per lungo tempo.
Le caratteristiche innovative delle cellule NS fanno si che esse possano fungere da complemento al classico sistema delle neurosfere e a tutti gli effetti rappresentare una nuova e valida fonte tessuto-specifica, da confrontare con ES pluripotenti, per studiare le proprietà fondamentali e le potenzialità biomediche delle CSN.

Legends to the attached Figures
Figure 1. Generation of neural stem (NS) cells from ES cells. A. The adherent NS cell culture (LC1) propagated in EGF and FGF-2 (a) shows no expression of neuronal (b) or astrocyte (c) antigens and uniform expression of the precursor marker RC2 (d) and nestin (not shown). LC1 cells differentiate into immunopositive astrocytes (e) on addition of serum and generate neurons (f-h) on growth factor withdrawal. The proportion of neurons obtained remains >35% of total cells after 115 passages (i). B, Clonal NS cells were generated through Sox1 neural lineage selection. a and c, Phase image of neural precursors at passage 1 and 5 respectively. b and d corresponding Sox1-GFP fluorescence. e, Single cell 1 hour after plating in Terasaki well. f, Phase contrast image of clonal cell line at passage 20. C, RT-PCR for ES cell and neural stem cell/radial glia cell markers (46C, parent ES line; P5, 5 passages after neural differentiation; NS-5 clonal NS line; LC1, NS population (passage 17); brain, E12.5/E16.5 mouse brain). D, NS-5 differentiation into astrocytes (a,b) and neurons (d,e) with loss of nestin immunoreactivity (c, f). E, NS-5 immunoreactivity for neural precursor cell/radial glia markers. F, Clones of NS-5 cells exhibit homogenous expression of BLBP with no immunoreactivity for GFAP in the presence of EGF/FGF (a), and generate neurons on growth factor withdrawal (b). G, Metaphase spread of NS-5 (passage 31).

Figure 2. NS cells can be derived from various ES cell line and foetal forebrain. NS cells were derived from independent ES cell lines (CGR8, E14Tg2a) or primary cortical (Cor-1) and striatal (Str-1) tissue. A, RT-PCR of stem cell/radial glia markers. B, RT-PCR for transcriptional regulators. C, The ES-derived line (CGR8-NS) and foetal-derived line (Cor-1) are indistinguishable from LC1 by morphology (a, f) and neural stem cell/radial glial marker immunoreactivity (b, c, g, h), and can each differentiate into neurons (d, i) and astrocytes (e, j).

Figure 3. ES cell derived NS cells migrate and differentiate after transplantation in foetal rat brain. a, Confocal image of NS cells, lenti-virally transduced with eGFP, one week after transplantation into the ventricle of E14.5 rats. Donor cells migrate from the ventricle into the parenchyma in clusters and as single cells. Grafted cells show co-localization (yellow) of eGFP (green) and; b, the neuronal marker MAP2 (red); c, astroglia marker GFAP (red) or; d, progenitor cell marker, nestin (red). e, Quantitative analysis of graft-derived neuronal (NeuN and TuJ-1), astroglial (GFAP), progenitor (Nestin), and proliferating (Ki67) cells, one week after transplantation. Data are means (± standard deviation) of at least 500 eGFP+ cells from five independent animals.

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