RICERCA ITALIANA     

La rete di Interazioni fra proteine coniugate a Nedd8 o mono-ubiquitina ed i loro recettori

Università degli Studi di Roma "Tor Vergata"

Abstract

Le modificazioni covalenti di proteine, attraverso la coniugazione di un peptide di 76 ammino-acidi, la ubiquitina, comprendono sia l'aggiunta di polimeri che di singole unità ( mono-ubiquitinazione). La mono-ubiquitinazione avviene sia in risposta a stimoli interni che extra-cellulari e regola numerose funzioni. Per esempio, questa modificazione sembra regolare l'endocitosi ed il trasporto di molte proteine di membrana.
Nedd8 è, nella numerosa famiglia, la proteina più simile all'ubiquitina ed anche i loro sistemi di coniugazione ai substrati conservano una forte omologia. Nello stesso tempo, le due molecole differiscono per sette residui esposti e per la distribuzione superficiale di carica. Queste differenze suggeriscono la possibilità che Nedd8 sia utilizzato in interazioni specifiche.
Lo scopo di questo progetto è di contribuire alla descrizione della rete di interazioni proteiche basata su substrati modificati da mono-ubiquitina e/o Nedd8 ed i loro recettori.
Proponiamo di concentrarsi sulla rete di interazioni basate sulla mono-ubiquitina per definirne il repertorio di interazioni fisiche. Inoltre, proponiamo di studiare le interazioni e funzioni promiscue tra Nedd8 e mono-Ub e le specificità di Nedd8.
Il nostro progetto è studiato per selezionare nuovi domini capaci di legare Nedd8 e/o mono-Ub coniugati, isolare e caratterizzare i substrati della neddilazione ed ubiquitinazione indotta da EGF e definire il contributo specifico di Nedd8. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Luisa CASTAGNOLI Università degli Studi di ROMA "Tor Vergata"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Le interazioni fra proteine presiedono la fisiologia cellulare e molti ricercatori credono che una descrizione esaustiva e quantitativa della rete di interazioni proteiche potrebbe permettere di prevedere la risposta cellulare ad ogni definito stimolo. La completa descrizione delle possibili interazioni proteiche è particolarmente difficile in quanto una rete estremamente complessa di interazioni fisiche e funzionali è responsabile della espressione del genotipo costituente una cellula superiore, nel relativo fenotipo. E' quindi essenziale dividere il problema di determinare l'intreccio di interazioni proteiche possibili, in livelli intermedi di soluzione. Recentemente, il riconoscimento della natura modulare delle proteine ha permesso di affrontare il problema smontando la proteina nei diversi domini che la compongono ed utilizzando il singolo dominio proteico per studiarne le interazioni. Infatti, famiglie di moduli proteici conservati, capaci di legare specificatamente peptidi corti in forma estesa, sono i mediatori della maggior parte delle interazioni cellulari non-covalenti.

Il nostro obiettivo è di contribuire alla descrizione della rete di interazioni fra proteine modificate per aggiunta di NEDD8 o mono-ubiquitina ed i loro domini recettori. Proponiamo di concentrarsi sulle interazioni basate sulla mono-ubiquitina per poterne completare la descrizione. Inoltre, abbiamo disegnato esperimenti che possono essere estesi allo studio del contributo di NEDD8 sia in termini di promiscuità con le funzioni della mono-ubiquitina, sia in termini di specificità di funzione.

Nedd8 è il componente più simile alla ubiquitina (57% di identità) ed utilizza un sistema di coniugazione simile e parallelo a quello dell'ubiquitina. Questo alto livello di similarità potrebbe essere richiesto da funzioni ed interazioni condivise. Nello stesso tempo, sette residui sono chiaramente conservati in tutti i Nedd8 e sono invece diversi e non conservati nella ubiquitina. Inoltre, una notevole differenza fra Nedd8 ed ubiquitina è nella distribuzione della carica di superficie, dove Nedd8 presenta una regione positiva nel mezzo della zona acidica. Queste differenze suggeriscono la potenzialità per interazioni specifiche. Bisogna poi aggiungere che Nedd8 non è mai stato purificato come catena multipla ( al massimo dimero) e questo lo identifica come una modificazione simile alla mono-ubiquitina e quindi, presumibilmente, coinvolto in endocitosi e desensitizzazione.
Noi proponiamo esperimenti che possano distinguere il contributo dei due modificatori, con un particolare interesse funzionale verso la endocitosi del recettore dell'EGF.

La strategia sperimentale che è stata sviluppata ed ampiamente utilizzata nel nostro gruppo, si basa sulla selezione di vasti repertori di peptidi, selezionando per affinità per una esca proteica. Parte del gruppo è attualmente impegnato a caratterizzare le reti di interazioni mediate da domini proteici umani che riconoscono peptidi di poli-proline (SH3, WW, EVH, GYF) oppure peptidi fosforilati in serine, tronine o tirosine (14-3-3, FHA, Brct, WD40, SH2, PTB…).
Questo progetto porterebbe un forte contributo alla comprensione delle interazioni fisiche fra domini proteici e motivi modificati, in risposta ad EGF, con coniugazione di Nedd8 o mono-ubiquitina (VHS, UIM, UEV….)

Una volta completata la descrizione e caratterizzazione di tutti i recettori/ligandi e delle loro connessioni, sarà possibile dedicare studi ad alta risoluzione per convalidare le ipotesi e testare la rete funzionale. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Gli stimoli esterni ed i segnali che vengono percepiti dalle cellule eucariote, sono successivamente propagati all'interno della cellula attraverso interazioni proteiche con una forte gerarchia spaziale e temporale. La maggior parte di queste interazioni dipende da domini proteici che riconoscono specificatamente sequenze peptidiche corte o lipidi. Lo studio della propagazione intracellulare dei segnali è attualmente arrivato a descrivere minuziosamente gli eventi biochimici iniziali, l'attivazione delle chinasi dei recettori, i segnali dovuti a fosforilazioni di serine, treonine e tirosine, la partecipazione di adattatori che riconoscono questi segnali e partecipano addensando proteine nel punto richiesto. Al contrario, i fenomeni che spengono il segnale: endocitosi, down regulation e degradazione, sono meno definiti. I recettori attivati in membrana vengono catturati in vescicole circondate di clatrina oppure in caveole ed il loro destino consiste o nell'essere riciclati e quindi riposizionati in membrana, oppure nell'essere accompagnati fino alla degradazione in lisosomi o nel proteasoma. Molte interazioni proteiche preposte allo smistamento del traffico di proteine intracellulari sono costitutive. Alcune rispondono invece a particolari stimoli ed inducono delle modificazioni post-traduzionali di estremo interesse, in quanto danno origine a nuove interazioni proteiche. La finale localizzazione lisosomiale di proteine provenienti dalla membrana cellulare, richiede l'intervento di un particolare tipo di modificazione post-traduzionale, la mono-ubiquitinazione. Le proteine così modificate vengono riconosciute da recettori specifici attraverso l'intervento sinergico ed ordinato di numerose proteine modulari. I moduli proteici presenti in questi controllori specializzati del traffico cellulare sono; di tipo generale, per il riconoscimento di corti peptidi specifici (SH3, WW, coiled-coil, EH, VHS), per il riconoscimento di lipidi (ENTH, FYVE) e, spesso, sono presenti domini di ubiquitinazione o degradazione (UIM, UBA, HECT, RING).Questi ultimi sono presenti anche in proteine che controllano il passaggio dal Golgi al lisosoma.

- La rete di interazioni proteiche legate alla mono-ubiquitinazione-
Le modificazioni covalenti di proteine attraverso l'aggiunta di una molecola di 76 amminoacidi, chiamata ubiquitina, comprendono sia l'aggiunta di catene di ubiquitina ( poli-ubiquitinazione) sia l'addizione di un solo monomero ( mono-ubiquitinazione). La poli-ubiquitinazione è il meccanismo utilizzato per marcare una proteina, che viene avviata alla degradazione proteasomica. La mono-ubiquitinazione ha, invece, un risultato sorprendentemente differente in quanto risponde a segnali extra od intra-cellulari, creando nuovi motivi di interazione fra proteine e permettendo quindi la regolazione del trasporto ordinato di peptidi sia nella endocitosi, che nella biosintesi e nella maturazione virale. Molti domini presenti in proteine coinvolte nella endocitosi e nel traffico intracellulare (ad esempio VHS, UIM, UEV) sono in grado di legare l'ubiquitina quando questa è coniugata ad un polipeptide. La mono-ubiquitinazione regola la internalizzazione di recettori legati a G-protein , RTK, canali ionici, trasportatori e permeasi e la loro successiva localizzazione nei multi vescicular bodies ( MBV).
La endocitosi mediata da ubiquitina risulta essere la via principale per lo spegnimento del segnale del recettore per il fattore di crescita epidermico (EGFR). Due studi recenti dimostrano che la fusione di ubiquitina al EGFR causa la sua internalizzazione costitutiva ed un aumento nella degradazione della proteina chimerica (1,2). Nonostante la mono-ubiquitinazione è sufficiente per indurre l'endocitosi di RTK, molti vengono mono-ubiquitinati in numerosi siti differenti, potenzialmente modificando la dinamica del processo endocitotico, aumentando la avidità del sistema per un singolo interattore, oppure, mettendo a disposizione differenti siti di interazione per numerosi ligandi.
Volendo descrivere un modello semplice, le proteine di mebrana, coniugate a monomeri di ubiquitina, vengono riconosciute da adattatori ( tipo Eps15) che, riconoscendo ubiquitina e, contemporaneamente, clatrina, dirigono le proteine di membrana nelle vescicole di clatrina. Il ruolo della mono-ubiquitinazione non si esaurisce nel primo livello della endocitosi, bensì rimane essenziale affinchè la proteina, passando da un trasportatore all'altro viaggi nelle vescicole endosomiali fino a che queste, invaginandosi, formino i corpi multivescicolari da cui alcune proteine possono essere recuperate ed altre avviate alla degradazione lisosomiale. A questo stadio, il complesso proteico ESCRT-1 ( endosomal sorting complex required for transport) è responsabile del riconoscimento di proteine ubiquitinate. La rimozione delle ubiquitine risulta essenziale per la terminale localizzazione in MVB. Un enzima de-ubiquitinante ( in S. cerevisiae DUB Doa4p) rimuove l'ubiquitina, permettendo la internalizzazione delle proteine nelle vescicole che si formano per endoflessione verso l'interno della membrana endosomiale delimitante MVB. Le molecole di ubiquitina così recuperate vanno a reintegrare il pool cellulare (3). Anche altri domini proteici ( UBA o CUE) sono capaci di riconoscere e legare mono e poli-ubiquitine coniugate, ma sono prevalentemente descritti in proteine coinvolte nel controllo del ciclo cellulare, degradazione proteica e riparo del DNA (4).

- Domini proteici che riconoscono ubiquitina coniugata-
Il dominio VHS: presente in VPS27, Hrs e STAM.
Il dominio VHS è lungo circa 140 residui. La risoluzione di due strutture di VHS ( Hrs di Drosophila e TOM umana) ha consentito di descrivere la struttura come derivante da otto eliche arrangiate in una superelica a doppio strato. E' interessante notare che i domini VHS e ENTH hanno una struttura terziaria simile pur avendo sequenze primarie e funzioni differenti. Alcuni autori hanno anche suggerito una lontana omologia strutturale fra VHS ed ENTH e la porzione N-terminale della atassina3, chiamata Josephin domain, la cui funzione è di riconoscere ubiquitina coniugata e deubiquitinare (5). Il dominio ENTH occupa la regione N-terminale di proteine legate all'endocitosi e lega lipidi. Il dominio VHS è, anche, all'ammino terminale ed è considerato avere un ruolo nel traffico cellulare.
VHS è presente in 15 proteine nel proteoma umano:
- Proteine GGA (Golgi-localized, gamma ear-containing, ARF-binding protein) e TOM (Target of myb-like 1 protein). Queste mostrano una composizione modulare del tipo VHS_GAT-GAE (GAT: GGA and TOM; GAE: gamma-adaptin ear homology) (6)
- Proteine STAM(signal transducing adaptor molecule) STAM/EAST/Hbp (Hrs binding protein). Queste proteine hanno in comune una anatomia modulare del tipo : VHS-UIM-SH3-ITAM e presentano uno o due motivi che interagiscono con l'ubiquitina (UIM).
- Hgs (hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase .substrate). Proteine che presentano sempre un dominio FYVE C-terminale rispetto a VHS. Portano anche uno o due UIM, spesso nell'ordine VHS-FYVE-UIM.
Nonostante il dominio VHS delle proteine GGA sia chiaramente implicato nel passaggio trans Golgi/ endosomi tardivi, la funzione di altri VHS presenti in altre proteine rimane ancora non chiarita. I domini VHS delle GGA riconoscono una zona acidica adiacente al segnale a dileucine (DxxLL) presente nei recettori associati a TGN. Gli altri VHS sono privi dei residui presenti nelle eliche 6 ed 8 che risultano essere critici per questa interazione ed, infatti, non riconoscono il segnale a dileucina. Mizuno et al. Hanno dimostrato che le proteine STAM legano proteine ubiquitinate, utilizzando i loro UIM e VHS. Yamakami et al. Hanno dimostrato che TOM1 lega proteine ubiquitinate attraverso i propri VHS e GAT(7,8).

Il motivo proteico UIM
Il motivo proteico che interagisce con l'ubiquitina è stato descritto inizialmente nella subunità PSD4/RPN-10 del proteasoma. UIM è descritto in molte proteine, in copie multiple. Lega una zona idrofobica comune a mono- e poli-ubiquitine, con una costante di dissociazione nell'alto micromolare. Le proteine contenenti UIM sono coinvolte nell'endocitosi ed includono Hrs, Stam, Eps15, VPS27 di S.cerevisiae, ataxin-3, proteina coinvolta, se mutata, nell'evoluzione del Machado-Joseph disease.

Il dominio UBC
Sono state descritte numerosi enzimi che coniugano la ubiquitina, E2 ( oltre 30 nel proteoma umano), che vengono raggruppati in quattro classi. Contengono tutti un core catalitico ( il dominio UBC) che contiene la cisteina del sito attivo. Alcuni hanno estensioni al N- od al C-terminale. Le ligasi E2 legano covalentemente l'ubiquitina e si associano con gli enzimi E3, ubiquitin-ligasi. La interazione substrato-E3-E2 promuove la ubiquitinazione del substrato stesso.

Il dominio UEV, ( ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant domain).
Questo dominio presenta una struttura del tipo E2 ma è privo di attività catalitica. Gli UEV sono quindi omologhi a UBC ma non hanno la cisteina attiva, richiesta per una corretta attività catalitica. Il dominio UEV al N-terminale della proteina Vps23 (presente nel ESCRT-I di S.cerevisiae) è essenziale per orientare le proteine ubiquitinate nelle vescicole interne del MVB. Confrontando le strutture del dominio UEV della Vps23 di lievito, coniugato ad ubiquitina, con la struttura del UEV umano di Tsg101, in assenza di ubiquitina, sono identificabili due anse conservate che sembrano avvicinarsi per formare una specie di pinza che cattura l'ubiquitina. I contatti che l'ubiquitina impegna con UEV comprendono due zone adiacenti sulla superficie dell'ubiquitina: una contiene residui idrofobici (Ile-8, Ile-44 e Val-70) mentre la secondacontiene residui idrofilici (Asn-60, Gln-62, Glu-64). La superficie idrofobica dell'ubiquitina che lega il dominio UEV di Vps23 coincide con la zona riconosciuta dal motivo UIM di Vps27 e dal dominio VHS. Questo suggerirebbe un modello di legami sequenziali da parte di recettori situati in una gerarchia temporanea e/o spaziale. Al contrario, la zona idrofilica è riconosciuta solo dal UEV delle proteine del ESCRT-I.

- EGFR dalla membrana al lisosoma-
la stimolazione con fattori di crescita epidermico induce l'attivazione del EGFR, autofosforilazione e successivo legame di Cbl ed altre proteine necessarie alla propagazione del segnale. Cbl viene fosforilata dal recettore e, a sua volta, ubiquitina il recettore in siti multipli. La multiubiquitinazione del EGFR potrebbe essere interpretata o come un meccanismo per aumentare l'avidità oppure, se eseguita con una gerarchia temporale, un mezzo per creare multipli specifici siti di legame per adattatori diversi ad intervento sequenziale. I recettori ubiquitinati sono raccoltiin vescicole rivestite di clatrina attraverso l'intervento di adattatori , come Eps15 ed Epsina. La GTPasi dinamina è responsabile del distacco della vescicola. Successivamente, la clatrina viene persa e l'accumulo di enzimi idrolitici causa un abbassamento del pH all'interno della vescicola. Il passaggio del EGFR da endosomi precoci a tardivi è sempre dipendente dal continuo legame con la ubiquitin-ligase Cbl e dalla ubiquitinazione del recettore. Il trasporto nel MVB è regolato dal riconoscimento di proteine ubiquitinate da parte di proteine specializzate come Hrs, Tgs101 ed altri componenti del ESCRT-I. L'invaginazione della membrana esterna del MBV forma delle vescicole interne contenenti EGFR. Questo processo è legato, in lievito, all'attività deubiquitinante di Doa4 ed alla dissociazione del complesso ESCRT dall'endosoma, operata dalla AAA Atpasi Vps4. La fusione del MVB e dei lisosomi porta alla degradazione delle proteine trasportate (9).

- Nedd8, una proteina della famiglia dell'ubiquitinina: funzioni simili o differenti?-
La ubiquitina monomerica ed i domini che legano ubiquitina sono quindi implicati nella endocitosi ed il ruolo che hanno potrebbe facilmente essere confrontato con l'importante ruolo giocato nella trasduzione del segnale, dalla fosforilazione delle tirosine e dai domini capaci di legare tirosine fosforilate. E' molto interessante considerare la potenzialità di una modificazione così ingombrante stericamente. L'ubiquitina, una volta coniugata a recettori fosforilati, viene riconosciuta da adattatori contenenti diversi specifici domini che, riconoscendo la molecola grazie alla coniugazione con la ubiquitina, regolano la sua endocitosi fino alla consegna al lisosoma. Nell'uomo, EnsEMBL mostra un gene contenente l' InterPro domain IPR000626 (Ubiquitin) in ogni cromosoma umano. Questi numerosi polipeptidi simili ma distinti dall'ubiquitina sono enzimaticamente coniugati a substrati proteici e partecipano a diversi processi biologici, come il riparo del DNA, autofagia e trasduzione del segnale.
La coniugazione di SUMO a substrati proteici cambia la localizzazione di questi e le interazioni fisiche con altre proteine. Il primo substrato identificato di SUMO è stata la proteina RanGAP1 (che è coinvolta nel passaggio di proteine dal citoplasma al nucleo). RanGAP1 deve essere sumolata per essere localizzata nei pori nucleari. La addizione di SUMO è importante anche per la localizzazione nucleare di altre proteine

Nedd8 (Neural Precursor Cell Expressed,Developmentally Downregulated 8) ha una identità del 60% con l'ubiquitina. La proteasi NEDP1, Nedd8-specifica, è responsabile della maturazione del precursore di Nedd8 e della deconiugazione della stessa dai suoi substrati, p53 e culline, per esempio. La differenza di un singolo residuo situato al carbossi-terminale di Nedd8 ed ubiquitina, è responsabile della specificità di NEDP1 (10). Studi biochimici dimostrano inoltre che la Ala-72 di Nedd8 ( Arg-72 nella ubiquitina) è invece essenziale per il riconoscimentoda parte degli enzimi E1. Questa specificità di interazione impedisce a Nedd8 o alla ubiquitina di essere utilizzati nei pathway appartenenti all'altra proteina (11).
Le culline sono state le prime proteine caratterizzate dalla modificazione da parte di Nedd8. le culline sono una subunità comune ad un folto gruppo di E3 ubiquitin ligasi: le SCF(Skp1/cullin-1/F-box) e le CBC (cullin-2/elongin BC)(12). La proteina Roc1, contenente un dominio RING, è la ligasi responsabile della neddilazione delle culline. Roc1 agisce interagendo con Ubc12 ( la E2 specifica). La modificazione operata dalla coniugazione di Nedd8 alle culline causa un aumento del legame fra la E3 neddilata (SCF) e la E2 per l'ubiquitina, Ubc4. L'aumentata formazione di complessi E2-E3 stimola fortemente la poli-ubiquitinazione di proteine substrati. Recentemente,p53 è stato identificatocome substrato della neddilazione operata da parte della E3 ligasi MDM2 che , quindi si dimostra essere in comune fra ubiquitina e Nedd8 (13).
Nedd8 ed ubiquitina hanno il 60% di identità ed una forte omologia è mantenuta nei sistemi di coniugazione. Probabilmente, queste proprietà conservate sono state mantenute per l'interazione con substrati comuni. D'altra parte, sette residui sono chiaramente conservati in tutti i Nedd8 ma non nelle ubiquitine, suggerendo la possibilità di legami specifici. Nedd8, inoltre, non è mai stato purificato come catene multiple ed è quindi da considerarsi alternativa funzionale alla mono-ubiquitina. Noi proponiamo alcuni esperimenti per distinguere i contributi di nedd8 ed ubiquitina, con un particolare interesse per il loro coinvolgimento nella endocitosi di recettore del EGF. <<<