RICERCA ITALIANA     

Biofisica molecolare di canale del potassio di organismi primitivi e loro ruolo nella fisiologia della cellula.

Università degli Studi di Milano

Abstract

In questo progetto proponiamo lo studio di canali del potassio di due forme di vita primitive, il cianobatterio Synechocystis e il virus PBCV-1 (Phycodnaviridae), un virus molto antico che infetta l'alga verde unicellulare Chlorella. Le teorie evoluzionistiche più recenti identificano Synechocystis come il progenitore del cloroplasto delle cellule vegetali e i virus di Chlorella come gli elementi che hanno maggiormente contribuito alla comparsa del nucleo negli eucarioti primitivi.
Il progetto metterà in luce i punti di contatto fra fisiologia cellulare e biofisica molecolare dei canali del potassio. Quali siano le basi moleclari del gating e come il gating influenzi la funzione dei canali in processi fisiologici e patologici rilevanti quali la fotosintesi e l'infezione virale dell'ospite è il punto specificamente affrontato da questa ricerca.
L'estrema semplicità dei sistemi nativi in cui questi canali operano ci consentirà di estrapolare le funzioni dei canali del potassio al cloroplasto delle piante superiori e al processo d'infezione virale di organismi superiori di interesse più generale. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Anna MORONI Università degli Studi di MILANO

Obiettivo del Programma di Ricerca

In questo progetto ci proponiamo di mettere in luce i punti di contatto fra la biofisica molecolare dei canali del potassio e la fisiologia delle cellule in cui essi operano. Più in dettaglio il nostro progetto analizzerà le basi molecolari del gating (il meccansimo di apertura/chiusura ) dei canali del potassio e come esso influenzi i processi fisiologici delle cellule che li esprimono, in particolare la fotosintesi di un cianobatterio e gli stadi iniziali dell'infezione virale di un alga unicellulare. I sistemi da noi scelti, estremamente semplici, costituiranno una fonte di informazione su aspetti evoluzionistici di struttura e funzione dei canali del potassio di organismi superiori.

Unit I (Moroni) lavorerà sul canale virale Kcv, il primo canale del K+ isolato dal genoma di un virus, PBCV-1 (Paramecium bursaria chlorella virus 1). PBCV-1 è il prototipo di una famiglia di virus molto antichi (Phycodnaviridae) che infettano le alghe verdi unicellulari di tipo Chlorella (Plugge et al, 2000). Due aspetti sono particolarmente a favore dell'uso del canale virale Kcv come sistema modello:
-Il primo aspetto è che Kcv è un canale del K+ in miniatura. E' costituito da 94 ammino acidi ed è formato solo dal modulo del poro. Il modulo del poro è presente in tutti i canali del K+ in quanto forma il pathway di permeazione degli ioni ed è la sede dei meccanismi di gating, il passaggio dallo stato chiuso allo stato aperto dei canali. I canali degli eucarioti, oltre al modulo del poro, presentano in genere lunghi domini citosolici N e C terminali e domini trasmembrana aggiuntivi che comprendono il sensore del voltaggio. Kcv si esprime in tutti i sistemi eterologhi in cui è stato provato e forma un canale del K+ con selettività e gating. L'apertura dei canali del K+ coinvolge diverse strutture all'interno del poro. La principale è il "bundle crossing" formato dall'incrocio delle eliche interne (TM2) dal lato citoplasmatico (Doyle et al., 1998). Altre strutture coinvolte nel gating sono: il "filtro di selettività" (sul lato extracellulare) (Proks et al., 2000) e la "slide helix", una corta alfa-elica posizionata orizzontalemente all'interfaccia citosol-membrana (Moroni et al., 2002, Kuo et al., 2003). Il loro contributo al processo di gating è però difficile da evidenziare in quanto manipolazioni del canale che eliminino il bundle crossing (delezioni, mutazioni) spesso producono canali non funzionanti. Nel caso di Kcv, sia la caratterizzazione biofisica che il modello per omologia (Figura 1) indicano l'assenza del bundle crossing.

Kcv è un modello per lo studio del gating a livello del filtro di selettività e della slide helix in quanto il canale, pur non avendo bundle crossing, mostra interessanti proprietà di gating. Lo studio di Kcv contribuirà a chiarire la dinamica dei movimenti intramolecolari che portano all'apertura del poro e che riguardano anche canali più complessi come quelli degli organismi superiori.


L'altro aspetto che è a favore dell'uso di Kcv come modello sperimentale è che l'attività del canale è necessaria per il processo d'infezione virale. In presenza dei bloccanti del canale ( bario, cesio e amantadina) il virus PBCV-1 non riesce ad infettare il suo ospite chlorella (Plugge et al, 2000; Kang et al, 2004). Questa ed altre evidenze, riportate nel modello B, indicano che il canale Kcv svolga un ruolo primario nel processo d'infezione virale. L'interesse per questo risultato è legato al fatto che canali ionici (strutturalmente e funzionalmente diversi da Kcv) sono stati trovati in altri virus, fra cui due di grande interesse medico, il virus dell'influenza (orthomyxoviridae) e il virus dell'immunodeficienza umana HIV-1 ( Retroviridae) (Gonzales and Carrasco, 2003; Fischer and Sansom, 2002). Solo nel caso del canale M2 del virus dell'influenza A si è, ad oggi, riusciti a definire un ruolo nell'infezione. L'amantadina, l'unico farmaco anti-influenzale in commercio, è un bloccante del canale M2 (ed agisce anche su Kcv). Progressi in questo campo sono di estremo interesse applicativo, data la straordinaria potenzialità di sviluppare farmaci anti-virali.


Unit II (Szabò)
L'Unità II studierà SynK, un canale putativo del K+ identificato nel proteoma del cianobatterio Synechocystis e paragonerà le sue proprietà strutturali e funzionali con quelle dei canali del K+ dei cloroplasti delle piante. Solo recentemente le tecniche elettrofisiologiche sono state applicate con successo allo studio delle membrane dei cloroplasti, rivelando la presenza di molti canali ionici. Fra questi, i canali del K+ sembra che giochino un ruolo fondamentale durante la fase luminosa della fotosintesi. Il trasporto del K+ permetterebbe infatti di controbilanciare elettricamente il trasporto dei protoni (H+) dallo stroma al lumen, permettendo l'acidificazione dei tilacoidi e la contemporanea alcalinizzazione dello stroma. Lo studio del ruolo fisiologico dei canali del K+ nel cloroplasto può essere affrontato in via preliminare nel più semplice sistema modello costituito dai cianobatteri, che sono considerati i progenitori del moderno cloroplasto delle piante superiori (Archibald and Keeling, 2002).
L'uso di Synechocystis offre numerosi vantaggi: un genoma completamente sequenziato, organismi knock out per geni specifici, e un sistema fotosintetico molto simile a quello degli organismi più evoluti. La nostra ipotesi è che, in analogia con i fotosistemi, anche i canali del K+ di S. siano molto simili a quelli dei cloroplasti delle piante superiori. Studieremo pertanto SynK. sia misurandone l'attività sulle membrane native sia studiandone l'espressione in sistemi eterologhi per poterne poi confrontare le proprietà con quelle dei canali del cloroplasto. Questo canale che è già stato clonato ed espresso dall'Unità II è interessante anche da un punto di vista strutturale. E' un canale 6TM che mostra una forte voltaggio-dipendenza nel meccanismo di apertura (gating) nonostante la struttura anomala del "sensore del voltaggio", il sensore del voltaggio S4. In genere gli S4 presentano diverse cariche positive (almeno 4) e in genere la loro neutralizzazione determina forti alterazioni nella voltaggio-dipendenza dei canali (Heginbotham et al, 1994). In SynK invece, se ne trovano solo due. Questo dato unito ad altre anomalie relative ad un canale trovato nelle piante (AKT3, Marten et al, 1999) che nonostante abbia molte cariche sull'S4 non si comporta in modo voltaggio-dipendente, ci inducono a riconsiderare il ruolo di queste cariche, almeno nel caso del canale SynK e, per estrapolazione, nel canale vegetale AKT3.



Aspetti collaborativi
Le due Unità applicano tecniche complementari che possono essere facilmente condivise fra i gruppi. L'Unità II (Szabò) dispone del sistema Chlamydomonas che servirà all'Unità I (Moroni). Chlamydomonas è il sistema modello in Ficologia, si trasforma facilmente e vi sono a disposizione moltissimi mutanti, fra cui uno che non avendo la parete cellulare, rende più semplice l'indagine elettrofisiologica mediante patch clamp. Chlamydomonas verrà utilizzata in sostituzione di Chlorella per gli studi di sovraespressione di Kcv (vedi Fase II del progetto). L'Unità II (Szabò), viceversa, sfrutterà il knowhow del partner milanese per quanto riguarda l'espressione di proteine ricombinanti in procarioti (E.coli) ed eucarioti (Pichia pastoris). La proteina SynK ricombinante cosi prodotta potrà essere purificata e studiata in bilayer planare. Tale tecnica è già stata messa a punto dall'Unità I per la proteina ricombinante Kcv (Pagliuca et al., submitted). Inoltre può essere di utilità anche per la produzione di anticorpi, da utilizzare per immunolocalizzazione (già ottenuti per Kcv). Inoltre, Szabò utilizzerà il sistema di espressione in oociti di Xenopus di Moroni per esprimere SynK, in quanto questo sistema è molto più adatto per un screening rapido usando numerosissime possibili inibitori di SynK rispetto al sistema di espressione in CHO. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

L'elettricità è un elemento fondamentale in biologia. Ogni volta che soluti quali composti del fosfato, ammino acidi o ioni inorganici vengono trasportati attraverso la membrana, il movimento delle loro cariche genera una corrente elettrica che produce una differenza di potenziale a cavallo della membrana. La differenza di potenziale elettrico trasmembrana costituisce un intermedio nell'immagazzinamento dell'energia e nella sintesi dell'ATP in tutte le cellule viventi. Se da un lato i trasporti attivi e le pompe instaurano e mantengono i gradienti a cavallo della membrana, l'apertura dei canali ionici selettivi dissipa questi gradienti in trasporti passivi verso l'equilibrio elettrochimico e produce rapidi cambiamenti nel potenziale. I canali ionici sono gli elementi fondamentali nella membrana delle cellule eccitabili, neuroni e cellule muscolari. In queste cellule, i canali ionici generano segnali elettrici stereotipati, i potenziali d'azione, che determinano processi vitali quali la trasmissione nervosa e il battito cardiaco (Hille, 2001). I canali ionici (soprattutto K+, Na+, ma anche Ca++ e Cl-) rappresentano negli animali la fonte pù grande di potenziali nuovi target per i farmaci, essendo implicati nella patogenesi di un gran numero di malattie (canalopatie) (Ashcroft, 2000).
Nelle piante i canali ionici più rilevanti sono i canali del K+. Il trasporto del K+ è implicato in processi cellulari di base quali la regolazione del volume cellulare, la crescita per distensione e l'assorbimento di nutrienti. Oltre che nelle cellule eucariote, i canali del K+ sono presenti nei batteri e negli archea dove la loro funzione è legata alla regolazione osmotica. Geni per i canali del K+ sono infine stati identificati anche nel genoma di diversi virus che infettano le piante (Kang etal, 2004; Chang et al., 2004). Nel caso di uno di essi, PBCV-1, si sa che il canale del K+ viene trascritto dalla cellula ospite ed è implicato nel processo infettivo (Plugge et al., 2000; Kang et al., 2004; Chen et al., 2005).
Tutti i canali del K+ conosciuti sono membri di una sola superfamiglia di proteine. Si tratta di proteine tetrameriche (omo- ed etero-tetrameri) , in cui ciascuna delle quattro subunità contribuisce a formare il poro centrale. La subunità che forma i canali del K+ voltaggio – dipendenti (Kv) ha sei domini trasmembrana (TM) (S1-S6) di cui il quarto (S4) costituisce il sensore del voltaggio. La subunità dei canali del K+ ligando-dipendenti (Kir) è formata in genere da due soli TM (M1 ed M2) e da due lunghi segmenti N e C terminali citosolici che legano piccole molecole regolatorie (per es. Ca++, cAMP) o proteine citosoliche.
Le tecniche che in passato hanno avuto il maggiore impatto in questo campo sono state la biologia molecolare e il patch clamp. Ultimamente la cristallografia a raggi X e la scoperta di equivalenti batterici dei canali del K+ hanno avuto l'impatto maggiore nell'area di ricerca sui canali ionici. Di particolare impatto sono state le strutture cristallografiche dei canali del K+ batterici prodotte dal laboratorio di Rod MacKinnon (Rockefeller U. ) a partire dal 1998 (Doyle et al, 1998; Jiang et al., 2000; Jiang et al, 2002; Jiang et al, 2003; Kuo et al, 2003). Il suo lavoro ha contribuito enormemmente a descrivere i meccanismi di selettività e gating, due funzioni chiave, oggetto di intensa caratterizzazione ma delle quali mancava una comprensione a livello atomico. Uno dei grandi meriti di questo lavoro (riconosciuto con il premio Nobel a Mac Kinnon nel 2003) è stato quello di riuscire a cristallizzare queste difficili proteine di membrana (le proteine di membrana, in quanto immerse nei bilayer lipidici, sono difficili da purificare e ancor più da cristallizzare). Determinante inoltre è stata la scelta di utilizzare proteine batteriche, non solo più facili da produrre in quantità sufficienti, ma anche strutturalmente più semplici di quelle eucariote.
La cristallografia a raggi X è estremamente utile nel dare una struttura statica del canale catturato in uno stato preciso (ad esempio aperto o chiuso), ma non può essere altrettanto potente nel definire la natura di transizioni intermedie assunte dai canali durante il processo di gating in risposta a variazioni del voltaggio o al legame dei ligandi. Uno dei problemi irrisolti è come venga trasmesso al poro il movimento dei sensori del voltaggio o dei ligandi e come dinamicamente si determini, all'interno del poro, il cambiamento conformazionale che porta all'apertura del canale. I meccanismi di regolazione, pur rimanendo unici per ovvie ragioni per ogni singolo canale, dovranno inevitabilmente avere un tratto comune di trasmissione al poro. Il poro non può che essere l'elemento finale di controllo del filtro di selettività e quindi del passaggio degli ioni. In generale si ritiene che segnali di controllo quali voltaggio e piccole molecole citosoliche, esercitino il loro effetto utilizzando un meccanismo comune di controllo sul filtro.

Infine va ricordato che l'integrazione della biofisica dei canali ionici con la comprensione della fisiologia cellulare è stata , in molti casi, molto trascurata. L'approccio di biofisica molecolare che ha dominato il panorama scientifico degli anni 90, è avvenuto spesso a spese dell'approccio fisiologico. Anche in questo campo vi è ancora molto da fare, soprattutto nel mettere in relazione proteine di canali con specifiche correnti di membrana. Uno dei buchi più evidenti in questo campo è il legame fra le funzioni dei canali e dei mutanti (naturale o ingenierizzati) e il comportamento dell'organismo. I sistemi più promettenti sono ovviamenti quelli basati su organismi più semplici. come i nostri due sistemi, Synechocystis (cianobatterio) e i canali del virus con ospite unicellulare. Essi costituiscono sicuramente una buona scelta anche sotto questo punto di vista, in quanto i loro canali del K+ sembrano essere coinvolti in funzioni fisiologiche/patologiche fondamentali quali la fotosintesi e l'infezione virale.
Il nostro approccio è basato sulle seguenti considerazioni:

-secondo la teoria evolutiva endosimbiontica, il cloroplasto delle piante superiori si è evoluto da un procariote che fa fotosintesi ossigenica, in particolare Synechocystis (Archibald and Keeling, 2002; Palmer, 2000; Turner et al, 1999). Noi intendiamo studiare un canale del K+ a sei domini trasmembrana (6TM) di questo organismo fotoeterotrofo allo scopo di caratterizzare il ruolo del canale nei processi fotosintetici dell'organismo. E' evidente che ogni fattore che è coinvolto nella regolazione della fotosintesi di questo antenato primordiale potrebbe essere utile per la comprensione del processo fotosintetico del cloroplasto delle piante superiori. Abbiamo identificato un gene in Synechocystis che codifica per un putativi canale di K+ e che mostra aspetti strutturali interessanti. SynK, che è già stato clonato ed espresso nel laboratorio di Padova, sembra un canale voltaggio-dipendente con una struttura potenziale tipo Shaker. Ha sei potenziali domini trasmembrana fra cui l'S4, il sensore del voltaggio, che porta un numero inferiore al normale di cariche positive (due invece che quattro). SynK potrebbe essere dunque un modello adatto per studiare quali altri fattori, oltre alle cariche del sensore del voltaggio, siano implicati nella risposta al voltaggio. Inoltre, esperimenti preliminari indicherebbero un possibile coinvolgimento di SynK nel processo fotosintetico di Synechocystis.

- Kcv è il primo canale del K+ trovato nel genoma di un virus. E' stato identificato in PBCV-1, il prototipo di una famiglia di virus (Phycodnaviridae) che infettano le alghe verdi unicellulari di tipo Chlorella. Kcv è lungo solo 94 aa ed è il più piccolo canale del K+ funzionante conosciuto. L'analisi filogenetica suggerisce che Kcv sia probabilmente il più antico canale del K+ , preesistente ai canali procariotici ed eucariotici. Questo risultato sorprendente, trattandosi di una proteina virale, si trova però in accordo con la teoria dell'eucariogenesi virale, secondo la quale il nucleo della cellula eucariotica si è evoluto da un virus a DNA a doppia elica (dsDNA) (Bell, 2001; Mindell and Villareall, 2003). Vi sono buone evidenze fornite dall'analisi filogenetica e da studi di evoluzione molecolare che i virus dsDNA della famiglia Phycodnaviridae abbiano contribuito in modo sostanziale all'origine del genoma eucariotico (Villareal e DeFilippis, 2000). La posizione di base di molti geni virali nell'albero della vita ha rafforzato l'ipotesi che molte caratteristiche del nucleo eucariotico o addirittura l'intero nucleo si sia evoluto da virus a DNA del tipo Phycodnaviridae. Possiamo pertanto considerare plausibile l'ipotesi che i canali virali siano i predecessori dei canali del K+ degli eucarioti. Anche da un punto di vista strutturale Kcv appare un canale primitivo. Il canale infatti è costituito solo dal modulo del poro, una struttura conservata in tutti i canali del K+, ma non presenta i domini regolatori citosolici nè i domini aggiuntivi di membrana che comprendono il sensore del voltaggio. Si può ipotizzare che i canali eucariotici si sarebbero evoluti da una struttura di base tipo-Kcv, per aggiunta di domini regolatori esterni al poro.
L'interesse per Kcv è basato anche sull'evidenza che questo canale sia importante per il processo d'infezione virale (Plugge et al, 2000; Kang et al., 2004). Geni che codificano per canali ionici sono stati trovati nei genomi di alcuni altri virus, inclusi due virus di grande inetresse medico, il virus dell'influenza A, B e C e il virus dell'immunodeficienza umana di tipo I (HIV-1) (Fisher and Samson, 2002). Il ruolo fisiologico dei canali virali in questi sistemi è sconosciuto, tranne che per il canale M2 del virus dell'influenza A: M2 è un canale per i protoni e l'entrata dei protoni nel virione genera la fusione della membrana endosomale con quella del virus (Martin et al., 1991; Ciampor et al., 1995).


Base di partenza scientifica nazionale

Le due Unità che propongono questo progetto, condividono un comune interesse nell'evoluzione dei canali del K+. L'Unità I (Moroni) ha identificato Kcv, il primo canale del K+ trovato nei virus (Plugge et al, 2000). In seguito ha esteso l'analisi ad altri 40 virus della stessa specie, confemando la presenza di canali Kcv-like in tutti i genomi analizzati (Kang et al, 2004). Tale risultato, unito al fatto che tutti i canali identificati sono risultati essere funzionanti, rafforza l'ipotesi che la presenza di un canale del K+ sia necessaria a questi virus, probabilmente per completare il ciclo infettivo. Recentemente, il sequenziamento del genoma di un secondo membro della famiglia dei Phycodnaviridae, MT325, ha messo in luce anche in questo virus la presenza di un gene di un canale del K+ ). L' Unità I ha caratterizzato le proprietà di questa proteina mediante espressione eterologa in oociti (Gazzarrini et al., in preparation).
L'Unità II (Szabò) da lungo tempo si occupa di canali del K+ in linfociti /szabò et al., 1996) e anche in organelli cellulari quali mitocondri (Szabò and Zoratti, 1991; Szabò et al., 1998; Szabò et al., 2005)) e cloroplasti (Szabò et al., in preparation) la cui origine è intimamente connessa all'origine della cellula eucariotica. L'unità II ha anche studiato i canali ionci dei batteri (Szabò et al., 1992; Szabò et al., 2002; Szabò et al., in preparation). I canali del K+ dei mitocondri, in particolare quelli sensibili al Ca2+ e all'ATP, regolano processi cellulari importanti, ad esempio la morte cellulare programmata (Remillard and Yuan, 2004; szabò et al., submitted). I canali del K+ dei cloroplasti potrebbero risulatre ugualmente importanti nella regolazione della fotosintesi; inoltre, l'origine del cloroplasto è oggetto di intenso studio in relazione all'origine della cellula eucariotica.

Entrambe le Unità condividono inoltre un background di studi struttura-funzione su canali del K+ animali e attualmente stanno interfacciando questo campo con il campo delle piante e dei batteri, applicando approcci all'avanguardia di fisiologia molecolare e cellulare allo studio dei canali primitivi. Infine, un ulteriore aspetto importante di questo progetto è che riunisce gli unici due gruppi in Italia che si occupano di questa ricerca. Entrambi i gruppi sono guidati da donne, all'inizio della carriera accademica, attivamente impegnate nella ricerca e con un passato e un presente di forti collaborazioni internazionali. <<<