RICERCA ITALIANA     

Il "milieu" extracitoplasmatico: la prima linea di difesa nell'immunità innata delle piante

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

L'apoplasto è la prima linea di difesa contro gli organismi patogeni e gli erbivori. Le piante si basano, per la difesa, su un sistema definito di "immunità innata", i cui principali elementi sono i recettori PRR (recettori codificati dalla linea germinale). Questi interagiscono con elicitori rilasciati dai patogeni che possono essere pianta-genotipo specifici (fattori di avirulenza) o elicitori di tipo non-specifico (PAMP: pattern molecolari associati a patogeni). Molti PRR sono proteine con domini ricchi in leucina (LRR) extracitoplasmatici. L'attivazione del sistema immunitario innato da parte dei PRR innesca una risposta di difesa multicomponente che include alterazioni dell'omeostasi dell'apoplasto. Il cambiamento dello stato redox dell'apoplasto è una delle risposte più precoci. Cambiamenti nella composizione dell'apoplasto coinvolgono la secrezione di molte proteine e molecole correlate alla difesa e cambiamenti delle proteine della membrana plasmatica. Quindi, la regolazione dell'ambiente apoplastico nella difesa è strettamente legata al traffico delle vescicole che si originano dal Golgi e alla loro composizione.
In questo progetto, 5 unità di ricerca condivideranno le conoscenze avanzate e l'esperienza maturata in biochimica, proteomica, biologia molecolare, genetica molecolare, "imaging" in vivo, biologia strutturale e bioinformatica per studiare:
1) Il riconoscimento mediato da proteine con domini di interazione extracitoplasmatici. Saranno studiate le basi strutturali dell'interazione tra tre PAMP [poligalatturonasi (PG), flg22 (un peptide corrispondente al dominio conservato della flagellina batterica) e oligogalatturonidi (OG)] ed i loro recettori. Le PG, anch'esse annoverate tra i PAMP, sono riconosciute dalle PGIP, proteine LRR secrete che ne controllano l'attività enzimatica favorendo la formazione di OG. Flg22 interagisce con il recettore LRR transmembrana FSL2. La conoscenza delle basi delle interazioni stabilite da PIP e FLS2 verranno sfruttate per tentare l'identificazione del recettore per gli OG che è ancora sconosciuto. Saranno studiate le interazioni proteina-proteina coinvolte nel "folding" della PGIP, come prototipo di proteine LRR vegetali.
Saranno inoltre studiati presunti recettori ancora mai caratterizzati che presentano un dominio DOMON, a volte associato ad un citocromo b651 (proteine DOM e CY-DOM). I geni codificanti queste proteine sono fortemente indotti in risposta agli OG, flg22 e dall'infezione da parte di Botrytis cinerea. La percezione operata dai recettori DOM potrebbe essere trasdotta mediante cambiamenti redox transmembrana plasmatica. Saranno determinate la localizzazione e le caratteristiche biochimiche di queste proteine e saranno ricercati possibili interattori apoplastici.
2) I meccanismi che regolano la composizione dell'ambiente apoplastico in risposta agli OG e flg22. Risposte indotte dagli OG si sovrappongono ampiamente, ma non sono identiche, alle risposte indotte da flg22 e Botrytis. Studieremo in vivo la secrezione in risposte a questi stress. Prepareremo proteine chimeriche fluorescenti utilizzabili come marcatori della secrezione per investigare se proteine e i polisaccaridi della parete cellulare sono secreti attraverso differenti vescicole che possono essere modulate differentemente durante la risposta di difesa. Si intende chiarire il ruolo delle sintaxine SYP121 e SYP122, di SNAP33 e di Rab11 nella secrezione di macromolecole correlate con la difesa. Verrà chiarito il ruolo dell'apparato di secrezione nel trasporto di poliammine all'apoplasto e degli enzimi catabolici delle poliammine nella difesa. Studi su una lipoossigenasi permetteranno di capire se esista nelle piante una via "non classica" di secrezione simile a quella che svolge un ruolo importante nell'immunità innata animale. In ultimo, piante transgeniche alterate nella secrezione saranno analizzare per la resistenza ai patogeni. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Giulia DE LORENZO Università degli Studi di ROMA "La Sapienza"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il nostro obiettivo primario è di chiarire quegli eventi complessi che avvengono nell'apoplasto e che determinano la capacità di una pianta di resistere ai patogeni. L'apoplasto è la prima linea di difesa contro patogeni ed erbivori e possiede un sistema di sorveglianza sofisticato per rilevare l'attacco di un patogeno. Il sistema è a sua volta connesso con le vie di segnalazione citoplasmatiche che portano all'attivazione di risposte multivalenti di difesa. Il sistema di difesa comprende alterazioni dell'omeostasi apoplastica laddove variazioni dello stato redox e delle proteine secrete e di membrana sono fondamentali. I meccanismi messi in moto compongono quel sistema definito di "immunità innata" che protegge le piante da funghi, batteri e virus. Il riconoscimento di (macro)molecole comuni a diversi patogeni (pathogen-associated molecular patterns=PAMPs) da parte di specifici recettori della pianta è l'evento chiave del sistema. Recettori chinasici con domini extracellulari formati da moduli ricchi in leucina (LRR) e specializzati nelle interazioni proteina-proteina sono alla base del riconoscimento dei PAMPs.
Di questi recettori non c'è alcuna informazione riguardante la base strutturale della loro funzione di riconoscimento. Inoltre, se da una parte la segnalazione e le risposte di difesa interne alla cellula sono oggetto di intensi studi, poche sono le informazioni riguardanti gli eventi apoplastici a livello molecolare e la loro rilevanza per la difesa. il chiarimento di questi aspetti è fondamentale per capire il meccanismo della risposta di immunità innata e per lo sviluppo di approcci biotecnologici per migliorare la resistenza alle malattie. Il nostro obiettivo a lungo termine è quello di migliorare la protezione delle piante agrarie migliorandone l'espressione delle difese endogene sia costitutive che indotte.
Due dei problemi più interessanti della biologia dell' immunità innata delle piante vengono affrontati in questo progetto: 1) la base strutturale del riconoscimento pianta-patogeno, 2) la natura e il ruolo della risposta di resistenza, antica dal punto di vista evolutivo, che è associata alle vescicole e permette il trasporto di "cargo" regolatori e la secrezione di "cargo" tossici.
Per superare gli svariati problemi concettuali e metodologici che ostacolano i progressi in questo campo, cinque unità di ricerca, che hanno sviluppato negli anni passati strumenti unici ed esperienza nello studio del milieu apoplastico e delle interazioni pianta-patogeno, si integreranno e complementeranno per raggiungere gli obiettivi specifici descritti nella proposta. Queste unità di ricerca hanno esperienza complementare in biochimica, proteomica, biologia e genetica molecolare, biologia strutturale e bioinformatica. Molti delle attività verranno sviluppate in collaborazione e compartecipazione di protocolli, strumenti, costrutti plasmidici e materiali biologici. Alcune metodologie avanzate come espressione eterologa in cellule eucariotiche, microscopia confocale, proteomica, risonanza plasmonica di superficie combinata alla spettrometria di massa per lo studio delle interazioni proteina-proteina, verranno messe in comune. Un altro obiettivo è lo sviluppo di nuovi strumenti e metodologia biologica (come LOPIT e ICAT) necessari per ulteriori progressi nel nostro campo di ricerca. Infine ma non ultimo obiettivo è il training nella ricerca avanzata dei numerosi giovani ricercatori che partecipano al progetto.
Il progetto risponde alle richieste di eccellenza indicate dal MIUR, perchè le unità di ricerca che vi partecipano sono riconosciute internazionalmente e pubblicano in giornali prestigiosi di Biologia e Biologia Vegetale. L'azione sinergica fra due UR (I e IV) della stessa Università risponde anche alla richiesta di incrementare l'eccellenza all'interno di una singola Università. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Questo programma viene riproposto dopo una revisione. Nella valutazione precedente era stato valutato positivamente ma non era stato finanziato per la limitazione dei fondi disponibili: la differenza nello scarto con l'ultimo progetto finanziato era molto bassa. I commenti dei revisori sono stati considerati e le osservazioni sono state accolte per migliorarlo. L'attenzione è adesso concentrata sull'immunità innata e sono stati inclusi (includendo una quinta UR) studi sulle basi strutturali del riconoscimento molecolare che è un evento cruciale in questo fenomeno. Gli approcci medodologici per affrontare lo studio del traffico delle macromolecole sono stati ampliati, e anche le competenze, data l'esperienza in biologia strutturale e bioinformatica della nuova UR. Questa competenza è stategica per l'attuazione del lavoro di frontiera previsto in questo progetto.
Verranno considerati due principali aspetti del ruolo del "milieu" apoplastico vegetale nell'immunità innata
A) Le interazioni proteina-proteina per il riconoscimento nel milieu apoplastico;
B) La regolazione dello stato e della composizione del milieu apoplastico in risposta a due PAMP: gli OG e flg22.

INTRODUZIONE
L'apoplasto, rappresentato principalmente dalla parete cellulare, ha funzioni strutturali, di regolazione della crescita e di comunicazione cellula-cellula (9,49). Essendo il compartimento cellulare che direttamente si affaccia sull'ambiente esterno, esso svolge un ruolo fondamentale nell'adattamento agli stress imposti dall'ambiente, inclusi gli attacchi da parte di (micro)organismi.
L'IMMUNITA' INNATA DELLE PIANTE. Per l'assenza di un sistema immunitario adattativo, le piante si basano per la difesa contro i patogeni su un sistema immunitario innato, analogo a quello identificato negli animali (22,42,1). Elementi principali di questo sistema sono recettori codificati dalla linea germinale (PRR); questi sono implicati nel riconoscimento di molecole prodotte dal patogeno e definite "elicitori". Questi ultimi possono essere pianta-genotipo specifici, come per esempio i fattori di avirulenza (Avr) che sono riconosciuti dai prodotti dei geni di resistenza della pianta (R) in un sistema razza-cultivar (16), od elicitori generici che attivano le risposte di difesa in molte specie vegetali. Gli elicitori generici sono indicati come pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP) ed includono la chitina fungina, gli oligogalatturonidi (OG) e la flagellina batterica (22, 42). Un peptide di 22 aminoacidi corrispondente ad un dominio conservato della flagellina (flg22) è un elicitore sia in Arabidopsis che in tabacco. Gli OG sono una interessante classe di PAMP (50). Essi sono rilasciati dall'omogalatturonano della parete cellulare ad opera delle poligalatturonasi (PG) secrete dai patogeni, che sono a loro volta considerate dei PAMP. L'accumulo di OG è favorito dall'interazione delle PG con specifici inibitori (PGIP: inibitori proteici delle PG), che sono localizzati nella parete cellulare (17, 18). Gli OG e flg22 sono l'oggetto del nostro studio.
I RECETTORI LRR MEDIANO IL RICONOSCIMENTO DEI PAMP. La maggior parte dei PRR implicati nel riconoscimento degli elicitori possiedono domini ricchi in leucina (LRR) (42), presenti anche in recettori vegetali implicati nella simbiosi batterica e fungina (34). In molti casi, i domini LRR sono extracellulari, implicandone una loro funzione nel riconoscimento nell'apoplasto. I domini LRR sono presenti anche nei recettori di Drosophila (Toll) e dei mammiferi (Toll-Like receptor) implicati nell'immunità innata (43), enfatizzandone un origine ancestrale.
Il sistema di percezione vegetale per i PAMP è esemplificato dal sistema di riconoscimento della flagellina da parte di FLS2, un recettore chinasico con un dominio extracellulare composto da 28 ripetizioni LRR ed un dominio intracellulare chinasico (22). La diretta interazione tra FLS2 e flg22 non è stata mai dimostrata. Nulla è noto sulla percezione e la trasduzione del segnale mediato dagli OG; in particolare il recettore degli OG deve essere ancora identificato. E' probabile che esso appartenga alla sottofamiglia LRR RLK, che comprende 235 membri (42). Noi studieremo le basi strutturali dell'interazione FLS2/flg22 e tenteremo di identificare il recettore degli OG.
L'ALTERAZIONE DELL'OMEOSTASI APOPLASTICA NELL'IMMUNITA' INNATA. L'attivazione del sistema immunitario innato attraverso i PRR innesca una risposta di difesa multi-componente, che include l'espressione di proteine associate alla patogenesi, peptidi antimicrobici, la sintesi di fitoalessine, e si associa a importanti cambiamenti dell'omeostasi apoplastica (24). L'alterazione dello stato redox rappresenta una risposta precoce (35). Molte proteine vengono secrete durante la risposta di difesa. I meccanismi di formazione dell'ambiente apoplastico svolgono quindi un importante ruolo durante i processi di difesa (13,53) e sono fortemente associati al traffico vescicolare ed alla composizione delle vescicole (46,53,26). Gli OG e flg22 sono potenti elicitori (50,22). Analisi trascrittomiche mostrano che in Arabidopsis molti geni codificanti per proteine secrete e di membrana plasmatica sono indotti dagli OG e da flg22, come anche geni implicati nella regolazione della secrezione (dati non pubblicati). Esiste una notevole sovrapposizione nell'espressione genica regolata da questi due elicitori. Più del 95% dei geni regolati dagli OG sono regolati in maniera simile da flg22 (sebbene geni addizionali siano regolati da flg22) e più della metà sono regolati in un maniera simile dall'infezione da parte del fungo necrotrofo Botrytis cinerea. Queste osservazioni suggeriscono un ruolo centrale giocato da questi elicitori nella difesa.
IL TRASPORTO DI MACROMOLECOLE ALL'APOPLASTO. Circa il 10% dei componenti di parete sono proteine e la restante parte è rappresentata fondamentalmente da polisaccaridi. La sintesi delle proteine di parete ha inizio nel reticolo endoplasmico (ER) e prosegue attraverso il complesso di Golgi prima della secrezione. La maturazione e la stabilizzazione della struttura delle proteine, così come le modificazioni post-traduzionali (es. glicosilazione) avvengono nel comparto ER/Golgi (25,27,60,61) e sono cruciali per l'espressione e la funzione delle proteine di parete. Il Golgi è anche il sito di sintesi dei polisaccaridi di matrice (pectine ed emicellulose) (49).
Il traffico vescicolare gioca un ruolo centrale nella sintesi e nel trasporto di prodotti diversi che formano il milieu apoplastico (32). Nelle cellule vegetali sono presenti rivestimenti proteici vescicolari simili a quelli trovati nelle cellule animali (46). Componenti noti del macchinario di trasporto delle cellule animali e dei lieviti come i rivestimenti COP, piccole proteine leganti GTP, denominate Arf, Rab/Ypt GTPasi, SNARE e proteine SM, sono presenti anche nelle cellule vegetali. (25, 46). Le proteine SNARE sono note per essere necessarie per l'esocitosi e ci sono evidenze che elementi dei complessi SNARE, come le sintassine Syp 121 (13,6) e Syp 122, giocano un ruolo importante nella risposta ai patogeni (46). Inoltre, in Arabidopsis, Syp 122 è rapidamente fosforilata in risposta a flg22 (41).
Diverse osservazioni suggeriscono differenze tra la via secretoria delle cellule animali e quella delle cellule vegetali (25, 24, 46). I meccanismi del traffico vescicolare nelle piante e molti aspetti della costruzione dello spazio apoplastico sono ancora sconosciuti. Per esempio, mentre ci sono prove della presenza di popolazioni funzionalmente distinte di vescicole vacuolari, poco si conosce sulla possibilità di una sub-compartimentalizzazione funzionale del complesso di Golgi e di diverse sub-popolazioni di vescicole derivate dal Golgi dirette al plasmalemma. Non è noto se polisaccaridi e proteine di parete e proteine integrali del plasmalemma viaggino con le stesse vescicole o in vescicole differenti né se un cargo con funzioni specifiche, come quello coinvolto nella risposta di difesa, viaggi con le stesse vescicole che portano il cargo fisiologico (25, 26).
Inoltre, sono state trovate nell'apoplasto o nel vacuolo proteine che mancano di una sequenza peptidica segnale per la secrezione riconoscibile (21), tra cui una lipossigenasi(pLOX3)di Phaseolus vulgaris (54), ed è stato ipotizzato uuna via di secrezione non classica. Negli animali numerose osservazioni indicano l'esistenza di tale via. Le galettine (29), HMGB1 (10) and the mediator of inflammation interleukin (IL)-1 beta (63) vengono secrete dai monociti mediante esocitosi di lisosomi secretori. Anche Hsp70 è probabilmente secreta attraverso questa via (8), che sembra svolgere una importante funzione nella risposta immunitaria innata degli animali.
Il meccanismo di trasporto nell'apoplasto di molecole diverse dai polisaccaridi e proteine, quali le poliammine è tuttora sconosciuto. Le poliammine sono composti policationici ubiquitari che svolgono importanti funzioni di modulazione in processi implicati nella crescita e nello sviluppo negli organismi animali e vegetali e nei microrganismi (12). Nelle piante sono svolgono un ruolo fondamentale nella divisione cellulare, differenziamento, embriogenesi, senescenza, risposte di difesa. E' stato inoltre ipotizzato che l'ossidazione delle poliammine nell'apoplasto, ad opera delle ammino ossidasi, concorra alla produzione di H2O2 necessario nella biogenesi della parete cellulare e per le risposte di difesa (2, 14, 62). Il trasporto delle poliammine nell'apoplasto può essere mediato da trasportatori di membrana e/o da traffico vescicolare. Nel lievito il rilascio delle poliammine è mediato dalla via di secrezione e quella endocitica (56). In cellule di mammifero le poliammine possono essere assunte mediante endocitosi e localizzate in vescicole (7,15, 55). Si studierà la secrezione nell'apoplasto di proteine di parete, pLOX3, polisaccaridi e poliammine.
LA PGIP, UNA PROTEINA LRR IMPLICATA NEL RICONOSCIMENTO E NELLA DIFESA
Tra le proteine presenti nella parete cellulare e indotte dai PAMP le PGIP prevengono la degradazione della parete cellulare da parte delle PG secrete dal patogeno e quindi rallentano il processo di invasione ed il rilascio di nutrienti necessari per la crescita del fungo (17, 18). Inoltre, il controllo dell'azione delle PG ad opera delle PGIP favorisce l'accumulo degli OG. La PGIP limita l'invasione fungina (20). Tutte le PGIP note sono glicoproteine con una massa morecolare di 40 kDa e con 10 moduli LRR. La PGIP è l'unica proteina LRR vegetale di cui è nota la struttura tridimensionale (19).
L'osservazione che la PGIP non è facilmente espressa in sistemi eterologhi, se non in pianta (17) suggerisce che l'avvolgimento e/o la stabilizzazione dei domini LRR extracellulari vegetali richiedano specifici meccanismi. Comunque, a tal riguardo, poco è ancora noto (45). L'endoplasmina, membro della famiglia delle proteine "heat shock 90" degli chaperoni molecolari nel ER (5), è importante per l'avvolgimento/stabilizzazione della proteina LRR CLAVATA (30). Inoltre elementi coinvolti nella maturazione delle proteine come hsp90, Stg1 e RAR1 sono richiesti per la funzionalità dei prodotti dei geni di resistenza citosolici del tipo NBS-LRR (38, 28, 37, 51).
L'endoplasmina sembra agire dopo la proteina di legame (BiP), il membro della classe hsp70 degli chaperoni (61), e solo su un gruppo di proteine di secrezione che sono presenti negli organismi multicellulari (5). L'induzione dell'espressione di BiP durante l'interazione pianta-patogeno è necessaria per la successiva sintesi delle proteine PR nell'RE (31). Verranno
studiate le basi strutturali dell'interazione differenziale tra le PGIP e le PG fungine; inoltre, caratterizzeremo le interazioni proteina-proteina nel ER/Golgi che sono correlate all'avvolgimento e alla maturazione della PGIP.
LA FUNZIONE DELLE PROTEINE DELLA SUPERFICIE CELLULARE NEL CONTROLLO DELLO STATO REDOX DELL'APOPLASTO
La regolazione dello stato redox dell'apoplasto è estremamente importante per la vita delle piante. In questo senso svolge un ruolo cruciale l'ascorbato (ASC)(44). Lo stato redox dell'ascorbato extracellulare dipende dall'attività dell'ascorbato ossidasi, ed è potenzialmente regolato da un citocromo transmembrana di tipo b, ubiquitario nelle membrane plasmatiche vegetali (PM-CB). Il citocromo PM-CB è ridotto dall'ASC sul lato citosolico della membrana ed è in grado di ridurre il mondeidroASC sul lato apoplastico. Si tratta di una proteina glicosilata che lega due emi ad elevato potenziale (57) e si distingue nettamente dai flavocitocromi responsabili dello scoppio ossidativo (NADPH-ossidasi)(33).
La natura dei geni che codificano per citocromi di tipo PM-CB non è nota con certezza. I citocromi b-561 denominati CYBASC (CYtochrome B, ASC dependent) che comprendono il cyt b-561 dei granuli cromaffini animali e il cyt b-561 del tonoplasto vegetale (23,47,58) costituiscono una particolare famiglia di citocromi b che catalizzano un trasporto elettronico transmembrana dall'ASC ad accettori elettronici idrofilici con il coinvolgimento esclusivo di due emi ( senza ulteriori centri redox). Nonostante la simile attività redox, la struttura dei citocromi PM-CB appare più complessa rispetto ai CYBASC (47,58). Tuttavia nel genoma di soia, arabidopsis e altre piante sono presenti diversi geni che codificano per proteine che comprendono un dominio di tipo cyt b-561 fuso assieme ad un dominio N-terminale extracellulare detto DOMON (proteine CY-DOM). Il DOMON è un dominio di interazione proteina-proteina (4). I CY-DOM vegetali sono omologhi ai citocromi SDR-2 di mammiferi e drosophila, di cui è stata dimostrata la localizzazione sulla membrana plasmatica e l'attività redox transmembrana (59). Nessuna proteina CY-DOM vegetale è stata finora studiata, se si esclude PM-CB che potrebbe tuttavia rivelarsi un membro di questa famiglia.
Oltre ai geni CY-DOM, le piante contengono anche una serie di geni che codificano per un singolo dominio DOMON (28 kDa) associato ad una singola alfa-elica transmembrana. In analogia con i CY-DOM, utilizzeremo per queste proteine l'acronimo di DOM. In arabidopsis, uno di questi geni è Air12 (40). Una proteina Air12 (identificata mediante sequenziamento) è stata riscontrata in stretta associazione con PM-CB in preparazioni altamente purificate da ipocotili eziolati di fagiolo. E' possibile che l'interazione tra le due proteine sia mediata dai corrispondenti domini DOMON. Analisi pubblicate di microarray dimostrano che in arabidopsis l'espressione di un gene CY-DOM (At5g35735) e quella di Air12 sono indotte in modo coordinato in diverse condizioni di stress, anche di origine biotica. Inoltre, entrambe i geni sono fortemente indotti da OG, flg22 e Botrytis. Un ruolo dei geni CY-DOM e DOM nella difesa nei confronti dei patogeni è quindi molto probabile.
Un altro importante sistema di regolazione dello stato redox dell'apoplasto è rappresentato dalle ammino ossidasi [ammino ossidasi a rame(CuAO) e poliammino ossidasi flaviniche (PAO)]. La produzione di H2O2 attraverso l'ossidazione delle poliammine è stata messa in relazione al "burst ossidativo" (2), alla morte cellulare programmata (39), ai processi di lignificazione, suberificazione e cross-linking catalizzati dalle perossidasi (39, 48) ed in risposta a ferite (48) e patogeni (3,11,36,48,62). Sono poche le informazioni sulle famiglie geniche CuAO. In Arabidopsis, due dei tre geni CuAO sono indotti da OG, flg22 e B. cinerea, incluso uno che codifica per una CuAO secreta (At1g62810)(dati non pubblicati). Si studieranno la regolazione e le caratteristiche biochimiche e strutturali di CY-DOM e DOM e della CuAO secreta. Sarà inoltre effettuata una strategia di RNA interferenza per studiare il ruolo della PAO nel milieu apoplastico. Inoltre si identificheranno possibili ligandi apoplastici del dominio DOMON. <<<