RICERCA ITALIANA     

INTERAZIONE TRA PROTEINE CITOPLASMATICHE E MEMBRANE: STUDIO DELLA LIPOSSIGENASI COME SISTEMA MODELLO IN VITRO E IN VIVO.

Università degli Studi di Roma "Tor Vergata"

Abstract

Le lipossigenasi sono importanti enzimi del matabolismo vegetale e animale. E' noto che nei mammiferi sono anche coinvolte in gravi patologie; tuttavia il loro ruolo specifico in quest'ambito non e' ancora stato del tutto chiarito. Alcune evidenze sperimentali, nel caso di malattie specifiche come il morbo di Huntington e l'AIDS, suggeriscono che la loro stessa interazione con le membrane lipidiche (loro substrato naturale) possa essere alla base dell'insorgere di queste disfunzioni. Tuttavia, non sono ancora note le conseguenze specifiche sulla struttura delle membrane dell'attivita' delle lipossigenasi. Inoltre, non e' chiaro se esista una ripartizione preferenziale delle lipossigenasi sulle diverse fasi e i differenti domini di membrana. Infine, per alcune lipossigenasi, e' stata riscontrata una notevole tendenza alla formazione di stati aggregati che potrebbero alterarne la funzionalita' in vivo.

L'obiettivo di questo progetto e' quello di dare una serie di risposte a questi interrogativi. In particolare, mediante l'uso di una proteina-modello, quale la lipossigenasi di soia (15-LOX-1), di un suo frammento (mini-LOX) e di altre forme derivate sostituendo il ferro con altri metalli, studieremo nel dettaglio il processo d'interazione delle lipossigenasi con le membrane, usando anche inibitori della sua attivita' enzimatica. Inoltre, tali studi potranno essere estesi alle rispettive proteine ricombinanti umane e di coniglio, delle quali saranno clonati i geni.

Per il successo del progetto saranno impiegate diverse tecniche spettroscopiche complementari che, analizzando il sistema lipossigenasi-membrana da prospettive diverse, permetteranno una risposta esauriente alle problematiche ancora aperte. In particolare la fluorescenza dinamica, il dicroismo circolare e la spettroscopia nell'infrarosso verranno utilizzate per studiare i cambiamenti conformazionali a livello della proteina e delle stesse membrane. Misure di spettroscopia a raggi x a basso angolo verranno invece impiegate per caratterizzare cambiamenti conformazionali a livello di singoli domini proteici, causati dal legame con singoli lipidi. La tecnica del light scattering dara' invece informazioni sui processi d'aggregazione e sulla loro cinetica. Infine, la microscopia di fluorescenza e di forza atomica forniranno una visualizzazione dell'eventuale interazione preferenziale delle lipossigenasi con domini raft e non-raft delle membrane. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Alessandro FINAZZI AGRO' Università degli Studi di ROMA "Tor Vergata"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Questo programma di ricerca ha come obiettivo la caratterizzazione strutturale e funzionale della lipossigenasi, nella sua interazione con substrati lipidici.

In condizioni normali, questa classe di enzimi ha un ruolo chiave nel metabolismo vegetale e animale. Tuttavia, nei mammiferi, le lipossigenasi sono coinvolte anche in gravi patologie che vanno dall'invecchiamento cerebrale, all'infezione da HIV, all'aterosclerosi. In alcune di queste malattie (AIDS e morbo di Huntington in particolare), il ruolo dell'enzima è stato individuato e circoscritto nell'ambito della sua interazione con le membrane lipidiche. Tuttavia il suo specifico meccanismo d'azione a livello molecolare non è ancora stato chiarito. Per esempio, non si sa se esistano interazioni preferenziali della lipossigenasi con particolari fasi e domini delle varie membrane e nemmeno quali cambiamenti specifici l'enzima induca a livello della struttura lipidica della membrana stessa. Un secondo problema riguarda il processo d'aggregazione al quale alcune lipossigenasi sono soggette e di come tale fenomeno possa essere correlato a loro disfunzioni.

Nella prima parte, questo progetto intende trovare delle possibili risposte a tali quesiti, studiando come avviene e come è modulata dall'aggregazione l'interazione tra le membrane e la lipossigenasi di soia, usata come proteina-modello. Inoltre, nella seconda parte, tale ricerca verrà estesa anche alle corrispondenti forme enzimatiche di mammifero disponibili, anche mediante la costruzione di forme ingegnerizzate. I risultati ottenuti potranno essere utilizzati per la progettazione di composti di rilevanza farmacologica, in grado di modulare lo stress ossidativo indotto dalla lipossigenasi.

Il progetto riguarderà tre set di campioni: i) la 15-lipossigenasi di soia (15-LOX-1), una delle quattro di cui si conosce la struttura cristallografica e comunemente usata quale modello del corrispondente enzima umano; ii) il frammento C-terminale della 15-LOX-1 (mini-LOX), la sua forma priva del ferro (apo-mini-LOX) e forme ricostituite con altri metalli; iii) il corrispondente enzima di mammifero: di coniglio (di cui si possiede pure la struttura cristallografica) e quello umano, assieme a loro frammenti e a forme mutanti.
Lo studio condotto in collaborazione tra le tre U.R. riguarderà: i) l'analisi delle variazioni conformazionali indotte sulle lipossigenasi dal legame con singoli lipidi; ii) la caratterizzazione dei processi di aggregazione della proteina (spontanei e/o indotti); iii) lo studio degli effetti indotti dalle lipossigenasi sulla struttura dei lipidi di membrane biologiche e della sua ripartizione tra microdomini raft e non-raft.

Per ottenere queste informazioni sono necessarie tecniche cellulari, biochimiche e spettroscopiche. Il personale delle U.R. di questo progetto possiede una vasta esperienza nello studio del rapporto struttura/funzione delle proteine e nella caratterizzazione strutturale delle membrane biologiche.
Lo studio dell'interazione lipossigenasi-lipidi sarà incentrato su sei tecniche di indagine principali e precisamente: i) spettroscopia di fluorescenza e dicroismo circolare (U.R. n.1); ii) spettroscopia nell'infrarosso (FTIR) e diffrazione di raggi x a basso angolo (SAXS, U.R. n.2); iii) spettroscopia nel visibile (light scattering) e microscopia di forza atomica (AFM, U.R. n.3). Le prime quattro tecniche permetteranno di ottenere informazioni dettagliate sui diversi aspetti strutturali dei vari enzimi (stabilità, struttura secondaria, terziaria, e di singoli domini), della loro dinamica conformazionale (mobilità locale) e di quella delle membrane con cui saranno fatti interagire; le misure di light scattering e AFM, forniranno rispettivamente una determinazione quantitativa dei processi d'aggregazione e degli effetti del legame delle lipossigenasi sulle membrane.
L'interdisciplinarietà di questo approccio permetterà di caratterizzare gli aspetti strutturali e funzionali di quest'importante classe di enzimi. L'insieme delle informazioni complementari così raccolte, permetterà di comprendere nel dettaglio i meccanismi di funzionamento specifici della famiglia delle lipossigenasi ed eventualmente le patologie umane connesse a loro disfunzioni (dovute, per esempio, a fenomeni d'aggregazione) o alla loro stessa attività (danni da stress ossidativo).

Il progetto sarà diviso in tre fasi:
1.a Preparazione dell'apo-proteina dalla mini-LOX, e di forme ricostituite con altri metalli.
1.b Clonazione del gene della lipossigenasi di mammifero (di coniglio e umana).
1.c Caratterizzazione della compressibilià isoterma, delle cinetiche di denaturazione e dei processi d'aggregazione della 15-lipossigenasi di soia (15-LOX-1).

2.a Preparazione di enzimi di mammifero ricombinante.
2.b Visualizzazione dei domini raft e non-raft in membrane sintetiche.
2.c Caratterizzazione strutturale dei campioni preparati nella Fase 1.a, e della loro interazione con singoli lipidi come substrato.

3.a Preparazione e studio di frammenti e mutanti della lipossigenasi di mammifero.
3.b Studio dell'interazione della lipossigenasi con le membrane: determinazione della ripartizione preferenziale delle varie forme di lipossigenasi e dei loro aggregati in diversi domini e raft e non-raft di membrana, anche in funzione dell'attività enzimatica.



Il coordinatore scientifico del programma ha una vasta esperienza nella coordinazione di progetti inter-disciplinari a livello nazionale ed europeo e, di conseguenza, conosce molto bene l'importanza della collaborazione tra le varie Unità di Ricerca, per il successo di progetti che utilizzano approcci sperimentali alquanto diversi ma complementari. A questo proposito, oltre al regolare scambio di dati tra i vari gruppi, saranno organizzati degli incontri tra i tre responsabili scientifici del progetto per la discussione dei risultati ottenuti, con scadenza semestrale. In questo modo sarà possibile riesaminare periodicamente le varie tappe del progetto, e perfezionare gli obiettivi intermedi delle tre U.R. attraverso una regolare coordinazione. Un'importante revisione generale sarà effettuata alla scadenza del primo anno del progetto, alla luce dei progressi nell'espressione delle lipossigenasi di mammifero e della verifica dei processi aggregativi delle varie forme di lipossigenasi di soia.
Ci si aspetta anche di ottenere un cospicuo numero di pubblicazioni in collaborazione tra le tre U.R., su riviste internazionali, sia specificatamente incentrate sul rapporto struttura/funzione dell'enzima e sulle conseguenze i eventuali processi di aggregazione, sia sulla problematica della sua interazione con le membrane lipidiche. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Introduzione
Lo studio dei sistemi complessi rappresenta oggi uno degli obiettivi principali della ricerca di punta nel campo della biologia cellulare. Tra questi, le membrane biologiche sono a livello molecolare la classe piu' difficile da studiare, sia a causa della loro intrinseca eterogeneità, sia perchè si tratta di sistemi dinamici le cui proprietà chimico-fisiche hanno una natura collettiva, piuttosto che essere determinate dalla dinamica delle singole proteine e lipidi che le compongono [1]. In particolare, la caratterizzazione dei processi d'interazione tra le proteine, in maggior parte idrosolubili, e i lipidi di membrana rappresenta una delle sfide più stimolanti che la ricerca scientifica dovrà prossimamente affrontare per spiegare alcuni dei fenomeni coinvolti nel metabolismo cellulare, quali ad esempio la trasduzione del segnale, l'apoptosi e il traffico intracellulare.
Ad eccezione delle proteine di membrana, che pure in alcuni casi sono parzialmente dotate di domini idrofilici (come accade, ad esempio, per le proteine-canale), gli enzimi citosolici, che operano in ambiente acquoso, devono essere necessariamente dotati di una superficie esterna idrofilica, che consenta la loro solubilità. D'altra parte, la natura prevalentemente idrofobica delle lunghe catene idrocarburiche degli acidi grassi rappresenta un ambiente totalmente opposto dal punto di vista chimico-fisico. In questo sistema misto, enzima-lipidi, i contatti idrofobici tra molecole di natura cosi' diversa hanno un ruolo chiave nel modulare la dinamica della loro interazione reciproca e di conseguenza l'attivita' dell'enzima stesso. A causa di questa complessita' intrinseca, lo studio di questi richiede necessariamente un approccio interdisciplinare.
Per il nostro progetto abbiamo scelto le lipossigenasi, enzimi che hanno un'enorme rilevanza strategica nella ricerca biologica e medica, in quanto sono coinvolti in disfunzioni e patologie rispettivamente del metabolismo cellulare d'organismi vegetali e animali [2]. Inoltre, trattandosi di proteine idrosolubili che acquisiscono il loro substrato dalle membrane biologiche, offrono un naturale modello paradigmatico dell'interazione tra proteine citosoliche e lipidi.
Sebbene a livello intracellulare la viscosità citoplasmatica, la ristrettezza di spazio e "l'affollamento" di specie molecolari assai diverse (crowding) influenzino considerevolmente le proprietà dinamiche degli enzimi condizionandone il funzionamento, lo sviluppo e la caratterizzazione di modelli preliminari in vitro è il punto di partenza più naturale per poter affrontare l'ulteriore complessità che questi meccanismi mostrano in vivo. I meccanismi d'interazione tra le lipossigenasi e i singoli lipidi e/o membrane modello saranno studiati a livello molecolare mediante l'uso di tecniche d'indagine che consentano sia misure di carattere prettamente biochimico (per esempio le costanti di legame e di dissociazione di questi complessi), sia di ottenere informazioni di carattere più squisitamente strutturale (quali le costanti di diffusione, il raggio di girazione, i fattori di forma) e dinamico (come le variazioni conformazionali indotte dall'interazione stessa sia sull'enzima, sia sulla membrana-bersaglio).


L'enzima e le problematiche connesse alla sua attivita'
Le lipossigenasi costituiscono una categoria di enzimi citosolici piuttosto vasta, estremamente diffusa sia nel mondo animale, sia in quello vegetale [2]. Il loro substrato d'elezione è costituito dalla classe degli acidi grassi poli-insaturi, contenenti uno o più pentadieni con doppi legami in configurazione cis. La loro rilevanza biologica è essenzialmente dovuta al doppio ruolo che questi enzimi hanno nell'ambito cellulare: infatti, da un lato sono in grado di sintetizzare (da singoli acidi grassi) specifici idroperossidi coinvolti nei processi di bio-regolazione; dall'altro, possono indurre (sempre mediante perossidazione di lipidi) cambiamenti strutturali nelle membrane, con conseguenze assai rilevanti per i processi metabolici.
Per esempio, sono direttamente coinvolti nei processi di germinazione nelle piante [3] e hanno un ruolo chiave nei mammiferi, nella cascata dell'acido arachidonico, per la sintesi dei leucotrieni e lipossine [4,5]. Nei mammiferi, questi enzimi sembrano prendere parte anche in varie patologie quali l'invecchiamento cerebrale, l'infezione da HIV e il cancro [6]. Alla base di questo coinvolgimento vi e' naturalmente il fatto che i grassi con cui questi enzimi interagiscono (cosi' come i derivati da loro prodotti) possono comportarsi come modulatori dell'espressione genica che regola il metabolismo, la crescita e il differenziamento cellulare [7]. Inoltre, le lipossigenasi hanno un ruolo chiave anche nell'insorgere dell'aterosclerosi, mediante la loro diretta azione sulle lipoproteine a bassa densita' [8, 9].
Uno studio condotto sulla 5-LOX, ha dimostrato che la fluidita' di membrana e' un parametro essenziale con cui l'attivita' di questa proteina puo' essere regolata a livello cellulare [10]. Infatti, e' stato riscontrato che l'efficacia con cui la lipossigenasi si lega alla membrana e' direttamente dipendente dalla composizione lipidica e, in particolare, dalla presenza di derivati dell'acido arachidonico. Questo risultato e' molto interessante perche' inquadrerebbe le modalita' di regolazione delle lipossigenasi, nell'ambito delle piu' recenti teorie sul ruolo attivo delle membrane biologiche nel metabolismo cellulare. L'esistenza di microdomini lipidici, i cosiddetti raft, capaci di costituire siti preferenziali di legame per proteine che si ancorano alle membrane [11], potrebbe essere, infatti, cruciale per la modulazione dell'attivita' delle lipossigenasi, eventualmente inibendola. D'altra parte, questi enzimi sono soggetti a fenomeni d'aggregazione [12], probabilmente per la presenza di zone parzialmente idrofobiche esposte sulla loro superficie. Queste stesse aree idrofobiche possono essere ragionevolmente coinvolte nell'interazione con le membrane, suggerendo l'ipotesi che nelle lipossigenasi esista una regolazione dell'attività catalitica anche tramite i processi di aggregazione. Lo studio dell'aggregazione in vitro e dei suoi effetti sull'interazione delle lipossigenasi con membrane modello e naturali, e' dunque una tappa essenziale per la caratterizzazione strutturale e funzionale di questa classe d'enzimi.
Esistono vari tipi di lipossigenasi che si differenziano per l'atomo di carbonio dell'acido arachidonico su cui agiscono. La lipossigenasi di soia di tipo 1, comunemente indicata come LOX-1, aggiungendo ossigeno molecolare al carbonio C-15, appartiene alla categoria delle 15-LOXs. Si tratta di uno dei pochi isoenzimi di cui si conosce la struttura cristallografica e che, grazie agli studi approfonditi cui è stato sottoposto, rappresenta un modello indispensabile per la comprensione del funzionamento dell'intera famiglia delle lipossigenasi.

La struttura e il meccanismo catalitico
Nonostante la lontananza filogenetica e le differenze in peso molecolare, le lipossigenasi vegetali e quelle del regno animale potrebbero condividere una simile struttura ed un medesimo meccanismo di catalisi enzimatica [2]. In effetti, praticamente tutte le lipossigenasi conosciute sono caratterizzate da un identico centro catalitico, costituito da un atomo di ferro coordinato a quattro residui d'istidina e ad un'isoleucina situata al carbossi-terminale. Il confronto della LOX-1 vegetale [13,14] con l'isoenzima corrispondente del coniglio (di cui è pure nota la struttura a raggi X, [15]) ha dimostrato che entrambe le proteine sono caratterizzate da un dominio N-terminale (circa 30 kDa) quasi interamente a struttura beta, e da un dominio C-terminale ad alta percentuale di alfa-eliche (circa 60 kDa), contenente il sito attivo. Secondo il modello più accreditato, l'accesso del substrato al sito di legame sembra avvenire attraverso un canale perpendicolare a quello d'ingresso dell'ossigeno [2, 16]. Tuttavia, i dettagli di questo processo non sono stati ancora completamente spiegati, come del resto non è chiaro il modo in cui l'enzima acquisisca il suo substrato. Quest'ultimo meccanismo è anzi una delle maggiori problematiche cui si sta tentando di dare una risposta e che rientra, naturalmente, nell'ambito di ricerca assai più generale sull'interazione proteine-lipidi. Una delle ipotesi avanzate negli ultimi anni si basa sull'analogia strutturale del dominio N-terminale delle lipossigenasi con il C-terminale di alcune lipasi presenti nei mammiferi [15]. Poiché in quest'ultimo caso la struttura beta del C-terminale è direttamente coinvolta nell'acquisizione del substrato lipidico, è stato proposto che un ruolo analogo sia svolto nelle lipossigenasi dall'omologo dominio N-terminale.
Tuttavia, quest'ipotesi non sembra adattarsi alla LOX-1 di soia, come dimostrato recentemente in uno studio portato avanti in stretta collaborazione dalle U.R. n.1 e n.2. Infatti, è stato dimostrato che se l'enzima viene privato del dominio N-terminale (creando così un frammento da 60 kDa chiamato mini-LOX-1) non solo conserva una struttura simile alla proteina nativa, ma non perde nemmeno la capacità di legarsi alle membrane, mostrando addirittura un aumento nell'efficienza catalitica [17-19]. Uno studio sistematico di questo frammento da 60 kDa, prodotto dall'U.R. n.2, e il paragone con la proteina nativa possono dunque costituire un buon modello di partenza per la comprensione del meccanismo d'interazione di queste proteine con i lipidi. Inoltre, la possibilita' di ottenere l'enzima ricombinante sia di coniglio [20], sia umano [21], offrirebbe l'opportunita' di estendere questa caratterizzazione direttamente alle lipossigenasi di mammifero, che sono le piu' interessanti dal punto di vista medico, a causa del loro gia' ricordato coinvolgimento in patologie di vario genere.

Le metodologie
Le tre U.R. di questo progetto possiedono diverse competenze utilizzabili nell'analisi strutturale e funzionale di proteine e lipidi. Le U.R. di ricerca n. 1 e n. 2 hanno una vasta esperienza sulla struttura e funzione delle proteine e dei lipidi, avendo lavorato anche in modo specifico con proteine come le lipossigenasi [16] e le lipoproteine a bassa densità [22]. In particolare l'U.R. n. 1 si occupa di spettroscopia di fluorescenza dinamica e dicroismo circolare applicate in particolare allo studio del processo di ripiegamento (folding) delle proteine, alla loro stabilità in funzione delle condizioni al contorno (temperatura, forza ionica, pH ecc...) e ai loro cambiamenti strutturali indotti dall'interazione con i substrati [23-25]. Mediante misure in condizioni d'alta pressione, l'U.R n.1 si occupa anche dell'analisi delle proprietà elastiche delle proteine quali la compressibilità adiabatica ed isoterma e dello studio dei cambiamenti di volume ad esse associati [26, 27].
L'U.R. n.2 ha recentemente condotto uno studio strutturale della LOX-1 di soia [12] mediante spettroscopia a raggi X a basso angolo (SAXS). Inoltre, mediante spettroscopia nell'infrarosso (FTIR) e' in grado di analizzare cambiamenti nelle proprieta' fisiche delle membrane (ad esempio nelle loro transizioni di fase) dovute all'interazione con l'enzima.
L'U.R. n. 3 si occupa di light scattering statico e dinamico, una tecnica essenziale per la caratterizzazione degli aggregati molecolari. Inoltre l'U.R. di ricerca n. 3 possiede un apparato per la microscopia a forza atomica (AFM) che, consentendo di analizzare campioni di dimensioni sino ai millimetri, e' complementare alla spettroscopia di light scattering [28-30]. Inoltre, l'AFM può essere utilizzato per studiare direttamente gli effetti della lipossigenasi su membrane sintetiche e naturali, attraverso misure di spettroscopia di forza.
Infine, una parte del gruppo dell'U.R. n.1 e' specializzato nelle tecniche di biologia molecolare e purificazione delle proteine, necessarie per clonare il gene della lipossigenasi umana e per ottenere la proteina ricombinante e i suoi mutanti. <<<