RICERCA ITALIANA     

Ottenimento di cellule embrionali staminali-simili coltivando fibroblasti in presenza di estratti di cellule embrionali staminali di topo

Università degli Studi di Pavia

Abstract

Molte malattie che affliggono l'Uomo sono associate con la morte cellulare. La medicina del XXI secolo si prefigge di utilizzare terapie cellulari per sostituire le cellule morte con cellule nuove, cosi' come oggi si impiega il trapianto d'organo. Le cellule staminali rappresentano la sorgente biologica ideale per la rigenerazione di tessuti e organi danneggiati. Studi recenti hanno dimostrato che cellule somatiche terminalmente differenziate coltivate in presenza di estratti cellulari di altri tipi cellulari, sono in grado di acquisire un nuovo stato differenziativo.

Il principale obiettivo di questo programma di ricerca e' di ottenere un elevato numero di cellule staminali pluripotenti coltivando cellule somatiche differenziate in presenza di estratti di cellule embrionali staminali (ES) di topo.

In seguito alla coltura di fibroblasti in presenza di estratti di cellule ES, ci si attende, da nostri dati preliminari, che queste cellule differenziate acquisiscano una pluripotenza simile a quella delle cellule ES.
La riprogrammazione funzionale dei fibroblasti, verra' definita analizzando:

A) la capacita' dei fibroblasti riprogrammati di:
1) differenziarsi in corpi embriodi;
2) partecipare alla formazione di un nuovo individuo ed alle sue cellule germinali in seguito al trasferimento all'interno delle blastocisti;

B) l'architettura nucleare, attraverso la localizzazione dei centromeri e dell'eterocromatina costitutiva;

C) il profilo di metilazione dell'intero genoma e di singoli specifici geni;

D) l'espressione di geni e proteine che definiscono la condizione di pluripotenzialita'. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Silvia GARAGNA Università degli Studi di PAVIA

Obiettivo del Programma di Ricerca

La nostra ipotesi di lavoro, sviluppata in questo programma di ricerca, sostiene che le cellule staminali pluripotenti possano essere ottenute in vitro coltivando cellule somatiche differenziate (ad es., fibroblasti di topo) in presenza di estratti cellulari ottenuti da cellule ES di topo. Ci si attende che le cellule staminali pluripotenti ottenute attraverso questa procedura siano in grado di proliferare estensivamente, mantenendo uno stato indifferenziato. Queste cellule ES-simili rappresenterebbero una sorgente illimitata, in seguito a coltura in terreni differenzianti, di diversi tipi cellulari somatici. Lo studio proposto porra' le basi di conoscenza necessarie all'identificazione delle molecole e dei meccanismi responsabili di processi biologici quali il controllo del de-differenziamento cellulare, l'acquisizione della pluripotenzialita' e di un nuovo stato differenziato.

Sebbene linee cellulari ES umane siano state stabilite fin dal 1998 (Thomson et al., 1998), le conoscenze e le tecnologie sviluppate dalla ricerca sulle cellule ES di topo (Evans e Kauffman, 1981; Martin, 1981) suggeriscono che la nostra ipotesi di lavoro venga meglio e prima verificata su questo modello animale. La conoscenza che deriva da questi studi rappresenta un primo passo verso l'obiettivo a lungo termine di riprodurre la capacita' degli estratti delle cellule ES di riprogrammare cellule somatiche differenziate, senza la necessita' di utilizzare cellule ES stesse.

Il raggiungimento degli scopi di questo studio avra' un impatto:
1) sulla ricerca di base, producendo la conoscenza necessaria all'identificazione dei meccanismi responsabili del controllo del de-differenziamento cellulare e lo stabilirsi dello stato di pluripotenza;

2) in medicina, in seguito agli studi su modelli animali di malattie umane, i risultati produrranno la metodologia utile all'ottenimento di una sorgente illimitata di tipi cellulari da utilizzarsi in applicazioni terapeutiche.


BIBLIOGRAFIA

- Evans M., Kaufman M. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292, 154-156, 1981.

- Martin G, Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 78, 7634-7638, 1981.

- Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282: 1145-1147, 1998. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Molte delle malattie che affliggono l'Uomo sono associate con la morte della cellula. La medicina del XXI secolo ha come obiettivo quello di far uso di terapie cellulari per sostituire cellule morte con cellule nuove, cosi' come ora vengono impiegati i trapianti d'organo. Le cellule staminali (CS) rappresentano il materiale biologico ideale per la rigenerazione dei tessuti e degli organi danneggiati.

Le CS sono presenti nei tessuti e negli organi adulti come l'epitelio, il fegato, il midollo osseo, i muscoli ed il sistema nervoso centrale. Le cellule staminali adulte sono quiescienti o proliferano lentamente, ma possiedono la capacita' di riprendere l'attivita' proliferativa cosi' da sostituire le cellule morte o danneggiate. In alcuni casi, sia le cellule staminali che quelle a cui esse danno origine derivano dallo stesso foglietto embrionale ('intra-germ layer conversion') (Jackson et al., 1999; Mahmud et al., 2002; Mc-Kinney-Freeman, 2002; Orlic, 2004). Di recente, sono stati pubblicati esempi di 'trans-germ layer conversion', nei quali le CS e la loro progenie appartengono a linee cellulari non correlate da un punto di vista embriologico (Kopen et al., 1999; Sanchez-Ramos et al., 2000; Woodbury et al., 2000; Petersen et al., 1999; Wang et al., 2002; Bjornson et al., 1999; Galli et al., 2000; Munoz-Elias et al., 2003, 2004).

CS isolate dall'individuo adulto, sono gia' state impegate per il trattamento della leucemia, della cornea (Rama et al., 2001) e della necrosi post-infartuale (Orlic, 2004). Risultati molto incoraggianti sono stati ottenuti impiegando cellule ES. Queste cellule staminali possono proliferare estensivamente mantenendo uno stato indifferenziato e, quando stimolate in modo appropriato, possono differenziarsi in molti tipi cellulari somatici (per una recensione si veda Rippon e Bishop, 2004) e germinali (Hubner et al., 2003). Le cellule ES sono state utilizzate in modelli animali per il trattamento della malattia di Parkinson (Kim et al., 2002), delle immunodeficienze (Rideout et al., 2002) e dei traumi della colonna vertebrale (McDonald 2004).

Metodi alternativi per l'ottenimento di cellule totipotenti-pluripotenti sono stati sviluppati.

Gli esperimenti di trasferimento nucleare (ai quali ha contribuito il responsabile della Unita' di Ricerca N. 2, si veda Wakayama et al., 1998) hanno chiaramente dimostrato che gli oociti enucleati di mammifero hanno la capacita' di riprogrammare nuclei di cellule somatiche terminalmente differenziate (per una estesa trattazione si veda Brem e Huhholzer, 2002). Il nuovo "zigote" ricostituito e' in grado di iniziare e completare lo sviluppo embrionale e, anche se con una bassa percentuale, alcuni dei feti ottenuti sono in grado diventare adulti. Sebbene non siano conosciuti i meccanismi e le molecole coinvolte nel processo di riprogrammazione, questi esperimenti dimostrano che le modificazioni epigenetiche (che permettono alle cellule differenziate di mantenere una propria memoria molecolare garantendo il mantenimento della identita' cellulare) possono essere eliminate ed il genoma di una cellula somatica terminalmente differenziata puo' acquisire uno stato totipotente o pluripotente.

La tecnica del trasferimento nucleare e' recente ed ha ancora un'efficienza molto bassa, con un successo che si attesta attorno a valori dell' 1-5% (Brem e Huhholzer, 2002). Nuove metodologie per ottenere un'efficiente riprogrammazione funzionale di un numero elevato di cellule somatiche in grado di superare le difficolta' associate al trasferimento nucleare, fanno ricorso al transdifferenziamento di cellule in coltura. Esperimenti di fusione cellulare hanno dimostrato che le cellule ES e le cellule germinali embrionali (EG) sono in grado di indurre processi di riprogrammazione cellulare (Tada et al., 2001; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002). Altri studi hanno dimostrato la possibilita' di ottenere transdifferenziamento in coltura: i mioblasti possono transdifferenziare in adipociti maturi se coltivati con fattori di trascrizione adipogenici (Hu et al., 1995); l'attivazione di fattori di trascrizione epatici in cellule pancreatiche puo' indurre la loro conversione in epatociti (Shen et al, 2000); il blocco delle giunzioni occludenti di osteoblasti in coltura determina il loro differenziamento fenotipico in adipociti (Schiller et al., 2001); nel ratto, cellule endoteliali del cordone ombelicale fetale o neonatale sono in grado di transdifferenziare in cardiomiociti quando co-coltivate con cardiomiociti neonatali (Condorelli et al., 2001).

Alcuni recenti lavori hanno rappresentato un momento di svolta nella ricerca riguardante il processo di transdifferenziamento cellulare (Hakelien et al., 2002, 2004; Landsverk et al., 2002; Gaustad et al., 2004). Estratti citoplasmatici isolati da diversi tipi di cellule somatiche hanno indotto una riprogrammazione dell'espressione genica di altri tipi di cellule somatiche o di nuclei isolati. Fibroblasti coltivati in presenza di estratti di linfociti T umani o di una linea linfocitaria trasformata esprimevano geni specifici della linea linfocitaria e l'espressione di antigeni specifici delle cellule T. Fibroblasti coltivati in presenza di estratti cellulari di precursori neuronali sintetizzavano le proteine dei neurofilamenti e mostravano una crescita di tipo dendritico. Cellule staminali umane ottenute dal tessuto adiposo coltivate in presenza di estratti di cardiomiociti di ratto hanno assunto caratteristiche funzionali tipiche dei cardiomiociti, indicando la possibilita' di un'efficiente transdifferenziamento cellulare trans-specifico (Gastaud et al., 2004).
Questa riprogrammazione funzionale di cellule somatiche altamente differenziate, viene evidenziata anche dall'assorbimento e localizzazione nucleare di fattori di trascrizione, dall'attivazione di un complesso proteico coinvolto nel rimodellare la composizione della cromatina. Il processo di transdifferenziamento osservato coinvolge molti cambiamenti cellulari, tra cui modificazioni epigenetiche della metilazione del DNA, della organizzazione e della condensazione della cromatina che porta alla attivazione o al silenziamento di specifici gruppi di geni. La riprogrammazione funzionale cosi' ottenuta si e' dimostrata stabile nelle molte divisioni cellulari successive e per diverse settimane di coltura (Hakelien et al., 2002, 2004; Hakelien and Collas, 2002; Landsverk et al., 2002).

Questi risultati dimostrano l'esistenza di una dominanza molecolare di un certo tipo cellulare su un altro, avendo come risultato la trasformazione del tipo cellulare suscettibile nel tipo cellulare dominante. L'impiego di estratti cellulari per l'ottenimento di grandi quantita' di cellule transdifferenziate sembra essere molto promettente e potrebbe costituire un ottimo modello di studio per l'analisi degli eventi della riprogrammazione cellulare in vitro. <<<