RICERCA ITALIANA     

Cannabinoidi e risposte allo stress nei vertebrati

Seconda Università degli Studi di Napoli

Abstract

Il programma prevede lo studio comparativo della partecipazione del sistema degli endocannabinoidi relativamente agli effetti dello stress sul comportamento alimentare e sulla riproduzione. L'interesse per l'argomento è nato dal fatto che il sistema dei cannabinoidi risulta essere molto conservato durante l'evoluzione e da questo dato siamo partiti, in un precedente progetto, per affrontare il problema del suo coinvolgimento nel processo riproduttivo dal punto di vista comparativo. Infatti, l'importanza dell'uso di modelli animali non mammiferi viene da più parti sottolineata. In particolare, i bassi vertebrati presentano alcune caratteristiche quali la possibilità di: 1-localizzare facilmente diverse forme molecolari di GnRH nell'asse riproduttivo rispetto ai mammiferi 2-studiare il progredire degli stadi maturativi della spermatogenesi durante il ciclo riproduttivo annuale (ciò consente di seguire i mutamenti della fisiologia della gonade nel corso delle stagioni). 3-modulare la spermatogenesi variando la temperatura 4-avere una spermatogenesi "cistica.
Inoltre è da più parti enfatizzata: 1-la stretta interdipendenza fra risposta alimentare e attività dell'asse funzionale ipotalamo-ipofisi-interrenale (HPI) nei pesci, 2-la dimostrata modulazione della funzione dell'asse HPI da parte degli endocannabinoidi, almeno nei roditori, 3-la correlazione fra endocannabinoidi e risposta alimentare nei teleostei
Tutte le UO partecipanti al progetto utilizzeranno diversi modelli sperimentali: pesci teleostei, anfibi e mammiferi [topi normali e topi geneticamente privi del gene che codifica il recettore per i cannabinoidi di tipo CB1 (CB1KO)].
L'UO diretta dalla prof.Franzoni (Torino) analizzerà mediante tecniche citochimiche e molecolari, il substrato neuroanatomico correlato all'attività di modulazione, da parte degli endocannabinoidi, e verosimilmente mediata da CB1, della risposta alimentare nei pesci teleostei. A questo scopo si analizzeranno, nel complesso telencefalo-ipotalamo-ipofisi, la distribuzione di markers fenotipici dei neuroni cannabinergici e le eventuali relazioni morfo-funzionali di questi con altri sistemi di neuromodulazione/neurosecrezione (CRF, NPY e POMC) che intervengono nelle risposte allo stress influenzando anche la risposta alimentare.
L'UO diretta dalla Prof. Carnevali (Ancona) valuterà il ruolo di CB1 nel comportamento alimentare durante il "first feeding" nel teleosteo D. rerio. Sarà studiata la modulazione dell' espressione di CB1 da parte della dieta. Si cercherà una relazione fra l'espressione genica di CB1 e quella dei fattori di crescita IGF I e IGF II. Si studierà, poi, la possibile relazione tra stati di stress e sistema cannabinergico in larve di D.rerio.
L'UO diretta dalla Prof.Polzonetti (Camerino) usando tecniche immunocitochimiche e biomolecolari studierà il coinvolgimento degli endocannabinoidi e di CB1 nella risposta allo stress attraverso l'asse ipotalamo-ipofisi-surrene e attraverso le modificazioni del GnRH ovarico usando come modello sperimentale il teleosteo Solea solea, un pesce pregiato recentemente introdotto in acquicoltura.
L'UO diretta dal Prof.Pierantoni (Napoli) studierà il coinvolgimento del sistema dei cannabinoidi e di quello degli oppioidi nella modulazione dell'attività testicolare sia mediante l'uso di modelli animali di vertebrati non mammiferi, quali l'anfibio anuro R.esculenta, che mammiferi quali i topi KO per il recettore di tipo CB1.
Tutte le UO collaboreranno scambiandosi informazioni circa i risultati ottenuti e complementandosi per le diverse tecniche da usare e le diverse competenze circa i modelli sperimentali adoperati. In particolare le UO di Torino ed Ancona saranno in stretta collaborazione con riferimento allo studio del comportamento alimentare, mentre le UO di Camerino e Napoli saranno in stretto contatto per lo studio della funzione riproduttiva. Infine l'UO di Torino esaminerà tutte le relazioni che si svilupperanno a livello del sistema nervoso. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Riccardo PIERANTONI Seconda Università degli Studi di NAPOLI

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il programma prevede lo studio comparativo della partecipazione del sistema degli endocannabinoidi relativamente agli effetti dello stress sul comportamento alimentare e sulla riproduzione.
Il sistema dei cannabinoidi risulta essere molto conservato durante l'evoluzione come dimostrato da numerosi studi presenti in letteratura e da questo dato siamo partiti, in un precedente progetto, affrontando il problema del suo coinvolgimento nel processo riproduttivo dal punto di vista comparativo. Infatti, l'importanza dell'uso di modelli animali non mammiferi viene da più parti sottolineata (Pierantoni et al, 2002). Una caratteristica che lega le varie UO afferenti è proprio quella di avere utilizzato come modelli sperimentali principalmente vertebrati non mammiferi che presentano caratteristiche e peculiarità quali quelle di:
1-avere la possibilità di localizzare facilmente diverse forme molecolari di GnRH nell'asse riproduttivo rispetto ai mammiferi (Pierantoni et al, 2002).
2- presentare il progredire degli stadi maturativi della spermatogenesi durante il ciclo riproduttivo annuale (ciò permette di seguire i mutamenti della fisiologia della gonade nel corso delle stagioni) (Cobellis et al, 2002).
3- modulare la spermatogenesi variando la temperatura (ciò permette di ottenere in laboratorio testicoli contenenti popolazioni cellulari abbastanza omogenee, evitando l'uso di cellule germinali isolate, favorendo, quindi, lo studio in un contesto fisiologico) (Cobellis et al, 2002).
4- avere una spermatogenesi "cistica". Per esempio la Rana esculenta, come tutti gli anfibi, presenta le cellule del Sertoli che avvolgono uno spermatogonio, che si divide all'interno di questa "cisti" che conterrà cellule sincronizzate dal punto di vista dello stadio maturativo (ciò rende possibile riconoscere e quantificare facilmente le cellule nei vari stadi di sviluppo) (Minucci et al, 2000).
Inoltre è da più parti enfatizzata:
1. la stretta interdipendenza fra risposta alimentare e attività dell'asse funzionale ipotalamo-ipofisi-interrenale (HPI) nei pesci,
2. la dimostrata modulazione della funzione dell'asse HPI da parte degli endocannabinoidi, almeno nei roditori,
3. la correlazione fra endocannabinoidi e risposta alimentare nei teleostei
Circa il sistema degli oppioidi, in letteratura ci sono dati sulla presenza di peptidi oppioidi nel cervello e nell'ipofisi di numerose specie di vertebrati ma i dati relativi al loro coinvolgimento nella regolazione dell'attività testicolare sono scarsi o controversi (Facchinetti et al, 1993). Nei mammiferi, piccole quantità di peptidi oppioidi sono state trovate nelle gonadi (Fabbri et al, 1989), nella placenta (Bardin et al, 1987), nel surrene (Facchinetti et al, 1988). A livello testicolare, sia nel ratto che nella R.esculenta la beta-endorfina (B-EP) è espressa sia nelle cellule interstiziali che nelle germinali (Facchinetti et al, 1993). La secrezione di beta-endorfina (B-EP) è stimolata, nel ratto, dal fattore di rilascio dell'ormone adrenocorticotropo (CRF; Eskeland et al, 1989) e dalle gonadotropine (Ching-Li and Madigan 1987). Circa il ruolo svolto dagli oppioidi nella regolazione dell'attività testicolare, appare molto probabile che essi siano coinvolti nella regolazione della steroidogenesi e della spermatogenesi come bioregolatori locali (Facchinetti at al, 1993; Ciarcia et al, 1994).
Un interessante risultato, che riguarda specificamente la B-EP, è il suo probabile coinvolgimento nella regolazione della stagionalità riproduttiva e dello stress (Facchinetti et al, 1993). Inoltre, l'inibizione dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene ha una ricaduta importante sulla regolazione dello stress (Patel et al, 2004). E' dunque logico ipotizzare che anche il comportamento alimentare e l'attività gonadica risultino interessati.
Tutte le UO partecipanti al progetto utilizzeranno modelli sperimentali diversi, teleostei, anfibi e mammiferi (topi normali e topi che non esprimono il recettore dei cannabinoidi CB1, CB1KO).
Obiettivi del progetto sono i seguenti:
1 - caratterizzare, in diversi modelli sperimentali, il coinvolgimento del sistema dei cannabinoidi e quello degli oppioidi nella risposta allo stress, in particolare per quel che concerne il comportamento alimentare ed i processi riproduttivi.
2 - Studiare il ruolo dei cannabinoidi nella regolazione della funzionalità dell'asse ipotalamo-ipofisi-gonadi rispetto alla possibile correlazione con le varie forme molecolari di GnRH presenti nei diversi tessuti: testicolo, cervello, ovario.
3 - Considerare il grado di conservazione dell'attività del sistema dei cannabinoidi da un punto di vista evolutivo <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Sono molte le indicazioni circa l'elevato grado di conservazione del sistema di segnalazione dei cannabinoidi che è presente sia nei vertebrati che negli invertebrati. La maggior parte dei risultati ottenuti nelle diverse classi di vertebrati riguarda il possibile ruolo dei cannabinoidi nell'influenzare il comportamento, sebbene siano stati riportati dati relativi ad altre funzioni connesse, per esempio, con la riproduzione, con la risposta immunitaria e con la regolazione del comportamento alimentare (Salzet et al, 2000; Cota et al, 2003). Numerosi sono i lavori relativi al coinvolgimento dei cannabinoidi nei meccanismi neuroendocrini di segnalazione (Wenger et al, 1995 and Fernandez-Ruiz et al,1997). Wenger et al (2001) hanno dimostrato, usando topi KO per il recettore di tipo CB1, che esso è coinvolto nella regolazione dell'asse ipofisi-gonadi suggerendo che questi recettori mediano l'effetto dei cannabinoidi sulla funzione riproduttiva. Più recentemente, nel topo, è stato dimostrato che l'endocannabinoide anandamide (AEA) interagisce con l'asse ipotalamo-ipofisi-surrene (Wenger et al, 2003) influenzando la risposta allo stress (Patel et al, 2004). Lo stress è seguito da una complessa risposta neuroendocrina che prevede l'attivazione dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene ed il rilascio di catecolammine, requisiti fondamentali per una risposta adattativa. Il momento finale dell'attivazione dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene è rappresentato dall'aumento periferico dei glucocorticoidi il cui rilascio è stimolato dall'ormone adrenocorticotropo ipofisario (ACTH) che è a sua volta controllato dal corrispondente fattore di rilascio (CRF). A livello ipofisario, CRF stimola il rilascio sia della beta-endorfina (B-EP) che della beta-lipotrophina (B-LPH) oltre che di ACTH. Tutti questi ormoni peptidici rappresentano i prodotti della maturazione post-traduzionale del comune precursore proopiomelanocortina (POMC). La secrezione di peptidi derivati da POMC in risposta allo stress rappresenta un importante fenomeno adattativo. Ogni stimolo che è in grado di far aumentare il livello plasmatico di glucocorticoidi e catecolammine può essere considerato uno stimolo che induce stress, tale stimolo può essere sia di natura fisica che metabolica. Molte specie di vertebrati sono sensibili a differenti tipi di "stressanti" naturali; inoltre, sono molte le condizioni di stress che possono verificarsi quando animali selvatici sono stabulati. Condizioni di stress interferiscono con l'omeostasi e, attraverso il sistema neuroendocrino, gli animali possono rispondere allo stress in termini di adattamento. Lo stress interferisce anche con numerose funzioni biologiche quali la crescita, la riproduzione, il comportamento, l'alimentazione. Lo scopo principale di questo progetto è di investigare se gli endocannabinoidi siano coinvolti nella risposta allo stress usando diversi modelli sperimentali quali teleostei marini, anfibi e topi KO per CB1. Le relazioni fra l'asse ipotalamo-ipofisi-surrene/gonadi ed i cannabinoidi saranno valutate sia a livello centrale che periferico studiando gli effetti dello stress sul comportamento alimentare e sulla riproduzione. Lo stress si manifesta nei pesci in modi molto simili a quelli descritti nei tetrapodi e coinvolge numerosi messaggeri che intervengono nell'attività del complesso ipotalamo-sistema simpatico-cellule cromaffini e dell'asse funzionale ipotalamo-ipofisi-interrenale (HPI), equivalente di ipotalamo-ipofisi-surrene dei tetrapodi, alterando, tra l'altro, il metabolismo energetico e quindi i processi di crescita e la biologia riproduttiva (Wendelaar Bonga, 1997). Questi aspetti fondamentali dell'adattamento allo stress riducono, ad esempio, la resistenza dei pesci alle infezioni influenzando negativamente il tasso di crescita e il bilancio energetico e, più in generale, l'appetito, come dimostrato in acquicoltura dove lo stress da affollamento può alterare gravemente il comportamento alimentare (Alanara e Brannas, 1996). L'innalzamento del cortisolo plasmatico dei pesci è indice di risposta endocrina allo stress, conseguente a stimolazione dell'asse HPI (Wendelaar Bonga, 1997), e può modificare l'assunzione del cibo e il tasso di crescita come, ad esempio, dimostrato in pesce rosso da De Pedro et al (1993) e da Bernier et al (2004).
Valenti et al (2004), in uno studio farmacologico, hanno ipotizzato che gli endocannabinoidi possano influire sul comportamento alimentare del pesce rosso in due modi distinti: stimolando l'appetito se somministrati a basse dosi, inibendolo, a concentrazioni più elevate. Inoltre modificazioni del regime alimentare inducono variazioni dei livelli di anandamide nel telencefalo. Questi dati sembrano concordare con l'osservazione di abbondante immunoreattività a prodotti CB1-simili (CB1-LI-IR) nelle aree telencefaliche ventrale e ventrolaterale e nei lobi inferiori dell'ipotalamo sia in pesce rosso sia nel ciclide Pelvicachromis pulcher (Franzoni et al, 2004; Cottone et al, in press), aree da tempo note come centri di controllo della risposta alimentare nei pesci (Demski, 1973; Roberts e Savage, 1978; Demski, 1983). Inoltre, poiché gli endocannabinoidi modulano in maniera fisiologica la risposta alimentare in organismi molto semplici com'è stato dimostrato nello cnidario Hydra (De Petrocellis et al, 1999) si può affermare che tale ruolo sia filogeneticamente molto antico.
Un sistema poco studiato comparativamente per quel che concerne i processi riproduttivi è quello degli oppioidi. Ci sono dati sulla presenza di peptidi oppioidi nel cervello di numerose specie di vertebrati (Facchinetti et al, 1993) ma risultati relativi al loro coinvolgimento nella regolazione dell'attività gonadica sono scarsi o controversi (Facchinetti et al, 1992; Ciarcia et al 1994). Nei mammiferi piccole quantità di peptidi oppioidi sono state trovate nelle gonadi (Fabbri et al, 1989), nella placenta (Bardin et al, 1987), nel surrene (Facchinetti et al, 1988). A livello testicolare, sia nel ratto che nella R.esculenta la B-EP è espressa sia nelle cellule interstiziali che nelle germinali (Li et al, 1989; Facchinetti et al, 1993). La secrezione di B-EP è stimolata, nel ratto, da CRF (Eskeland et al, 1989) e dalle gonadotropine (Ching-Li and Madigan 1987). Circa il ruolo svolto dagli oppioidi nella regolazione dell'attività testicolare appare molto probabile che essi siano coinvolti nella regolazione della steroidogenesi e della spermatogenesi come bioregolatori locali (Facchinetti at al, 1993).
Un interessante risultato che riguarda specificamente la B-EP è il suo probabile coinvolgimento nella regolazione della stagionalità riproduttiva e dello stress (Facchinetti et al, 1993). In R.esculenta, infatti, la B-EP presenta un profilo annuale nel cervello, ipofisi e testicolo e trattamenti con naltrexone antagonizzano l'inibizione della produzione di testosterone dovuto allo stress da cattura in animali intatti. Il naltrexone, inoltre, induce un aumento della produzione di testosterone da parte di testicoli incubati per 24 h (Pierantoni et al, 2002). In questo contesto è particolarmente importante ricordare che anche i cannabinoidi hanno un effetto inibente sull'attività neuroendocrina che presiede il rilascio di ormoni ipofisari (Ho et al, 2000; Murphy et al, 1999). In particolare, l'inibizione dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene ha un'importante ricaduta sulla regolazione dello stress (Patel et al, 2004). E' dunque logico ipotizzare ricadute anche sull'attività gonadica. Per quanto descritto, dunque, sembrerebbe interessante studiare le possibili interazioni fra oppioidi e cannabinoidi nel modulare l'attività testicolare sia mediante l'uso di vertebrati non mammiferi, quali l'anfibio anuro R.esculenta, che mediante l'utilizzo di topi KO per il recettore di tipo CB1. La R.esculenta, infatti, è un riproduttore stagionale in cui sia il sistema degli endocannabinoidi che quello degli oppioidi sono stati studiati (Facchinetti et al, 1993; Vallarino et al, 1993). Inoltre sono state ben caratterizzate le attività dei principali fattori, GnRH di tipo I e II, che regolano l'attività testicolare, sia a livello ipotalamo-ipofisario che intragonadico (Pierantoni et al, 2002).
Risultati recentemente ottenuti sono incoraggianti; infatti, i recettori di tipo CB1 sono abbondantemente distribuiti nell'encefalo di pesci ossei ed anfibi anuri, in particolare nell'area setto-ipotalamica. Sono topograficamente co-distribuiti con GnRH e TH (l'enzima che interviene nel pathway biosintetico delle catecolammine ed assunto come marker dei neuroni a dopammina). Il gene cb1 è espresso in un'ampia gamma di tessuti di Rana con concentrazioni diverse (muscolo, rene, ipofisi, fegato, midollo spinale, ovario, cervello, testicolo) con una concentrazione massima nel midollo spinale. A livello gonadico, l'espressione del gene cb1 è, invece, molto scarsa. Considerando le diverse aree cerebrali, mediante RT-PCR, si è visto che c'è un incremento graduale passando dal telencefalo al romboencefalo. Nel midollo spinale cb1 è espresso ad alti livelli nel tratto toracico e nelle terminazioni nervose del fascio lombare (Meccariello et al, in preparazione).
La proteina CB1 è presente nel cervello di ratto e mostra un PM di 63 kDa; nel cervello di R.esculenta ha un PM 66 kDa. Nel testicolo di R.esculenta il recettore CB1 è stato localizzato nello scomparto interstiziale. Circa il pattern di espressione, la proteina è scarsamente prodotta nel cervello e la sua concentrazione risulta considerevolmente aumentata nelle terminazioni nervose. Nel testicolo, durante il ciclo annuale, CB1 è presente da gennaio a dicembre, mostrando due picchi nel mese di settembre e di marzo periodi correlati con la spermioistiogenesi e la spermiazione. Questo suggerisce un suo coinvolgimento nella regolazione dell'attività dello scomparto germinativo (Cobellis et al, in preparazione).
La localizzazione di CB1 e del GnRH nell'ovario maturo di Sparus aurata ha anche dato risultati interessanti. Lo studio è stato condotto su orate femmina ed individui in inversione sessuale (il peso era compreso tra 0,7 e 1,5 kg) ottenuti presso il centro di acquicoltura "Orbetello Pesca Lagunare S.r.l". L'espressione di cb1 e delle diverse forme molecolari di GnRH nell'ovario maturo e nella gonade in inversione è stata valutata mediante RT-PCR usando primers specifici per Sparus aurata. Sempre mediante RT-PCR è stata dimostrata la presenza di trascritti per le tre forme molecolari di GnRH nella gonade in inversione come conseguenza di splicing alternativo. Inoltre nel tessuto testicolare della gonade in inversione è stata trovata una banda aggiuntiva "unspliced" per la forma cII-GnRH (Polzonetti et al, in preparazione).
La localizzazione dei trascritti di cb1 e del GnRH è stata valutata mediante ibridazione "in situ". Sia i trascritti di cb1 che quelli delle tre forme molecolari del GnRH sono presenti in tutte le classi di ovociti nell'ovario maturo. Differenze di espressione sono state evidenziate nelle due porzioni della gonade in inversione, in particolare il segnale per i trascritti cb1 e seabreamGnRH (sbGnRH) è rilevabile solo nella porzione testicolare (Polzonetti et al, in preparazione). Problemi connessi con le diverse sensibilità dei due metodi potrebbero spiegare la discrepanza dei risultati. I trascritti sGnRH e cIIGnRH sono presenti in entrambe le porzioni della gonade in inversione ed in tutte le classi di ovociti della porzione ovarica. Pare quindi che i cannabinoidi, via CB1, siano coinvolti nel differenziamento della gonade di Sparus aurata (Polzonetti et al, in preparazione).
Infine, il gene di cb1 è stato clonato e sequenziato dal cervello di Danio rerio e, con una sonda specifica, si è studiata la sua espressione durante lo sviluppo embrionale e larvale. Il gene non si esprime nelle uova mature mentre è presente in stadi precedenti (ovociti vitellogenici). Questi dati indicano che CB1 non è un fattore materno. La proteina, inoltre, compare allo stadio di 3 somiti (Carnevali et al, in preparazione ).
Da tutti i dati sopraesposti sembra chiaro il coinvolgimento dei cannabinoidi, mediato da CB1, nella regolazione centrale e periferica dell'attività riproduttiva nei vertebrati. Ci sembra, quindi, interessante continuare lo studio comparativo sull'attività svolta dagli endocannabinoidi nei vertebrati intraprendendo ricerche sulle risposte allo stress sia nell'ambito del comportamento alimentare sia nella regolazione dell'attività gonadica. <<<