RICERCA ITALIANA     

Strutture sopramolecolari. I complessi Dps (DNA-binding proteins from starved cells)-DNA e sorcina-canali del calcio e loro funzione biologica.

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

Il programma riguarda due sistemi diversi per composizione e funzione.
1. Proteine Dps-DNA
Le proteine batteriche Dps, espresse in condizioni di stress, proteggono il DNA con due meccanismi, uno fisico che porta al sequestro del DNA in complessi Dps-DNA e uno chimico dovuto all'attività ferrossidasica che inibisce la formazione di radicali a partire dal Fe(II). La Dps di Escherichia coli, prototipo della famiglia, interagisce con il DNA tramite i tre residui di lisina della regione N-terminale; esperimenti dei proponenti per il PRIN 2003 hanno dimostrato che in vitro la Dps nativa condensa il DNA plasmidico, cioè forma complessi Dps-DNA molto grandi che contengono molte molecole di Dps e uno o più plasmidi, mentre mutanti con una lisina N-terminale legano il DNA senza condensarlo. Dati non ancora pubblicati mostrano inoltre che nella Dps espressa durante la fase stazionaria di crescita le lisine dell'N-terminale sono metilate, mentre non lo sono nella proteina espressa durante la fase esponenziale. La metilazione influenza la modalità di interazione con il DNA favorendone la condensazione; sembra quindi costituire un fattore di regolazione non individuato in precedenza e di sicuro interesse anche in un'ottica evolutiva. Su queste basi il progetto si propone di proseguire gli esperimenti di cristallizzazione che hanno permesso di ottenere co-cristalli Dps-DNA di qualità cristallografica, ma molto fragili, migliorando innanzitutto la stabilità per poi estendere lo studio anche ai complessi formati dalla Dps metilata. I risultati permetteranno di definire la modalità di interazione fra le due macromolecole ad un livello di risoluzione mai raggiunto. Sarà valutata poi, per comprenderne la funzione, l'entità della reazione di metilazione delle lisine all'N-terminale in diverse condizioni di stress del batterio (e.g. shock termico, agenti alchilanti). In questo contesto si inserisce anche lo studio della Dps di Thermosynechococcus elongatus, la prima da batteri termofili.

2. Sorcina-canali del Ca2+
La sorcina lega Ca2+ con alta affinità e in conseguenza trasloca dal citosol alle membrane cellulari dove interagisce con proteine bersaglio diverse nei diversi tessuti, e.g. recettori della rianodina (RyR) e scambiatore Na+-Ca2+ (NCX) nel muscolo scheletrico e cardiaco in cui la sorcina regola il flusso del Ca2+. Infatti inibisce RyR che, promuovendo il rilascio di Ca2+ dai depositi, ne aumenta la concentrazione intracellulare, ed attiva NCX che estrude Ca2+ dal citoplasma. La ricerca si propone di caratterizzare l'interazione fra sorcina e singoli canali nei suoi aspetti molecolari, ancora in gran parte ignoti, e fisiologici. Saranno pertanto determinate topologia e dipendenza dalla concentrazione di Ca2+ dei parametri cinetici e termodinamici della reazione di legame per definire come la sorcina interagisca in successione con i vari canali durante il ciclo eccitazione-contrazione. Verranno utilizzati sorcina, il dominio N-terminale, quello C-terminale che lega il Ca2+, di cui i proponenti hanno determinato la struttura, mutanti sito-specifici della mano EF3 a più alta affinità per il Ca2+ (e.g. E124A) e dell'elica D che si è ipotizzato trasmetta al resto della molecola l'informazione che il Ca2+ si è legato a EF3 (e.g. W99G e W105G) ed il mutante F112L della regione tra l'elica D e EF3 cui è associata una cardiomiopatia ipertrofica; inoltre, i recettori della rianodina RyR1 e RyR2, del muscolo scheletrico e cardiaco, e NCX. L'effetto di sorcina, suoi domini e singoli mutanti su RyR sarà studiato misurando il rilascio del Ca2+ in cardiomiociti isolati, quello su NCX misurando correnti di membrana in risposta ad una rampa di potenziale sia in assenza che in presenza di NiCl2 che inibisce NCX. I peptidi che costituiscono le superfici di legame di RyR e NCX saranno identificati mediante "phage display" ed i parametri cinetici e termodinamici della reazione con la sorcina determinati in esperimenti di risonanza di plasma di superficie. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Emilia CHIANCONE Università degli Studi di ROMA "La Sapienza"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Obiettivo generale di tutti gli studi sulle strutture sopramolecolari biologiche, che derivano soprattutto dall'interazione fra proteine e acidi nucleici, è la comprensione non solo dei principi che determinano la specificità, ma anche delle forze coinvolte e degli aspetti dinamici del legame; questi ultimi consentono al sistema di rispondere alle esigenze della cellula. Il raggiungimento di questi obiettivi è facilitato dalla disponibilità di un numero sempre crescente di strutture cristallografiche di proteine e acidi nucleici. La conoscenza strutturale delle superfici di interazione infatti permette di progettare ed effettuare esperimenti per la definizione dei parametri suddetti.
Gli obiettivi specifici del progetto riguardano la caratterizzazione di struttura e funzione biologica di due sistemi diversi al cui studio il gruppo proponente ha dato contributi significativi: i complessi DNA-proteine della famiglia Dps (DNA-binding proteins from starved cells), e quelli sorcina (Soluble Resistance-related Calcium-bINding protein)-canali del Ca2+.
Le proteine Dps, espresse dai batteri in carenza di nutrienti, hanno la funzione di proteggere il DNA dall'attacco di agenti dannosi (agenti ossidanti, alchilanti o radicali). Sono uno dei più importanti meccanismi di difesa durante la fase di carenza nutrizionale; in questa ed in altre condizioni di stress contribuiscono ad aumentare la resistenza batterica. L'azione protettiva delle Dps, dodecameri cavi di subunità identiche, si esplica tramite due meccanismi: la formazione di complessi Dps-DNA che costituiscono una barriera fisica agli agenti dannosi, e l'attività ferrossidasica della proteina che permette di inibire l'azione tossica dei radicali idrossido prodotti a partire da Fe(II) e acqua ossigenata (5). Le Dps infatti possiedono un sito ferrossidasico molto conservato, individuato dal gruppo proponente nella proteina di Listeria innocua (3), che catalizza sia l'ossidazione del Fe(II) da parte dell'acqua ossigenata che l'incorporazione nella cavità proteica del Fe(III) che ne deriva. In alcuni batteri i due meccanismi coesistono, in altri i complessi Dps-DNA non si formano in quanto la regione N-terminale è molto ridotta e/o mancante dei residui di lisina che interagiscono con il DNA. In esperimenti condotti sulla Dps di Escherichia coli e suoi mutanti con delezioni nella regione N-terminale, il gruppo proponente ha dimostrato che il numero di tali lisine determina la capacità di condensare DNA plasmidico, cioè di formare grandi complessi che contengono molte molecole di Dps e uno o pochi plasmidi (2). Si intende giungere ad una descrizione strutturale completa dei complessi e in particolare proseguire gli esperimenti di cristallizzazione, iniziati nel PRIN 2003, per migliorare la stabilità dei co-cristalli Dps-DNA di qualità cristallografica già ottenuti.
Un ulteriore obiettivo riguarda il significato biologico dei complessi Dps-DNA; è collegato all'osservazione, non ancora pubblicata, che nella fase stazionaria di crescita di E. coli, in cui è massima l'espressione della Dps, si ha la metilazione delle lisine dell'N-terminale, reazione che a sua volta altera l'interazione con il DNA. Il potenziale regolativo della metilazione sarà quindi indagato a fondo anche per il suo interesse dal punto di vista evoluzionistico.
Il sistema sorcina-canali del Ca2+ si inquadra invece nel contesto dei processi di eccitazione-contrazione nel muscolo. La sorcina ha tutte le proprietà caratteristiche della famiglia PEF (Penta EF-hand Ca2+-binding proteins) cui appartiene come l'organizzazione della catena polipeptidica in due domini e la capacità di traslocare, a seguito del legame del Ca2+, dal citoplasma alle membrane cellulari dove interagisce con proteine bersaglio diverse a seconda del tessuto. Nel muscolo scheletrico e cardiaco le proteine bersaglio sono i canali di membrana coinvolti nell'accoppiamento eccitazione-contrazione, come i recettori della rianodina, i canali del Ca2+ voltaggio-dipendenti di tipo L e lo scambiatore Na+-Ca2+ (NCX). I RyR sono coinvolti nel rilascio del Ca2+ dei depositi nel citoplasma, mentre NCX lo estrude dal citoplasma. Esperimenti su miociti e cardiomiociti indicano che la sorcina regola la decontrazione della fibra muscolare inibendo RyR e attivando NCX (17, 24). Gli aspetti molecolari delle singole interazioni sono in gran parte ignoti, la ricerca si propone pertanto di definirli per comprendere anche la base molecolare di alterazioni patologiche del miocardio legate a mutazioni della sorcina. Saranno caratterizzate non solo le superfici di legame, ma anche la dipendenza dalla concentrazione di Ca2+ dei parametri cinetici e termodinamici delle reazioni fra sorcina ed i diversi canali. I parametri cinetici sono di particolare rilevanza poiché il RyR genera il rilascio del Ca2+ mentre la funzione fisiologicamente più importante dello scambiatore consiste nell'estrusione del catione dal citoplasma. Si può quindi immaginare che durante il ciclo eccitazione-contrazione-decontrazione del muscolo l'interazione della sorcina con i vari canali avvenga con una precisa successione, permettendo così alla sorcina di contribuire alla regolazione dei flussi del calcio all'interno della cellula.
Negli studi proposti verranno utilizzati la sorcina, il suo dominio C-terminale che lega il Ca2+, di cui il gruppo proponente ha determinato la struttura ai raggi X (12), quello N-terminale, e mutanti sito-specifici della mano EF3 a più alta affinità per il calcio (e.g. E124A), e dell'elica D che si è ipotizzato trasmetta al resto della molecola l'informazione che il catione si è legato al sito EF3 (e.g. W99G e W105G, già purificati). Verrà anche caratterizzato il mutante F112L poiché questa mutazione della regione tra l'elica D e l'ansa legante il Ca2+ del sito EF3 è presente in una forma familiare di cardiomiopatia ipertrofica (21). La caratterizzazione del mutante, già espresso in E. coli e purificato sia come proteina intera che come dominio C-terminale, contribuirà a far comprendere la base strutturale del fenotipo patologico. Come canali del Ca2+ saranno studiati i recettori della rianodina, RyR1 e RyR2, espressi principalmente nel muscolo scheletrico ed in quello cardiaco, e NCX.
La sorcina lega il RyR tramite il dominio C-terminale (26); la topologia fine dell'interazione però non è nota anche se è presumibile coinvolga la regione intorno all'elica D. Saranno misurati gli eventi localizzati di rilascio del Ca2+ (Ca2+-sparks) generati dal RyR in cardiomiociti isolati di coniglio, perfusi con sorcina, dominio C-terminale e mutanti. Paragonando il loro effetto su frequenza, ampiezza e durata dei Ca2+-sparks si potrà definire la regione specifica del dominio C-terminale coinvolta nell'interazione. Per individuare la regione della sorcina che interagisce con NCX saranno utilizzati esperimenti in vitro e cardiomiociti isolati. In questi ultimi sarà misurato l'effetto della sorcina, dei suoi domini e dei singoli mutanti sulle correnti di membrana in risposta ad una rampa di potenziale sia in assenza che in presenza di NiCl2 che inibisce NCX.
L'identificazione delle superfici di interazione di RyR e NCX è più complessa per le notevoli dimensioni delle regioni citoplasmatiche di queste proteine di membrana. Con la tecnica del "phage display" saranno selezionati, a partire da librerie di fagi che espongono peptidi casuali delle proteine bersaglio, quei peptidi che interagiscono in maniera Ca2+-dipendente con la sorcina immobilizzata su supporti diversi. I parametri cinetici e termodinamici della reazione di legame dei peptidi di RyR e NCX così individuati con la sorcina, determinati mediante esperimenti di risonanza di plasma di superficie, forniranno un quadro generale della rete di interazioni che si stabilisce nella cellula cardiaca a seguito della traslocazione della sorcina dal citosol alle membrane e, pertanto, contribuiranno alla conoscenza delle funzioni di regolazione della sorcina stessa. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Viene riportato il testo del Modello B in quanto al progetto partecipa una sola Unità Operativa.


Lo studio delle strutture sopramolecolari è un tema centrale della biologia moderna perché di queste strutture è ricco il mondo biologico e il ruolo da esse svolto è di importanza fondamentale. Esempi che ne illustrano natura, complessità ed efficienza sono le proteine oligomeriche e i polimeri di actina e tubulina del citoscheletro, i doppi strati lipidici delle membrane, i sistemi multi-enzimatici della respirazione cellulare o i complessi di proteine e acidi nucleici delle strutture cromosomali. Queste strutture sono stabilizzate da forze di interazione debole di natura diversa che contribuiscono al riconoscimento specifico fra i vari componenti e ne permettono assemblaggio e disassemblaggio dinamico in risposta alle esigenze della cellula; anche l'interazione con molecole piccole e ioni può avere rilevanza strutturale e/o funzionale.
Il progetto propone lo studio di due sistemi sopramolecolari diversi; la scelta è dettata dalla conoscenza che ne ha acquisito il gruppo proponente grazie a finanziamenti PRIN (1999, 2001 e 2003) e del Consiglio Nazionale delle Ricerche. Elemento unificatore è l'approccio concettuale, mentre si diversifica in parte quello metodologico; i due sistemi sono pertanto trattati separatamente.
L'interesse che essi rivestono a livello internazionale è comprovato dalla ricca letteratura sulle principali e prestigiose riviste del settore, come appare anche dalla bibliografia citata.

1. Proteine Dps (DNA-binding Proteins from Starved cells) - DNA

Da quando nel 1992 fu scoperta in Escherichia coli la prima Dps, una proteina indotta in condizioni di stress nutrizionale e ossidativo che si lega al DNA senza specificità di sequenza, questa famiglia di proteine ha acquisito importanza crescente nell'ambito dei meccanismi di difesa utilizzati dai batteri per proteggere il DNA dall'azione dannosa di ossidanti e radicali a causa dell'assenza di nucleosomi. In carenza di nutrienti, condizione che si accompagna spesso a stress ossidativo nell'habitat naturale dei batteri e che si verifica in laboratorio nella fase stazionaria di crescita, eventuali lesioni del DNA non possono essere riparate tramite ricombinazione omologa, poiché le cellule in fase stazionaria hanno in genere cromosomi in singola copia e gli enzimi necessari per le reazioni di riparo invece di essere sintetizzati vengono degradati. In E. coli lo stress nutrizionale induce sintesi e accumulo della Dps che diventa il componente principale della cromatina nella fase stazionaria tardiva e protegge il DNA segregandolo in complessi Dps-DNA di natura microcristallina.
Le proteine Dps non si legano con il DNA mediante un motivo strutturale noto, ma con la regione N-terminale della catena polipeptidica, come ipotizzato dapprima in base alla struttura cristallografica della Dps di E. coli (1) e dimostrato poi dal gruppo proponente (2). La Dps di E. coli è un dodecamero cavo formato da subunità uguali, costituite a loro volta da un fascio di quattro eliche antiparallele dal quale si diparte la regione N-terminale, assai flessibile e disordinata, ricca di amino acidi carichi positivamente. Nel dodecamero, caratterizzato da simmetria 23, tali regioni sono situate in prossimità dei canali che si formano a livello degli assi ternari e che permettono l'ingresso del ferro nella cavità proteica; si affacciano verso il solvente e possono quindi interagire con lo scheletro del DNA carico negativamente. Le regioni N-terminali inoltre hanno una disposizione regolare nello spazio, dettata dalla simmetria 23 del dodecamero, che è compatibile con la formazione di complessi Dps-DNA ordinati come quelli osservati nei batteri.
Studi su altri membri della famiglia Dps, che comprende oltre 50 proteine, hanno dimostrato che a causa della variabilità della regione N-terminale, molto ridotta e priva di amino acidi carichi positivamente, molte Dps non legano il DNA. In queste proteine pertanto la protezione del DNA deve essere basata su un altro meccanismo. Le ricerche sulla proteina di Listeria innocua hanno messo in luce sia l'esistenza di una attività ferrossidasica che la sua importanza nel proteggere il DNA dal danno ossidativo. In effetti, tutte le Dps contengon un sito ferrossidasico altamente conservato e catalizzano l'ossidazione del Fe(II) utilizzando acqua ossigenata e riducono così l'azione tossica di questi due composti che producono radicali idrossido (3-8). L'importanza dell'azione anti-ossidante delle Dps è dimostrata anche da studi "in vivo", e.g. su Streptococcus mutans e Porphyromonas gingivalis, due microrganismi che pur essendo privi di catalasi sono in grado di rispondere a stress da perossidi e nei quali la delezione del gene dps provoca una riduzione drastica della vitalità in seguito all'esposizione a specie reattive dell'ossigeno (9, 10).
I problemi ancora aperti sono diversi: non è nota ad esempio la struttura dei complessi Dps-DNA né se essi in alcune condizioni di crescita dei batteri abbiano un significato biologico diverso dalla mera protezione del DNA. Problemi che verranno affrontati nell'ambito di questo progetto di ricerca.


2. Sorcina - canali del Ca2+

La sorcina (SOluble Resistance-related Calcium-bInding protein) appartiene alla famiglia delle proteine PEF (Penta EF-hand Ca2-binding proteins), ed ha come tutti i membri dalla famiglia la proprietà, alla cui individuazione ha contribuito il gruppo proponente (11), di traslocare in maniera reversibile dal citoplasma alle membrane cellulari in seguito alla variazione di conformazione indotta dal legame del Ca2+. Questa determina l'esposizione di gruppi idrofobici che permette l'interazione con proteine bersaglio diverse nei diversi tessuti nei quali è espressa la sorcina. Ne consegue che, come le altre proteine PEF, la sorcina ha funzioni regolatrici ad oggi chiarite solo in parte.
La catena polipeptidica della sorcina è organizzata in due domini: N-terminale (1-32), ricco in glicine tirosine e proline, e C-terminale (33-198) denominato SCBD (Sorcin Ca2+-Binding Domain) in quanto contiene i cinque siti a mano EF e lega il Ca2+, di cui è nota la struttura cristallografica nella forma apo, calcio-priva (12). L'attivazione della proteina indotta dal Ca2+ è del tutto insolita poiché i siti di legame fisiologici, EF2 ed EF3, non sono accoppiati strutturalmente come in tutte le proteine a mano EF, ma sono separati da una lunga alfa elica, l'elica D (13). Il meccanismo proposto è che il Ca2+ si lega al sito EF3, a maggiore affinità per il catione, e che il riarrangiamento dell'elica D che ne consegue permette il trasferimento dell'informazione al sito EF2, e da qui al resto della molecola e in particolare al dominio N-terminale. Complessivamente la variazione strutturale comporta l'esposizione al solvente di una vasta regione idrofobica ed un riorientamento del dominio N-terminale rispetto a quello C-terminale che li rende entrambi disponibili per l'interazione con proteine bersaglio. Tale meccanismo è in accordo con l'osservazione che in vitro la sorcina può interagire contemporaneamente con due proteine bersaglio diverse, annessina VII tramite il dominio N-terminale e recettore della rianodina tramite quello C-terminale.
L'interazione con l'annessina VII, che a sua volta lega il Ca2+, avviene nella midollare del surrene (14), ma ha significato fisiologico ignoto perché tale è la funzione dell'annessina. L'interazione con il RyR, il principale canale del Ca2+ nel reticolo sarcoplasmatico, implica il coinvolgimento della sorcina nel processo di contrazione muscolare in cui il Ca2+, come è noto, ha funzione di secondo messaggero. La partecipazione della sorcina a questo processo è confermata da molti dati ottenuti in vivo soprattutto su cellule cardiache. Questi indicano che la sorcina, a seguito della traslocazione al sarcolemma ed alla membrana sarcoplasmatica, interagisce non solo con il recettore della rianodina (RyR1 e RyR2 rispettivamente nel muscolo scheletrico e cardiaco), ma anche con altri canali del Ca2+ coinvolti nell'accoppiamento eccitazione-contrazione, come i canali del Ca2+ di tipo L, lo scambiatore Na+-Ca2+ (NCX) e la Ca2+-ATPasi del reticolo sarcoplasmatico (SERCA2a) (15-18). Per almeno due di essi, RyR2 e SERCA2a, è stato dimostrato che la sorcina ha un ruolo regolatore: attivata dall'aumento della concentrazione intracellulare di Ca2+, inibisce RyR2 ed attiva SERCA2a e partecipa così alla fase di rilascio del catione e quindi alla decontrazione della fibra muscolare. Molti degli aspetti molecolari di queste interazioni sono ancora ignoti. <<<