RICERCA ITALIANA     

Basi molecolari della citotossicità indotta dai diversi stati di aggregazione di beta amiloide: studio multidisciplinare in vitro, su colture cellulari e su modello animale.

Università degli Studi di Firenze

Abstract

La neuropatologia della malattia di Alzheimer (AD) e’ caratterizzata da marcata perdita di neuroni nella corteccia e nell’ ippocampo, dalla presenza di grovigli neurofibrillari costituiti da depositi intracellulari di materiale proteico e dalla formazione di placche senili a localizzazione extracellulare. Il core delle placche senili è costituito da un nucleo di proteina β-amiloide (Aβ), aggregata in forma fibrillare. L'ipofunzione dei neuroni colinergici nella corteccia ed ippocampo contribuisce significativamente al decadimento cognitivo associato alla AD. Le cause della neurodegenerazione rimangono ancora sconosciute e l’ipotesi della “cascata amiloidea” identifica nelle fibrille Aβ la causa principale del danno neuronale. In accordo con questa ipotesi, i monomeri di Aβ nel tessuto cerebrale subiscono con il tempo delle modifiche conformazionali e si aggregano a formare oligomeri, protifibrille e fibrille arrivando infine a depositarsi come placche senili. Nonostante i numerosi studi su questo argomento non è ancora definito se questo è un processo inevitabile ed irreversibile, così come rimane da chiarire quale sia il ruolo biologico di Aβ nei suoi diversi stadi di aggregazione. Nella tossicità di Aβ un ruolo importante sembra essere svolto dallo stress ossidativo e un numero sempre maggiore di dati riporta che l’interazione tra Aβ e Cu2+, Fe2+ e Zn2+, intrinseci al cervello, induce sia l’aggregazione che la tossicità del peptide attraverso la produzione di H2O2. Nell’AD il danno ossidativo è mediato dalla generazione di H2O2 e l’attività scavenger degli enzimi risulta probabilmente sopraffatta dall’ elevata quantità di H2O2 generato dalla Aβ. Attualmente, la ricerca è indirizzata allo sviluppo di farmaci per l’AD che vadano ad interferire direttamente sui target patogenetici. Tra le sostanze in grado di bloccare la cascata della Aβ gli agenti metallo-chelanti rappresentano un potenziale approccio terapeutico. Questo progetto si pone l’obiettivo di chiarire il ruolo degli oligomeri e delle fibrille di Aβ nella morte neuronale mediata da stress ossidativo, alterazione dell’omeostasi intracellulare del calcio e attivazione di vie apoptotiche. In particolare studieremo gli specifici meccanismi intracellulari che si verificano durante un processo neurodegenerativo nel quale è stato dimostrato che la produzione di radicali liberi è il principale agente causale. Inoltre verificheremo l’azione di composti con proprietà antiossidante (es. esteri e tioesteri del glutatione) e di composti noti per essere in grado di interferire con la fibrillogenesi di Aβ (es. cliochinolo) sul processo neurotossico indotto da Aβ. La ricerca implicherà la stretta collaborazione tra le unità proponenti nelle diverse condizioni sperimentali: i) in vitro: studi di cinetica e delle condizioni microambientali che influenzano l’aggregazione di Aβ, ii) in cellule in coltura: studi delle più importanti vie attivate dallo stress ossidativo, e iii) in un modello animale in vivo: studi di validazione in vivo dei risultati ottenuti in vitro e nelle cellule in coltura.
Il modello fenomenologico del processo di citotossicità indotto dal misfolding-aggregazione di Aβ che emergerà da queste ricerche e da quelle connesse, permetterà di descrivere tale processo dalla aggregazione della proteina al danneggiamento delle funzioni e morte cellulare, fornendo dati utili a descrivere, a livello molecolare, la patogenesi delle malattie amiloidi; la disponibilità di tali conoscenze è fondamentale per progettare strategie terapeutiche mirate a risolvere tali malattie. Lo studio in vivo nel topolino transgenico dei benefici dovuti alla riduzione della tossicità della β-amiloide con l’agente metallo-chelante cliochinolo, valutati sulla funzione dei neurotrasmettitori e prestazioni cognitive, fornirà informazioni utili ai clinici nella messa a punto di nuove strategie terapeutiche nell’AD. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Gianfranco LIGURI Università degli Studi di FIRENZE

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il progetto di ricerca si propone di chiarire con esperimenti in vitro, in cellule in coltura e in un modello animale le basi molecolari della morte neuronale dopo esposizione di specie misfolded e aggregate di Aβ. In colture di cellule di neuroblastoma umano e di fibroblasti di pazienti Alzheimer verranno studiate le basi strutturali, molecolari e biologiche della formazioni di aggregati di Aβ e della loro citotossicità e la diversa vulnerabilità delle cellule alla tossicità di distinte specie strutturali del peptide. In particolare approfondiremo i meccanismi coinvolti nelle cascate di specifiche vie intracellulari attivate, nei processi neurodegenerativi, da un eccessiva produzione di radicali liberi. Inoltre sulla neurotossicità indotta da Aβ saranno studiati gli effetti di molecole ad attività antiossidante (come gli esteri i tioesteri del GSH ) e molecole ad attività antiaggregante (come il cliochinolo). L’obiettivo principale del progetto di ricerca è quello di rispondere alle seguenti domande: 1) come i diversi stati di aggregazione di Aβ influenzino la funzione neuronale; 2) il ruolo dei radicali liberi e l’omeostasi del calcio nella tossicità di specifiche conformazioni di Aβ; 3) quali vie di trasduzione del segnale ed apoptotiche sono coinvolte, e 4) se è possibile identificare molecole capaci di aumentare le difese cellulari verso la tossicità di Aβ o spostare l’equilibrio dei diversi stati di aggregazione di Aβ così da avere specie di Aβ meno dannose.
In particolare saranno perseguiti i seguenti punti:
1) capire se le diverse specie di aggregati di Aβ (fibrille e oligomeri) mostrino o meno una diversa attività, sia in termini di intensità che di cinetica. Se ciò sarà osservato, possiamo assumere che i diversi stati di aggregazione del peptide attivino vie intracellulari che portano alla morte neuronale. Inoltre, obiettivo di questa parte del progetto è di capire se le diverse conformazioni di Aβ siano in equilibrio tra loro in modo da spostare l’equilibrio ed ottenere specie meno aggregate.
2) Stabilire la relazione tra danno cellulare e livelli di aggregati pre-fibrillari e di fibrille mature di Aβ mediante la valutazione di modificazioni biochimiche importanti, note come attivazione di vie apoptotiche, riduzione delle difese antiossidanti ed alterazione dell’omeostasi del calcio, che intervengono in cellule esposte a questi aggregati e mediante valutazione della citotossicità degli aggregati Aβ in colture cellulari.
3) Stabilire l’attivazione sequenziale delle vie intracellulari NFkB e p53 da stress ossidativo conseguente ad esposizione delle cellule ad aggregati di Aβ. Ed ancora più importante sarà capire quale stato conformazionale di Aβ (fibrille o oligomeri) attivi le risposte intracellulari che coinvolgono i segnali intracellulari NFkB/p53.
4) Stabilire se la tossicità di Aβ è mediata da radicali liberi mediante valutazione di sostanze antiossidanti come gli esteri del glutatione.
5) Migliorare le conoscenze dei meccanismi coinvolti nell’azione terapeutica di agenti metallo chelanti nell’ AD mediante valutazione in vivo della relazione esistente tra deposizione di Aβ ed alterata funzionalità dei neuroni colinergici del proencefalo basale e compromissione delle funzioni cognitive in un modello animale di topo transgenico.
Il modello fenomenologico del processo di citotossicità indotto dal misfolding-aggregazione di Aβ che emergerà da queste ricerche e da quelle connesse, permetterà di descrivere tale processo dalla aggregazione della proteina al danneggiamento delle funzioni e morte cellulare, fornendo dati utili a descrivere, a livello molecolare, la patogenesi delle malattie amiloidi; la disponibilità di tali conoscenze è fondamentale per progettare strategie terapeutiche mirate a risolvere tali malattie. Lo studio degli effetti del trattamento con sostanze metallo-chelanti e antiossidanti sulle funzioni di neutrotrasmissione e cognitiva fornirà informazioni utili ai clinici nella messa a punto di nuove strategie terapeutiche nell’AD. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La neuropatologia della malattia di Alzheimer (AD) e’ caratterizzata da marcata perdita di neuroni colinergici nella corteccia e nell’ippocampo, dalla presenza di grovigli neurofibrillari costituiti da depositi intracellulari di materiale proteico e dalla formazione di placche senili a localizzazione extracellulare. Il core delle placche senili è costituito da un nucleo di proteina β-amiloide (Aβ) in forma fibrillare (1,2). L'ipofunzione dei neuroni colinergici nella corteccia e nell'ippocampo contribuisce significativamente al decadimento cognitivo associato alla AD (3).
Le placche neuritiche sono quasi esclusivamente costituite dalla forma altamente amiloidogenica del peptide composta da 42 aminoacidi (Aβ1-42). Questa forma è normalmente prodotta dalle cellule in quantità molto minore della forma con 40 residui (Aβ 1-40). Aβ1-42 tende più facilmente ad aggregare di Aβ 1-40 e la sua citotossicità è considerata la causa principale del danno neuronale in AD (99). E’ stato osservato, in pazienti affetti da AD di tipo familiare (FAD), un precoce aumento della produzione di Aβ1-42 che deriva dal processamento intracellulare della proteina precursore (APP) (4). E' interessante notare che le mutazioni associate con i casi FAD conducono tutte, indipendentemente, ad un aumento della produzione dell' Aβ (5). Le forme autosomiche dominanti di casi precoci di FAD sono spesso caratterizzate da specifiche mutazioni del gene localizzato sul cromosoma 21 codificante l’APP, o dei geni mappati sui cromosomi 14 e 1, codificanti la presenilina-1 (PS-1) e la presenilina-2 (PS-2), identificate come probabili gamma secretasi (6). Fisiologicamente Aβ si forma in seguito al taglio proteolitico di APP da parte di alfa, beta e gamma secretasi. Un crescente numero di dati indica che interazioni tra Aβ e rame, ferro e zinco sono associate con la patofisiologia di AD. Questi metalli provocano la aggregazione e la neurotossicità di Aβ. Agenti chelanti, come il cliochinolo, offrono una potenziale soluzione terapeutica alla neurotossicità indotta dall’alterata omeostasi dei metalli (7). Nonostante i casi di AD familiari siano una piccola percentuale (meno del 5%) dei totali, questi dati sottolineano il ruolo patogenetico del metabolismo di APP e della deposizione di Aβ e suggeriscono un ruolo per l'Aβ nelle forme di AD non ereditarie, dal momento che le caratteristiche delle forme familiari e sporadiche dell'AD sono molto simili. Recenti scoperte di molti gruppi di ricerca internazionali sull’aggregazione proteica come chiave e caratteristica comune a diverse malattie neurodegenerative ha aperto nuove frontiere per comprendere il meccanismo alla base della cosiddetta “ipotesi amiloide” dell’AD (8-10, 100).
Questa ipotesi presuppone che inizialmente il taglio enzimatico di APP sia responsabile del rilascio di frammenti Aβ in forma monomerica nell’ambiente extracellulare. Dopo un certo periodo di tempo, i monomeri di Aβ nel tessuto cerebrale subiscono delle modifiche conformazionali e si aggregano a formare oligomeri, protifibrille e fibrille arrivando infine a depositarsi come placche senili. Non è ancora ben definito se si tratti di un processo inevitabile ed irreversibile, così come rimane da chiarire quale sia il ruolo biologico di Aβ nei suoi diversi stadi di aggregazione. La regolazione di questo processo di assemblaggio potrebbe essere mediata da fattori quali la concentrazione di Aβ (11), gli ioni metallici (12,13), i radicali liberi (14) ed un ampia gamma di proteine come la laminina (15), la transtiretina (16), la melatonina (17) l’alfa-1 antichimotripsina (18,19), l’acetilcolinesterasi (20) e l’apolipoproteina E (21,22).
Attualmente l’ipotesi amiloide è supportata da numerose scoperte effettuate in vitro e in vivo su varie proteine amiloidogeniche, che evidenziano un effetto citotossico diretto degli aggregati amiloidi. E’ noto che la neurotossicità è guidata da specifici aggregati intermedi dell'Aβ, cosi come quelli di altre proteine amiloidogeniche come alfa-sinucleina o transtiretina, che si formano precocemente durante il processo di fibrillogenesi, mentre le fibrille mature sono molto meno tossiche (23,28). La tossicità di Aβ dipende dallo stato di fibrillazione del peptide (29,30). Infatti, in molti casi, la neurotosscità del peptide era associata all’acquisizione di uno stato conformazionale a foglietti β ripiegati (31). Inoltre, a seconda del tempo di incubazione utilizzato in vitro per Aβ40/ Aβ42, alcuni preparati contengono una vasta gamma di forme di Aβ ed alcune di queste, se non tutte, possono manifestare attività citotossica. Inoltre Aβ, sia esso in forma monomerica, oligomerica o sotto forma di larghe fibrille, è in grado di formare pori nelle membrane cellulari permettendo in questo modo l’ingresso di ioni che alterano la cascata dei segnali intracellulari ed attivano i processi di apoptosi (32,101).
Nonostante non si conoscano le cause della formazione delle placche di Ab, questi depositi fibrillari rimangono i principali imputati per l’insorgenza del processo neurodegenerativo sia nei casi di AD familiare sia in quelli sporadici.
Un numero sempre maggiore di evidenze sperimentali suggerisce che lo stress ossidativo rivesta un ruolo centrale nella patogenesi dell’AD (33). Ulteriori scoperte legano la formazione di radicali liberi ad un’eccesiva deposizione di Aβ (34,102). L’abilità dei peptidi tossici Aβ di indurre l’ossidazione delle proteine e di inibire l’attività degli enzimi sensibili all’ossidazione avvalora l’ipotesi che Aβ possa agire come un agente pro-ossidante (35-38). In aggiunta ai numerosi studi che supportano l’ipotesi della formazione dei radicali liberi nella tossicità indotta da Ab, un rilevante numero di osservazioni sperimentali suggerisce che il danno ossidativo preceda l’eccessiva formazione di Ab. Ad esempio, lo stress ossidativo (H2O2) induce un incremento della formazione di Ab nella cornea di mammifero (39). Il blocco del complesso IV della catena del trasporto degli elettroni ottenuto in vitro con l’utilizzo di sodio azide induce un aumento della produzione di frammenti amiloidogenici di APP (40). Le cellule che riportano la mutazione Svedese sul gene della proteina precursore dell’amiloide sono maggiormente sensibili allo stress ossidativo indotto da H2O2 rispetto alle cellule sane (41). Inoltre H2O2 e Hg, che alterano il metabolismo cellulare ed inducono stress ossidativo, provocano un’aumentata produzione di Ab 1-42 nelle cellule SH-SY5Y (42-44).
Alcune regioni del sistema nervoso centrale di pazienti AD presentano una maggiore sensibilità ai radicali liberi dell'ossigeno che potrebbe essere causata da una diminuzione delle difese antiossidanti o un aumento nella produzione dei radicali liberi, o entrambe (45). L'accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS) provoca il danneggiamento delle principali macromolecole cellulari come i lipidi, le proteine e gli acidi nucleici (46). Le modificazioni ossidative indotte dai radicali liberi sui lipidi, le proteine e il DNA nucleare sono particolarmente estese nelle aree del sistema nervoso centrale dove l'Aβ è abbondante (47). Inoltre, il processo di lipoperossidazione sembra in grado di influenzare la patogenesi della malattia. Infatti, il 4-idrossinonenale (4-HNE), i cui livelli risultano aumentati nei pazienti AD, sembra essere tossico ed indurre la morte neuronale alterando le ATPasi implicate nella omeostasi del calcio (48). L'encefalo in condizioni normali è protetto dai danni ossidativi dalle difese antiossidanti, che comprendono enzimi antiossidanti e gli scavenger dei radicali liberi quali l'ascorbato, la vitamina E ed i gruppi sulfidrilici delle proteine. Durante gli ultimi anni, i risultati di molte indagini hanno fornito evidenze consistenti all'ipotesi che una diminuzione nella capacità antiossidante totale cellulare (TAC) potrebbe svolgere un ruolo centrale nella patogenesi dell'AD. Le attività degli enzimi antiossidanti superossidodismutasi (SOD) e catalasi (CAT) sono risultate essere significativamente diminuite nella corteccia frontale e temporale dei pazienti AD (45). La perdita neuronale mediata da stress ossidativo può essere innescata da una riduzione dei livelli di glutatione (GSH), l'agente riducente più abbondante nei tessuti dei mammiferi, con funzione di scavenger dei radicali liberi. E' stato infatti evidenziato come i livelli di GSH siano alterati in specifiche regioni del sistema nervoso centrale dei pazienti AD (51). Recentemente, è stata dimostrata una diminuzione significativa nel contenuto di GSH nei linfoblasti di pazienti FAD con mutazioni geniche APP, PS1 e PS2 rispetto ai linfoblasti di soggetti sani (52). Gli incrementi di GSH si sono rivelati determinanti nella modulazione dei livelli di ROS nell’encefalo (53).
Ricerche precedenti (54) hanno dimostrato che neuroni post-mitotici esposti alla proteina β-amiloide (βA) rientrano in un ciclo cellulare aberrante prima di morire per apoptosi. Inoltre, i neuroni esposti alla βA esprimono la primasi, ma eseguono la sintesi del DNA neuronale con la DNA polimerasi-β, un enzima solitamente riparativo (55,56). In altre ricerche (57-59), in colture di cellule astrogliali trattate con diverse concentrazioni di INF-gamma; e LPS, è stato messo in evidenza che l’induzione della iNOS causava un aumento compensatorio dell’espressione degli mRNAs e delle subunità proteiche di alcuni enzimi della catena respiratoria mitocondriale, e un aumento dell’attivazione dell’HSF-1 (fattore di trascrizione per la sintesi delle HSPs) e dell’espressione di HSP90, HSP70, HSP60, HSP27 e Hsp 32, preceduto dalla attivazione dell’HSF-1. Nello stesso modello sperimentale è stato osservato anche un caratteristico pattern di espressione dell’enzima poli-(ADP-ribosio)-polimerasi (PARP), specificamente correlabile con meccanismi di morte cellulare sia apoptotica che necrotica e con l’attivazione dei processi di riparazione (60-62). E’ verosimile ipotizzare che diverse isoforme della PARP possano determinare risposte differenti allo stress in molti fenomeni neurodegenerativi (63-66) e che il ruolo più importante possa essere quello di sensore dell'integrità del DNA (67). Un ruolo chiave nell’induzione dell’espressione della iNOS, coinvolta in diverse patologie neurodegenerative (68,69), è rappresentato dalla via di trasduzione del segnale delle proteine JAK STAT, attraverso l’IRF-1 (70-73). La JAK-2 e la STAT-1a/b attivate potrebbero essere possibili bersagli per trattamenti terapeutici (74).
Gli aggregati oligomerici di peptidi tossici, le specie reattive dell’ossigeno e dell’ossido nitrico appaiono quindi svolgere un ruolo fondamentale nelle patologie neurodegenerative derivanti da alterazioni conformazionali proteiche (PCDs), tuttavia sono necessarie ulteriori indagini per chiarire i processi molecolari responsabili dell’aggregazione, con particolare attenzione alla formazione di “Advanced glycation end products” (AGE) e alla risposta pro-infiammatoria mediata dal RAGE, recettore degli AGE (75).
Diversi lavori hanno recentemente mostrato la diminuzione delle attività proteasomali in cervelli di pazienti AD (76-79). Nelle patologie neurodegenerative, la presenza di una disfunzione di tipo sporadico o ereditario nel sistema ubiquitina-proteasoma è stata ipotizzata come possibile causa del progressivo accumulo intraneuronale di depositi di proteine danneggiate (81,82). Un’altra teoria si basa sull’ipotesi che la disfunzione del complesso proteasomale sia dovuta al legame di PHF-tau al proteasoma 20S, suggerendo che l’alterazione della funzionalità proteasomale potrebbe essere un evento iniziale e cruciale nello sviluppo della patologia AD (83). L’inibizione del proteasoma è stata anche correlata ad un aumento dell’espressione di chaperoni (84). In dettaglio è stato illustrato come hsp40 e hsp70 siano implicati nella patogenesi AD (85). I membri della famiglia delle hsp svolgono un ruolo chiave nella marcatura di substrati proteici e nell’assistere l’unfolding proteico necessari alla degradazione proteasomale, quindi l’elevata espressione di hsp riscontrata nei cervelli di pazienti AD potrebbe essere importante per preservare la funzionalità proteasomale (86).
Il rapporto tra la generazione di ROS e la disomeostasi di ioni di metalli quali Cu, Fe e Zn è attualmente considerato un fattore età-dipendente che induce la neurotosscità del β-amiloide. Inoltre, un crescente numero di dati indicano che interazioni tra Aβ e rame, ferro e zinco sono associate con la patofisiologia di AD(104). Questi metalli, anche a livello di tracce, sono in grado di innescare la aggregazione di Aβ e la neurotossicità. Il complesso di Aβ solubile con Cu e Fe produce elevati livelli di perossido di idrogeno che è neurotossico in vitro (87). Nell’AD il danno ossidativo è mediato dalla generazione del perossido di idrogeno e l’attività scavenger degli enzimi, quali catalasi e glutatione perossidasi, risulta probabilmente sopraffatta dall’ elevata quantità di perossido di idrogeno generato dalla Aβ (88,89). In vitro l’ aggregazione della Aβ indotta da Cu Zn è mediata dalla conformazione alfa-elica della proteina ed è rimossa dai chelanti (90,91). Elevati livelli di Cu, Zn e Fe sono stati descritti nei depositi amiloidi in cervelli di pazienti AD (92) e Cherny et al.(93) hanno riportato che i chelanti del Cu/Zn solubilizzano l’Aβ in campioni autoptici di cervello di pazienti AD. Studi recenti condotti sul topolino transgenico Tg2576 dimostrano la presenza di Fe (94) e Zn (95) nei depositi cerebrali di Aβ e che il trattamento con l’antibiotico cliochinolo, un agente chelante del Zn e Cu, induce una rapida diminuzione della deposizione di Aβ (96). Aβ mostra una elevata affinità per il Cu, Zn e Fe (89). La combinazione della Aβ con questi metalli, intrinseci al cervello, induce la tossicità del peptide attraverso la produzione di perossido di idrogeno e la sua aggregazione. Su queste basi, la ricerca moderna è indirizzata allo sviluppo di farmaci per l’AD che vadano direttamente ad interferire sui target patogenetici. Tra le sostanze in grado di bloccare la cascata della β-amiloide gli agente metallo-chelanti rappresentano attualmente un potenziale approccio terapeutico (97). Quindi, molecole leganti il rame, quali il cliochinolo e la batocuproina disulfonato, possono fornire uno strumento razionale per contrastare la neurotossicità indotta da disomeostasi dei metalli (7,103).
Nell’ultimo decennio sono stati creati topolini transgenici che esprimono uno o due geni umani mutati, gli stessi delle forme familiari di AD, e sviluppano placche senili con elevati livelli di Aβ nel parenchima cerebrale e mostrano compromissione delle funzioni cognitive. Recentemente, è stata creata una nuova linea di topolini transgenici, i TgCRND8 che esprimono la βAPP695 umana mutata (K670N/M671L e V717F). Questi topolini transgenici mostrano un’estesa deposizione di Aβ ed una grave compromissione delle attività cognitive già a 3 mesi di età (98). Non è ancora noto se la deposizione di Aβ e la compromissione dell'attività cognitiva nei topolini transgenici si associno a perdita e/o ipofunzione dei neuroni colinergici del proencefalo basale come è stato osservato nell'AD.
Questo progetto si pone l’obiettivo di chiarire il ruolo degli oligomeri e delle fibrille di Aβ nella morte neuronale mediata da stress ossidativo, alterazione dell’omeostasi intracellulare del calcio e attivazione di vie apoptotiche. In particolare verranno studiati gli specifici meccanismi intracellulari che si verificano durante un processo neurodegenerativo nel quale è stato dimostrato che la produzione di radicali liberi è il principale agente causale. Inoltre sarà verificata l’azione di composti con proprietà antiossidante (es. esteri e tioesteri del glutatione) e di composti noti per essere in grado di interferire con la fibrillogenesi di Aβ (es. cliochinolo) sul processo neurotossico indotto da Aβ. <<<