RICERCA ITALIANA     

Canali del sodio, calcio e potassio neuronali: ruolo fisiologico e canalopatie

Università degli Studi di Torino

Abstract

I canali ionici voltaggio-dipendenti sono proteine integrali di membrana attivate dal potenziale che si sono selezionate durante l'evoluzione per consentire il passaggio di ioni quali Na, K, Ca e Cl, fra l'esterno e l'interno della cellula. Tutti gli animali, e naturalmente l'uomo, utilizzano nei vari tessuti la capacità dei canali ionici di condurre ioni attraverso la membrana in entrambe le direzioni e quindi di generare potenziali d'azione capaci di sostenere l'eccitabilità cellulare, controllando processi cruciali per la vita, quali la trasmissione nervosa, la trasduzione sensoriale, la contrazione muscolare, la plasticità sinaptica e i processi di apprendimento e memoria. Il controllo di queste funzioni fisiologiche richiede normalmente un numero assai limitato di canali ionici, che è di molto inferiore al numero di geni che il nostro genoma possiede (più di 60 geni per i canali del K, 10 per i canali del Ca e 9 per i canali del Na). Capire il ruolo e la funzione di ciascuno di essi è stata, e rimane, la "grande sfida" dei neuroscienziati interessati a questo tipo di problematica.

Oltre a ciò, esiste un ulteriore ordine di complessità legata al fatto che: 1) il funzionamento delle strutture proteiche che formano il poro è spesso associato ad altre strutture proteiche (subunità accessorie) che regolano il grado di espressione e di funzionalità del canale, 2) alcuni secondi messaggeri attivati da specifici recettori di membrana sono in grado di interagire con i canali ionici modulandone l'attività. E' ovvio quindi che il mal funzionamento di uno qualsiasi di questi fattori e/o semplici mutazioni geniche (canalopatie) in grado di indurre cambiamenti al funzionamento del canale o all'interazione con le subunità accessorie possano indurre gravi neuropatologie. In tal caso, capire le cause delle canalopatie e le conseguenze delle mutazioni geniche che codificano per i canali ionici può portare ad importanti scoperte sul ruolo dei canali voltaggio-dipendenti nei fenomeni di eccitabilità neuronale.

In questo progetto un gruppo internazionalmente qualificato di neuroscienziati italiani ha deciso di coordinarsi col duplice scopo di studiare il ruolo funzionale dei canali neuronali del Na, Ca e K e le origini di importanti canalopatie ad essi associate. Ciò permetterebbe di progettare nel prossimo futuro specifiche terapie di trattamento o prevenzione per gravi neuropatologie. In tal senso verrebbe continuato il lavoro iniziato già da precedenti progetti PRIN (1997-2005) coordinati dal prof. Wanke (Unità di Milano) che hanno portato ad eccellenti risultati sul piano delle pubblicazioni scientifiche (57 lavori negli ultimi 4 anni su riviste ad alto impact factor) e ad un'accresciuta immagine a livello internazionale dell'elettrofisiologia dei canali ionici.

Le competenze specifiche che i responsabili delle cinque Unità operative hanno acquisito in questi anni hanno rappresentato la base di partenza per definire gli obiettivi dei singoli progetti scientifici. L'aspetto più caratterizzante di questo progetto è infatti l'omogenea professionalità dei partecipanti, tutti esperti di canali ionici, canalopatie e problematiche elettrofisiologiche che hanno deciso di collaborare scambiandosi le loro competenze su diversi tipi di canali (Na, Ca, K), preparati neuronali (cervelletto, ippocampo, corteccia, nuclei vestibolari, gangli trigeminali), canalopatie (emicrania, atassia, epilessia), topi transgenici, KI e KO per vari canali (P/Q, Kv1.1, ERG1b) e, soprattutto, utilizzando diverse metodologie di misura disponibili nelle varie Unità (correnti ioniche di membrana, potenziali d'azione misurati con matrici di microelettrodi, segnali post-sinaptici evocati e in miniatura, capacitanza, Ca imaging, microscopia confocale). Se il progetto verrà finanziato sarà possibile guardare al ruolo dei canali ionici e alle canalopatie in maniera più dettagliata, con approcci diversificati e tecniche d'avanguardia già utilizzate a livello internazionale. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Emilio CARBONE Università degli Studi di TORINO

Obiettivo del Programma di Ricerca

Come già detto nell'Abstract, il progetto nazionale che viene proposto per il biennio 2005-2007 è il naturale proseguimento di quello già proposto e finanziato per il periodo 1997-2005 con un sostanziale ridimensionamento delle Unità partecipanti (da 9 a 5) ed una maggiore focalizzazione dell'obiettivo sul ruolo funzionale dei canali neuronali voltaggio-dipendenti del Na, Ca e K e sulle principali canalopatie ad essi associati. Un tale ridimensionamento, ha il duplice scopo di centrare la problematica dei canali ionici su un solo tipo di organo (il sistema nervoso centrale) e di poter permettere un più proficuo scambio di conoscenze su diversi preparati neuronali (neuroni in coltura, preparati monosinaptici e autaptici, reti neuronali e fettine di cervello) e sulle più moderne metodologie attualmente utilizzate per la registrazione di segnali elettrici. Quindi l'elemento unificante di questo progetto è proprio la possibilità per le varie Unità di collaborare proficuamente mettendo in comune le proprie esperienze sperimentali sui vari preparati neuronali e su alcune complesse metodologie che non potrebbero essere assolutamente sviluppate in un unico laboratorio di ricerca di dimensioni Universitarie e che sono indispensabili per ottenere informazioni complete sul ruolo dei canali e le cause delle canalopatie a vari livelli di complessità neuronale (singolo neurone, reti neuronali, cervello intero).

Per dare un'idea delle molte problematiche che verranno affrontate ma anche della loro estrema omogeneità, di seguito sono elencati i titoli dei progetti delle cinque Unità partecipanti (elencati in ordine di iscrizione), mentre nello schema successivo (Fig. 1) sono riassunti gli aspetti caratteristici di ciascun progetto, indicando il tipo di canale, le canalopatie, i neuroni e le metodologie utilizzate.

E. Carbone (Torino):
ESPRESSIONE, MODULAZIONE E RUOLO DEI CANALI DEL CALCIO PRESINAPTICI: IMPLICAZIONI NELLE CANALOPATIE E NELLE ALTERAZIONI DELL'ECCITABILITÀ NEURONALE.
E. Wanke (Milano):
CANALOPATIE DEI CANALI VOLTAGGIO-DIPENDENTI NA+ E K+ NEL SISTEMA NERVOSO CENTRALE: STUDI AVANZATI CON METODICHE MEA (MULTIELECTRODE ARRAYS)
D. Pietrobon (Padova):
CANALI DEL CALCIO NEURONALI ED EMICRANIA: STUDI FUNZIONALI SU TOPI KNOCKIN CON MUTAZIONI ASSOCIATE AD EMICRANIA EMIPLEGICA FAMILIARE.
F. Tempia (Torino):
CANALI DEL POTASSIO VOLTAGGIO-DIPENDENTI KV3 ED ERG IN CELLULE NEURONALI: RUOLO FISIOLOGICO E CANALOPATIE
M. Pessia (Perugia):
FUNZIONI NEUROFISIOLOGICHE E MECCANISMI DI MODULAZIONE DEI CANALI DEL POTASSIO VOLTAGGIO-DIPENDENTI KV1.1 ED ERG IMPLICATI IN CANALOPATIE UMANE.






Fig. -1-


Come appare evidente dai titoli e dallo schema riassuntivo esistono due principali obiettivi comuni all'interno del progetto, uno rivolto al ruolo dei canali del K (Kv1.1, Kv3.4 ed ERG) nel quale sono coinvolti le Unità di Milano (Wanke), Torino (Tempia) e Perugia (Pessia) e l'altro rivolto al ruolo dei canali del Ca nella trasmissione sinaptica (P/Q, N ed R) e al coinvolgimento del canale P/Q (Cav2.1) in alcune forme di emicrania emiplegica nel quale sono implicati le Unità di Torino (Carbone) e Padova (Pietrobon). Un terzo obiettivo riguarda invece il ruolo dei canali Nav1.6 nel funzionamento di neuroni subtalamici e l'utilizzo di nuove tossine di scorpione che potrebbero essere utilizzate nella cura del morbo di Parkinson e vedrà coinvolto principalmente il gruppo di Milano che verrà affiancato in parte dall'Unità di Torino (Tempia).

Sebbene focalizzati su temi originali e ben precisi i cinque gruppi tuttavia collaboreranno tra loro in maniera coordinata per dare il supporto necessario a ciascun partner affinché venga identificato meglio il ruolo fisiologico dei diversi tipi di canali studiati. In quest'ottica le tre linee di ricerca sui canali del Na, Ca e K procederanno in parallelo interagendo però tra loro attraverso progetti che prevedono collaborazioni basate sullo scambio di modelli animali (topi transgenici, KI e KO), di metodologie di tipo strumentale (MEA, registrazioni di correnti postsinaptiche, Ca imaging, capacitanza, amperometria), di tipo fisiologico (neuroni in coltura, fettine di cervello e iniezioni intracraniche in diverse regioni del SNC) e di tipo biologico (single-cell RT-PCR, preparazione di chimere proteiche, immunoistochimica).

Le Unità che studieranno i canali del K (Milano, Perugia, Torino) sono orientate ad approfondire i possibili ruoli dei canali Kv3, Kv1.1 ed ERG le cui funzioni sono in diversa misura quella di determinare la fase di ripolarizzazione e la durata dei bursts dei potenziali d'azione. Tutti e tre i tipi di canali appaiono anche implicati in svariate malattie neurologiche che vanno dalla atassia episodica di tipo 1 a vari tipi di epilessie. Le Unità di Milano e Torino che in passato hanno già studiato il canale ERG sia nel tessuto nervoso (Tempia) che in cellule neuroendocrine (Wanke) con approcci diversi, collaboreranno strettamente per identificare meglio le funzioni di ERG nelle cellule del Purkinje in fettine di cervelletto e con l'uso dei MEA il ruolo di ERG nell'eccitabilità di reti neuronali ippocampali. Per questi studi verranno utilizzati anche topi transgenici e tossine selettive per i vari tipi di ERG a cui parteciperà anche l'Unità di Perugia (Pessia). Questa ultima Unità, focalizzerà invece la sua attenzione sulle proprietà del canale Kv1.1 largamente espresso nei nuclei vestibolari ed implicato in varie forme di atassia episodica, in alcuni casi associate a stati epilettici. Verranno utilizzati principalmente topi KO per il canale Kv1.1 universalmente accettati come modelli murini di atassia episodica di tipo 1. Per completare questi studi è prevista anche una stretta collaborazione con l'Unità di Torino (Carbone) per evidenziare il ruolo di Kv1.1 nel controllo della trasmissione sinaptica in cellule ippocampali di topi WT e KO.

Le Unità che studieranno i canali del Ca (Torino e Padova) focalizzeranno la loro attenzione sul ruolo dei canali del Ca presinaptici nel controllo della trasmissione nervosa in cellule ippocampali (Torino, Carbone) e sulle mutazioni dei canali P/Q in neuroni della corteccia cerebrale coinvolti nella generazione della "cortical spreading depression" che scatena alcuni tipi di emicrania (Padova, Pietrobon). La decennale esperienza nel campo dei canali del Ca delle due Unità faciliterà lo svilupparsi di alcuni progetti comuni e lo scambio di risultati mirati al ruolo specifico dei canali P/Q nel controllo della neurotrasmissione. Allo scopo, l'Unità di Padova metterà a disposizione dell'Unità di Torino il topo KI che mima una canalopatia umana dei canali P/Q (FHM-1) associata all'emicrania e l'Unità di Torino affiancherà l'Unità di Padova nell'analisi dei parametri elementari associati alle correnti postsinaptiche in sinapsi eccitatorie e inibitorie di corteccia e di ippocampo in topi WT e KI. Le due Unità infine collaboreranno in un progetto comune focalizzato sul ruolo dell'inibizione presinaptica mediata da G-proteine sui canali P/Q e N in cellule ippocampali e di corteccia allo scopo di individuare possibili meccanismi di base che possano essere usati per lo sviluppo di terapie contro l'emicrania o altre neuropatologie. L'unità di Padova collaborerà anche strettamente con l'Unità di Milano per utilizzare la tecnica dei MEA per registrazioni di potenziali sinaptici locali in fettine acute della corteccia somatosensoriale di topi WT e KI, mentre l'Unità di Torino collaborerà con l'Unità di Milano per studiare l'eccitabilità di neuroni ippocampali in coltura a vari stadi di differenziamento neuronale e in condizioni di alterata eccitabilità indotta dal KO del canale P/Q e dei canali Kv1.1 e ERG-1b, utilizzando la tecnica dei MEA. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

I canali ionici sono strutture proteiche centrali per il funzionamento del sistema nervoso e ne condizionano fortemente lo sviluppo, la maturazione e l'insorgere di patologie. Nell'ultimo ventennio abbiamo assistito ad un continuo fiorire di lavori mirati all'identificazione molecolare e funzionale delle varie classi di canali del Na, Ca e K, tanto che al momento si conoscono un numero elevatissimo di canali del K (più di 60), 10 tipi di canali del Ca e 9 tipi di canali del Na, con specifiche peculiarità molecolari e funzionali (Hille, 2001).
Molte funzioni sono note ma molte restano da chiarire, come per esempio: 1) le basi molecolari del gating dei canali del Na, Ca e K, 2) il ruolo dei diversi sottotipi di canali del Na che supportano il firing di neuroni centrali, 3) la distribuzione ed il ruolo dei diversi tipi di canali del Ca presinaptici responsabili della deplezione e del ripristino delle vescicole secretorie, 4) il ruolo dei diversissimi tipi di canali del K che determinano la fase di ripolarizzazione dei potenziali d'azione e la loro frequenza di firing. Questi sono solo pochissimi dei tanti problemi ancora insoluti, relativi al ruolo dei canali ionici voltaggio-dipendenti. Su tutto questo si è aperto recentemente un ulteriore vastissimo capitolo di interesse clinico che riguarda un numero crescente di patologie strettamente associate a mutazioni strutturali dei canali (le canalopatie) che sono identificate e classificate in base al tipo di canale mutato e al tipo di patologia che causano (Jentsch et al., 2004). E' tanto stretto il legame tra "funzioni" e "disfunzioni" dei canali che studiare un aspetto equivale a studiare l'altro.
Come già indicato negli Obiettivi, in questo progetto ci interesseremo del ruolo e di alcune canalopatie dei canali del Na, Ca e K neuronali.

1) CANALI DEL SODIO NEL PARKINSONISMO E NELLE EPILESSIE

1.1 - Nav1.6 e parkinsonismo
Trascritti e canali Nav1.6 sono espressi durante lo sviluppo del sistema nervoso e nel cervello e midollo adulto e si trovano localizzati nei nodi di Ranvier, nei dendriti e nelle sinapsi (Caldwell et al., 2000). Nelle cellule di Purkinje e del nucleo subtalamico il canale Nav1.6 è coinvolto nella generazione di una corrente risorgente di Na, indispensabile per la scarica ad alta frequenza in questi neuroni (Raman et al., 1997). Alcuni risultati preliminari ottenuti dall'Unità di Milano indicano che una tossina recentemente isolata dal veleno di scorpione messicano è in grado di indurre una corrente risorgente soltanto in cellule esprimenti Nav1.6 e nelle cellule di Purkinje. A causa della particolare voltaggio-dipendenza della corrente risorgente indotta dalla tossina, le cellule vanno incontro ad una depolarizzazione, aumento della frequenza di scarica ed blocco della scarica causato dall'inattivazione delle correnti di Na. Nel morbo di Parkinson la progressiva degenerazione dei neuroni dopaminergici porta ad una graduale rigidità dei movimenti. I sintomi nascono da complessi cambiamenti che portano ad una attività alterata dei circuiti neuronali. E' interessante osservare che l'interferenza funzionale dei circuiti, ottenuta con una stimolazione ad alta frequenza del nucleo subtalamico nei pazienti, porta ad un notevolissimo miglioramento dei sintomi (Krack et al. 1998). Infatti, si è potuto dimostrare (Beurrier et al., 2001) che queste stimolazioni portano ad un blocco delle correnti Nav1.6 e lo stesso avviene nei neuroni del cervelletto (Do & Bean 2003, 2004). Poiché i dati dell'Unità di Milano dimostrano che la tossina di scorpione possiede non solo una eccezionale selettività e una stabilità di legame, ma anche la capacità di bloccare l'eccitabilità delle cellule di Purkinje, si pensa di usare la tossina come prodotto leader per studi che possano portare a terapie farmacologiche per la cura del morbo di Parkinson.

1.2 - Nav1.1 ed epilessie
Nonostante il fatto che la scoperta della prima mutazione connessa con una epilessia dipendente da canali del Na sia stata trovata in una subunità accessoria beta, tutte le altre canalopatie di natura epilettica legate a canali del Na sono associate alle subunità alfa di canali Nav1.1 (SCNA1) e Nav1.2 (SCNA2) (Kullman, 2002; Baulac et al., 2004). Sono note soprattutto forme di attacchi febbrili (FS) legati a mutazioni di canali del Na e sussiste una grande eterogeneità clinica. Sono state identificate svariate mutazioni per la epilessia generalizzata con attacchi febbrili (GEF+) che è una malattia autosomica dominante con penetranza incompleta (70-80%). Le conseguenze delle mutazioni per il funzionamento neuronale possono essere generalmente previste da estrapolazioni delle proprietà biofisiche, se esse sono notevoli. Al contrario, se le mutazioni provocano soltanto piccole differenze di natura biofisica, questo approccio risulta poco utile e diventa notevolmente più difficile predire le conseguenze funzionali a livello della rete nervosa. Un approccio potenzialmente utile potrebbe essere quello di esprimere la mutazione della canalopatia umana in modelli murini e studiarne l'effetto direttamente a livello di attività di rete con metodiche MEA.

2) CANALI DEL CALCIO PRESINAPTICI E LORO RUOLO NELLA NEUROTRASMISSIONE
Nelle sinapsi del sistema nervoso centrale, il rilascio di neurotrasmettitore è regolato principalmente da canali P/Q (Cav2.1), N (Cav2.2) ed R (Cav2.3) le cui alte espressioni nelle zone attive di rilascio determina la rapidità della risposta sinaptica (Cowan et al., 2001). Alcuni neuroni utilizzano solo un tipo di canali (N o P/Q) altri invece utilizzano miscele dei due canali e coinvolgono anche canali di tipo R (Wilson et al., 2001). Evidenze sempre più convincenti suggeriscono che i canali P/Q sono associati a siti di rilascio ad alta probabilità mentre i canali N ed R sono parzialmente delocalizzati e normalmente contribuiscono meno o assai poco al rilascio di neurotrasmettitore (Reid et al., 2003). Recenti esperimenti nei laboratori dell'Unità di Torino (Carbone) suggeriscono che i canali P/Q sono strettamente accoppiati alle zone attive di sinapsi inibitorie di neuroni ippocampali e sono fortemente coinvolti nel rilascio di vescicole (deplezione) mentre i canali N ed R contribuiscono meno al rilascio ma sono maggiormente implicati nei processi di ripristino del pool di vescicole pronte per il rilascio (Baldelli et al., 2005). Essendo il processo di ripristino vescicolare strettamente Ca-dipendente (Dittman & Regher, 1998) è evidente che i canali del Ca coinvolti in questo processo giocano un ruolo altrettanto importante a quelli responsabili del rilascio in condizioni di stimolazioni ad alta frequenza, dove un rapido rilascio non seguito da un pronto recupero di vescicole porterebbe ad una forte deplezione vescicolare e quindi blocco sinaptico (Schneggenburger et al., 1999).
In quest'ottica, è ragionevole chiedersi cosa succederebbe alla distribuzione dei tre tipi di canali presinaptici se qualcuno dei parametri che ne determina l'espressione, la localizzazione ed il funzionamento cambia. Per esempio, come si riorganizzano i canali P/Q, N ed R, in presenza di fattori neurotrofici che aumentano l'attività sinaptica, verosimilmente aumentando la densità dei canali P/Q ed N (Baldelli et al., 2002). Oppure, cosa cambia a livello presinaptico in una sinapsi di un topo KO in cui è stato eliminato il canale P/Q che è il maggior responsabile della neurotrasmissione (Jun et al., 1999). I canali N ed R verosimilmente compenseranno per questo deficit, ma la sinapsi manterrà la stessa efficienza (probabilità e numero dei siti di rilascio)? Ancora più interessante è capire come mutazioni dei canali P/Q nel topo e nell'uomo alla base di canalopatie associate all'emicrania e/o a forme di atassia (Pietrobon, 2005), modificano i parametri che controllano la secrezione ed eventualmente come cambiano la distribuzione degli altri canali implicati in questi processi. Infine, ci si può anche chiedere quali parametri vengono alterati in una sinapsi di topo KO in cui è stato represso un certo tipo di canale del K, normalmente coinvolto nella fase di ripolarizzazione dei potenziali d'azione (Smart et al., 1998; D'Adamo et al, 2002) inducendo un marcato allargamento della durata della depolarizzazione e quindi dell'attività sinaptica. Che ruolo svolgeranno in questa situazione i canali responsabili del ripristino vescicolare rispetto a quelli responsabili della deplezione? Le risposte a queste domande potranno essere date attraverso un approccio collettivo come pianificato in questo progetto, utilizzando modelli animali comuni, diversi preparati neuronali e tecniche elettrofisiologiche diversificate (vedi Programma di Ricerca).

3) CANALI DEL CALCIO P/Q ED EMICRANIA
Un gruppo di disordini neurologici umani ereditati in modo dominante, tra cui l'emicrania emiplegica familiare (FHM-1), sono causati da mutazioni nel gene CACNA1A, che codifica per i canali del calcio CaV2.1 (P/Q) (Zhuchenko et al., 1997; Fletcher et al., 2001). L' emicrania è una malattia diffusa i cui attacchi sono preceduti in almeno 30% dei pazienti da sintomi neurologici transitori (emicrania con aura) e ci sono buone evidenze che l'aura emicranica sia causata dalla "cortical spreading depression" (CSD) e che lo sviluppo del mal di testa emicranico dipenda dall'attivazione del sistema trigeminovascolare (Pietrobon, 2005). Restano ancora da capire però alcuni aspetti cruciali, tra cui: 1) le origini della sensibilizzazione periferica e centrale del sistema nocicettivo trigeminovascolare e 2) la causa prima del mal di testa emicranico, ovvero il meccanismo che porta all'attivazione degli afferenti nocicettivi trigeminovascolari e al conseguente dolore.
Di recente, la generazione di un topo KI che porta la mutazione FHM-1 R192Q ha permesso per la prima volta l'analisi dei canali mutati espressi a livello nativo nei neuroni (van den Maagdenberg et al., 2004). In cellule trasfettate, l'Unità di Padova ha mostrato che un effetto funzionale comune delle mutazioni FHM1 è quello di aumentare l'influsso di Ca attraverso il singolo canale in un ampio intervallo di potenziali, come conseguenza di un aumento della probabilità di apertura dei canali P/Q e di uno spostamento della loro curva di attivazione verso potenziali più negativi (Tottene et al., 2002). Piu' recentemente è stato mostrato che nei topi R192Q KI: 1) la densità di corrente P/Q in neuroni corticali e cerebellari è più elevata che nei neuroni di topi WT (van den Maagdenberg et al., 2004), 2) i neuroni non presentano alterazioni nel numero dei canali funzionali in membrana (Tottene et al., 2005), 3) l' abbassamento della soglia di attivazione e l'aumentata probabilità di apertura dei canali P/Q mutati, portano ad un abbassamento della soglia per l'induzione della CSD e ad un aumento della sua velocità di propagazione (van den Maagdenberg et al., 2004) e 4) la trasmissione sinaptica alla giunzione neuromuscolare aumenta a basse concentrazioni di Ca extracellulare (van den Maagdenberg et al., 2004). Questo suggerisce che l'aumentata suscettibilità alla CSD nell' FHM-1 possa essere dovuta ad ipereccitabilità corticale conseguente ad un' aumento dell'influsso di Ca nei terminali che porta ad un'eccessiva liberazione di glutammato (van den Maagdenberg et al., 2004). Quest'ultimo punto resta ancora da chiarire come del resto rimangono da esplorare le conseguenze delle mutazioni FHM1 sulla nocicezione trigeminale.

4) CANALI DEL POTASSIO Kv1.1 E LORO RUOLO NELL'ATASSIA EPISODICA DI TIPO-1 E NELL'EPILESSIA
L'atassia episodica di tipo-1 (EA1) è una malattia neurologica autosomica dominante che colpisce il sistema nervoso centrale e periferico (Brunt et al., 1990), associata ad alcune mutazioni puntiformi nel gene che codifica per il canale hKv1.1 di tipo Shaker (Litt et al., 1994). In particolare, l'Unità di Perugia è riuscita a dimostrare che EA-1 è causata da canali del K con proprietà di gating alterate (D'Adamo et al., 1998) e studi delle proprietà biofisiche dei canali nativi e di quelli mutati, espressi in ovociti di Xenopus, ha evidenziato un marcata diminuzione o l'annullamento dell'attività dei canali hKv1.1 mutati (D'Adamo et al., 2002; Zerr et al., 1998) ed alcuni mutanti mostrano un'attività dominante negativa.
Recentemente Bruce Tempel e collaboratori hanno generato dei topi Kv1.1 KO che mostrano attacchi epilettici spontanei, alterazioni della propagazione del potenziale d'azione nel nervo sciatico ed un potenziamento dell'attività sinaptica GABAergica delle cellule del Purkinje (Smart et al., 1998). Studi di struttura-funzione dei canali mutati hanno predetto alcune delle alterazioni neurologiche osservate in questi animali (D'Adamo et al., 2002). Inoltre, è sicuramente interessante che gli attacchi epilettici siano stati osservati sia nei topi transgenici che nei pazienti affetti da EA1 (Zuberi et al., 1999). Quindi, i topi Kv1.1 KO sono generalmente considerati come un ottimo modello di EA1. Sebbene siano stati compiuti importanti passi avanti nella comprensione della fisiopatologia dell'EA1 diversi meccanismi importanti restano oscuri. Vi sono dei determinanti molecolari e genetici che causano l'EA1 non ancora identificati? Quali sono le alterazioni neurologiche del sistema nervoso centrale e periferico che causano gli attacchi di atassia? Perché gli attacchi sono episodici? Come lo stress e la fatica provocano gli attacchi? Esiste un trattamento farmacologico più efficace o una possibile terapia genica? E' ragionevole pensare che la caratterizzazione sia in vitro che in vivo delle alterazioni neurologiche causate dalla rimozione del gene Kv1.1 nei topi potrebbe permetterci di rispondere ad alcune di queste domande e a determinare il ruolo fisiopatologico di questo tipo di canale.

5) CANALI DEL POTASSIO ERG E LORO COINVOLGIMENTO NELL'EPILESSIA
I canali del potassio ERG (ERG1, ERG2, ERG3) sono largamente espressi nel cuore dove controllano la durata del potenziale d'azione ventricolare (intervallo QT) (Sanguinetti & Jurkiewicz, 1990) ma sono anche espressi nei tessuti nervosi (Saganich et al., 2001). Dati recenti dell'Unità di Milano dimostrano che i canali ERG sono presenti in parecchie aree del SNC (Arcangeli et al., 2005). Un altro aspetto dei canali ERG che li rende interessanti è la loro inusuale proprietà biofisica. Infatti, le correnti ERG si inattivano molto più rapidamente di quanto si attivano. Perciò, non esiste molta corrente uscente in condizioni fisiologiche, eccetto nella fase di ripolarizzazione di lunghe depolarizzazioni. Si osserva invece un suo contributo al potenziale di riposo (Schönherr et al, 1999). Perciò le correnti ERG si sono rivelate anche adatte per svolgere funzioni fisiologiche quali la regolazione della frequenza di sparo nelle cellule eccitabili (Chiesa et al., 1997). Un ruolo differente può essere immaginato per le cellule di Purkinje, nelle quali l'Unità di Milano e di Torino (Tempia) hanno potuto dimostrare interessanti effetti e suggerire ruoli fisiologici nel SNC (Sacco et al., 2003).
Dopo la scoperta della prima tossina specifica per il canale ERG, ErgTx1 (Gurrola et al., 1999), e di un'altra per la corrente ERG delle cellule lattotrope (Lecchi et al., 2002), altri peptidi con queste proprietà sono stati successivamente scoperti (Korolkova et al., 2001). Sappiamo ora che queste tossine hanno diversa specificità per i 3 tipi di canali ERG (Cassulini et al., 2005) ed è quindi ragionevole pensare ad una strategia che serva a scoprire i diversi ruoli dei canali ERG presenti nel SNC. Inoltre, siccome l'Unità di Torino (Tempia) ipotizza che le correnti ERG siano coinvolte nella patogenesi dell'epilessia perché condividono varie proprietà con i canali KCNQ che sono coinvolti in tale malattia (Sacco et al., 2003) appare ragionevole sviluppare in questo progetto una nuova procedura farmacologia che selettivamente separi i contributi dei tre canali ERG e ne valuti i ruoli nelle diverse forme di canalopatie. <<<