RICERCA ITALIANA     

INTERRELAZIONI TRA LA PERMEABILITÀ IONICA DI MEMBRANA E LO STATO REDOX INTRACELLULARE NEI PROCESSI NEURODEGENERATIVI: AZIONE DEI PEPTIDI AMILOIDI IN CELLULE NEURONALI E GLIALI.

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

Uno dei problemi della società contemporanea è il progressivo invecchiamento della popolazione. Paradossalmente le scoperte scientifiche, che hanno determinato un incremento dell'aspettativa media di vita, hanno anche originato nuovi problemi medici che, una volta sporadici, sono diventati comuni in un numero crescente di individui. In questo contesto le malattie neurodegenerative svolgono un ruolo predominante. Molti dati sperimentali indicano che la formazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e disfunzioni mitocondriali sono alla base di diverse patologie neurodegenerative quali la malattia di Alzheimer, di Creutzfeldt-Jakobs e di Huntington. Un progressivo declino nelle difese antiossidanti durante l'invecchiamento potrebbe determinare uno sbilanciamento nella quantità intracellulare dei ROS con conseguente danno di componenti cellulari e morte per apoptosi o necrosi. Sebbene numerosi studi abbiano esaminato il ruolo di una aumentata produzione di ROS durante le fasi terminali dei processi neurodegenerativi, il meccanismo mediante il quale i neuroni muoiono rimane in gran parte sconosciuto. Uno dei fattori proposti come determinanti l'induzione dei processi ossidativi, nelle cellule del sistema nervoso centrale (SNC), è l'aggregazione di catene polipeptidiche aberranti ad opera sia dei neuroni che delle cellule gliali. Caratteristica comune a molte malattie neurodegenerative è, infatti, la formazione di specifici depositi proteici, noti come amiloidi, che possono essere osservati sia a livello extracellulare che intracellulare. Nei neuroni, la produzione e l'accumulo di queste proteine aberranti potrebbe innescare sia processi ossidativi che alterazioni della permeabilità ionica della membrana plasmatica. Il conseguente aumento del calcio intracellulare risulterebbe in importanti disfunzioni mitocondriali, inducendo morte neuronale in modo selettivo. Al contrario, i peptidi amiloidi non danneggiano direttamente né gli astrociti né la microglia, ma ne determinano l'attivazione. Il ruolo dell'attivazione gliale nella patogenesi delle malattie neurodegenerative rimane a tutt'oggi controverso. E' noto che gli amiloidi determinano il rilascio di fattori potenzialmente neurotossici da parte della glia, quali le citochine pro-infiammatorie e l'ossido di azoto; d'altro canto queste cellule possono funzionare come "scavenger" eliminando l'accumulo di peptidi amiloidi. E' ragionevole quindi ipotizzare che l'eventuale possibilità di controllare la produzione di fattori neurotossici da parte della glia senza intaccarne la capacità di rimuovere i depositi amiloidi potrebbe risultare di grande beneficio nel rallentare la progressione neurodegenerativa.
Il nostro progetto si propone di studiare lo stress ossidativo e l'aumento di calcio indotto da tre peptidi amiloidi, la beta-amiloide, la proteina prionica e le poliglutammine, in relazione alle variazioni di permeabilità ionica della membrana plasmatica di cellule del compartimento neuronale. E' stato dimostrato sia che i peptidi amiloidi sono in grado di interagire direttamente con le membrane e di formare canali selettivi per il calcio, sia che l'accoppiamento tra i processi ossidativi e l'incremento di calcio intracellulare sono in grado, in un secondo tempo, di modificare la permeabilità ionica delle membrane neuronali ma sopratutto di quelle gliali. Quindi, variazioni nella permeabilità della membrana plasmatica potrebbero rilevarsi determinanti specifici e discriminanti nei processi di morte neuronale o di attivazione gliale. I canali ionici sono stati spesso usati come obbiettivi di farmaci per il trattamento di patologie del SNC. Agendo sulla permeabilità di membrana delle cellule gliali cercheremo di inibire la produzione di fattori potenzialmente neurotossici. Studi precedenti indicano che questo approccio potrebbe costituire parte di una strategia complessiva in grado di contrastare la morte neuronale durante l'insorgere di malattie neurodegenerative. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Michele MAZZANTI Università degli Studi di ROMA "La Sapienza"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Le malattie neurodegenerative, tra cui l'Alzheimer (AD), le malattie da prione (PPD) e le patologie dell'espansione poliglutamminica (polyQD), sono accomunate dalla presenza di aggregati ordinati, conosciuti come depositi di amiloidi, che si ritrovano extracellularmente o intracellularmente. I meccanismi di interazione di questi peptidi con le cellule del sistema nervoso centrale (SNC), che comportando morte cellulare e attivazione gliale, risulta ancora largamente sconosciuta. Il principale scopo del nostro progetto è studiare i meccanismi d'azione, possibilmente trovando punti in comune, di tre differenti peptidi amiloidi in relazione con la loro abilità di modulare la permeabilità ionica delle membrane biologiche. Unendo le competenze scientifiche delle singole unità sperimentali avremo la possibilità di affrontare in maniera interdisciplinare il soggetto scientifico del programma di ricerca: usando tecniche fisiologiche, morfologiche, biochimiche e molecolari esploreremo vari aspetti dell'interazione dei peptidi amiloidi con le cellule del SNC. Secondariamente la nostra vicinanza geografica garantirà un continuo diretto contatto tra i tre laboratori. Questo è di fondamentale importanza per un progetto che coinvolge differenti competenze e abbisogna di luoghi appropiati dove effettuare gli esperimenti. Per ultimo ci avvaleremo delle competenze tecnologiche dei laboratori di ricerca dei Pirelli Labs nella persona dell'Ing Fontana nel campo dell'elettronica a dell'ottica.
Il primo scopo sarà cercare una possibile interazione tra peptidi amiloidi e membrane biologiche. La possibilità che la beta-amiloide (AB), la proteina prionica (PrP) e la poliglutammina (polyQ) siano capaci di inserirsi nel doppio strato lipidico sarà esplorato con sistemi di membrane artificiali e direttamente stimolando con i peptidi cellule nervose e gliali. In questo caso la tecnica usata sarà principalmente elettrofisiologica, possibilmente misurando la corrente dovuta all'inserzione dei peptidi amiloidi. Saremo inoltre coadiuvati dalla microscopia dinamica, e da tecniche biochimiche e molecolari. La localizzazione dei peptidi verrà visualizzata tramite immunoreattività. Useremo esperimenti di ripartizione per valutare la distribuzione dei composti tra fase acquosa e lipidica. Infine, utilizzando peptidi amiloidi modificati molecolarmente, verificheremo se l'interazione avvenga più facilmente con singole particelle o con aggregati. Se, come riportato in letteratura, i differenti composti possono promuovere il flusso di ioni attraverso la membrana, questo dovrebbe essere dovuto principalmente alla corrente di calcio. Di conseguenza lavoreremo per definire le cinetiche nei cambiamenti di concentrazione degli ioni calcio intracellulari stimolando neuroni, astrociti e microglia con i differenti peptidi amiloidi.
La seconda parte del progetto è basata sull'osservazione che i peptidi amiloidi impediscono il corretto funzionamento dei sistemi antiossidanti in neuroni e glia. L'interrelazione tra i differenti tipi di cellule nel SNC durante i cambiamenti delle condizioni redox è così stretto che è impossibile studiare i cambiamenti che intervengono nelle cellule gliali senza considerare le ripercussioni sui neuroni. La generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e il susseguente stress ossidativo nel SNC sono oggi considerati una delle prime cause nelle malattie neurodegenerative, tra cui AD, PPD e le malattie polyQD. Lo stress ossidativo può iniziare dal declino del sistema difensivo antiossidante o può essere causato da altri fattori che determinano la diminuzione degli antiossidanti. Alterazioni delle difese antiossidanti supportano l'ipotesi che lo stress ossidativo possa giocare un ruolo importante nella patofisiologia delle malattie neurodegenerative. La più consistente e significativa alterazione nelle difese antiossidanti è una diminuzione di GSH. Se alterazioni nel metabolismo del glutatione giocano un ruolo significativo nella patogesi delle malattie neurodegenerative, trattamenti che portano ad un'aumentata sintesi di GSH o che inibiscono la sua degradazione possono risultare in un rallentamento della progressione della malattia. Sulla base dei modelli proposti, occorre raccogliere ancora dati sulla modulazione del sistema antiossidante in cellule gliali attivate. L'obiettivo di questa parte del progetto è proporre nuove idee per capire i meccanismi molecolari che portano alla degenerazione dei meccanismi antiossidanti in caso di acccumuli amiloidi, per ottenere dati in particolar modo sulle cellule gliali. Con questo scopo, il profilo quantitativo e qualitativo di agenti antiossidanti non enzimatici (GSH) e enzimatici (GSH dipendenti) verrà effettuato in colture microgliali e di astrociti, stimolate con peptidi amiloidi. Un paragone tra dati ottenuti da cellule gliali a riposo e cellule attivate entrambe stimolate usando vari agenti ossidanti (come il perossido d'idrogeno, il tert-butilidroperossido e gli esteri del forbolo) e peptidi amiloidi verrà svolta per valutare la specificità di questi risultati.
Il terzo obbiettivo sarà l'analisi funzionale dell'attività del proteosoma realizzata con l'utilizzo di estratti cellulari durante l'espressione transiente o la stimolazione dei peptidi amiloidi. L'effetto delle proteine amiloidogeniche sarà determinata sulla microglia astrociti e neuroni in relazione all'attività proteosomica. La variante gialla della GFPu, una proteina fusa con l'ubiquitina, ci permetterà di monitorare le funzioni del proteosoma in cellule tramite tecniche di microscopia a fluorescenza.
Il quarto ed ultimo capitolo del progetto di ricerca proposto esaminerà i cambiamenti, indotti da differenti peptidi amiloidi, sulla permeabilità ionica della membrana plasmatica di neuroni e cellule gliali. Il razionale di questa parte del progetto è basata sull'osservazione che il blocco della corrente del cloro inibisce lo sviluppo di un fenotipo neurotossico in microglia attivata da AB. I dati preliminari hanno mostrato che l'espressione funzionale di una proteina citoplasmatica chiamata CLIC1 (chloride intracellular ionic channel) è regolata dal calcio intracellulare e dall'ossidazione del citosol. Le caratteristiche di CLIC1 includono un sito di legame per GSH e per gli ioni calcio, e la possibilità, durante l'ossidazione e l'incremento di calcio citoplasmatico, di essere trasportato dal nucleoplasma e dal citoplasma alla membrana plasmatica, e una volta inserito, di formare un canale selettivo per il cloro. I nostri esperimenti preliminari mostrano che l'aumento e l'espressione funzionale di CLIC1 sono specifiche per stimolazioni con peptidi amiloidi. L'idea è che CLIC1 sia parte di una cascata di segnalazione intracellulare che inizia durante l'amiloidosi, e che può essere comune per differenti peptidi amiloidi. L'osservazione del funzionamento della proteina CLIC1 ci permetterà di identificare gli elementi biochimici che concorrono con CLIC1 a stabilire un fenotipo neurotossico in microglia. Con la scoperta di nuovi componenti, in aggiunta all'espressione funzionale di una canale del cloro nelle cascate di segnalazione che iniziano al livello della membrana plasmatica e che terminano con il rilascio di molecole neurotossiche, si potrebbero individuare nuovi potenziali obiettivi per il trattamento farmacologico dei processi neurodegenerativi. Come gruppo, i canali ionici sono stati degli utili obiettivi terapeutici, specialmente per lo sviluppo di farmaci agenti sul SNC. Nella sua espressione funzionale CLIC1 potrebbe essere questo obiettivo potenziale. Inoltre, qualsiasi altra proteina associata all'attivazione della cascata di CLIC1 potrebbe rappresentare uno specifico elemento di legame tra stimolazione amiloide ed effetti neurotossici. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

La deposizione di aggregati insolubili di proteine, conosciute come amiloidi, è una delle caratteristiche principali di diverse malattie neurodegenerative. Alcune caratteristiche accomunano diverse patologie tra cui: il morbo d'Alzheimer (AD), il morbo Parkinson (PD), la sclerosi laterale amiotrofica (ALS), patologie causate da proteina prionica (PPD) come il morbo di Creutzfeldt-Jakobs (CJD) e patologie causate dall'espansione delle poliglutammine (polyQ) come il morbo Huntington (HD). Nel cervello di pazienti affetti da queste patologie infatti si ha la comparsa di placche senili, abbondanti depositi sia intracellulari che extracellulari di amiloide nella forma insolubile accompagnata da selettiva perdita dei neuroni (1). I peptidi amiloidi vengono generati in modo patologia dipendente da proteine strutturalmente non correlate (2). AD è caratterizzato da un progressiva deposizione di fibrille di beta–amiloide (AB) nel cervello che portano alla formazione di placche senili (3). Tali depositi sono costituiti da una forma aberrante di AB derivata proteoliticamente da una proteina precursore di membrana (4). Le placche sono infiltrate di microglia reattiva, astrociti e neuroni distrofici (5-6). Le PPD sono una famiglia di disordini neurodegenerativi caratterizzati dall'accumulo di una forma patologica della proteina prionica (PrPsc; 7). PrPsc oltre ad avere natura infettiva, mostra parziale resistenza alla proteolisi, capacità di aggregarsi nello spazio extracellulare ed è anche in grado di formare depositi simili alle placche di AD dando luogo a diverse malattie prioniche (7-9). La formazione delle placche è associata all'attivazione di microglia e astrociti e alla perdita di vacuoli nelle cellule (10-16). La perdita neuronale e la formazione di aggregati di proteine all'interno degli stessi neuroni è caratteristica del morbo di Huntington's (HD), questa patologia, insieme ad altre dieci finora note, è un disordine neurodegenerativo causato dall'espansione di poliglutammine (polyQ) nella proteina responsabile della patologia (17).
Si pensa che, la formazione dei depositi, nelle patologie neurodegenerative sopra trattate, sia causata da modificazioni strutturali delle proteine che portano all'esposizione di regioni idrofobiche responsabili dell'aggregazione. (18,19). La via attraverso la quale si formano i depositi fibrillari, comprende la formazione di diverse strutture intermedie tra cui formazione di dimeri, oligomeri e protofibrille (20,21). Studi recenti supportano l'ipotesi che le forme tossiche in AD, PD, ASL, PPD e nelle patologie da polyQ, siano le protofibrille e non la forma matura delle fibrille perché sono maggiormente capaciti di interagire con le componenti cellulari.
Queste interazioni sono molto probabilmente responsabili della deregolazione di importanti funzioni cellulari causando l'induzione della morte cellulare (22-25). La risposta infiammatoria mediata da microglia e astrociti, dopo stimolazione con peptidi amiloidei, contribuisce al processo neurodegenerativo (26,27,27,28). Il primo passaggio attraverso il quale si esplica l'attività degli amiloidi è la loro interazione con la membrana cellulare. La AB, ad esempio, è in grado di interagire con diversi recettori cellulari (29-31). Tuttavia non è ancora chiaro se AB è in grado di interagire direttamente con la membrana lipidica formando un canale ionico selettivo per gli ioni calcio (32). È comunque chiaro che negli astrociti l'incremento di calcio è dovuto principalmente all'ingresso dal compartimento extracellulare (33). L'incremento di calcio intracellulare è stato osservato in studi precedenti (34) e in esperimenti preliminari effettuati nel nostro laboratorio. Come la AB, diversi altri peptidi amiloidi condividono la stessa abilità di inserirsi nelle membrane biologiche, grazie alla presenza di un'ampia regione idrofobica presente nelle strutture amiloidi (35,36). Inoltre sia la PrP che le poliglutammine (polyQ) potrebbero funzionare come ionofori per il calcio (37). La mancata regolazione dell'incremento di calcio intracellulare è una delle maggiore cause di apoptosi dei neuroni (4,28,33,34). Nelle cellule gliali, invece, l'incremento intracellulare di calcio e l'ossidazione del citoplasma, indotti dai peptidi amiloidei, causa il rilascio di fattori neurotossici da parte della microglia (28,30,38). La relazione tra stimolazione con amiloidi e rilascio di fattori neurotossici, nonostante i diversi studi (30,34,39), è tutt'ora non chiaro. Uno degli effetti più conosciuti esplicati dagli amiloidi è l'induzione di processi ossidativi nel citoplasma. Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) e le specie reattive dell'azoto (RNS) si producono a seguito di reazioni biochimiche e funzioni cellulari. Queste molecole sono altamente reattive e instabili capaci di ossidare i componenti cellulari, portare danni al DNA, disfunzioni dei mitocondri, danno alle membrane cellulari e in alcuni casi induzione dell'apoptosi. La formazione di questi ossidanti è bilanciata in genere nella cellula presenza di antiossidanti, in genere piccole molecole tioliche (in particolare il glutatione), tioli proteici, gli enzimi riducenti come superossido dismutasi e catalasi e la vasta gamma di enzimi dipendenti dal glutatione. Lo stress ossidativo, causato da diverse patologie, modifica questo equilibrio portando ad un incremento eccessivo dei radicali liberi rispetto agli antiossidanti disponibili nella cellula(40). Lo stress ossidativo viene ora riconosciuto come importante nella regolazione dello stato redox della cellula , è importante infatti nella regolazione di diversi processi cellulari, sia nei neuroni che nella microglia che negli astrociti, come l'attivazione del programma apoptotico, il trasporto degli ioni e la mobilitazione del calcio coinvolti nell'esotossicità. Inoltre molti dati dimostrano che gli amiloidi contribuiscono all'incremento dei radicali liberi e quindi dello stress ossidativo nelle cellule microgliali, come però questo possa avvenire non è ancora chiaro. Varadarajan et al. hanno proposto un modello per lo stress ossidativo indotto dalla AB in AD. Hanno ipotizzato che il peptide nell suo stato aggregato (sia fibrillare che solubile) porta allo stress ossidativo e quindi alla disfunzione cellulare mediante un incremento dello ione calcio e induzione del processo apoptotico (41). Stanno inoltre aumentando dati che confermano, almeno parzialmente, che il processo neurodegenerativo indotto dalla PrP è causato da una funzionamento difettoso degli antiossidanti (42). Infine molti marcatori dello stress ossidativo mostrano un incremento dello stesso in cervelli HD. Inoltre in topi HD è stato rilevato un incremento età-dipendente di glutatione (GSH), un incremento di trascritti codificati per proteine coinvolte nella sintesi del GSH e un incremento delle vie di detossificazione(43). Inoltre la neurotossicità presente in AD è associata allo stress ossidativo, alla riduzione di antiossidanti endogeni (44), a danno mitocondriale (45) e a modificazioni dell'omeostasi del calcio intracellulare sia nei neuroni (46) che nelle cellule gliali (47). Il meccanismo complessivo della neurotossicità associata alla AB è tutt'ora comunque sconosciuto. Il gruppo di Duchen ha mostrato che AD causa la diminuzione di GSH in co-colture sia di astrociti che di neuroni (28). La maggior parte della neurotossicità di AD è causata dalla dipendenza dei neuroni dagli astrociti per quanto riguarda l'apporto di GSH (48). Qunidi la neurotossicità associata ad AD è determinata dalla complessa gamma di eventi che comprendono l'azione del GSH sugli astrociti, l'alterazione dell'omeostasi del calcio, la formazione di radicali liberi dell'ossigeno e lo stress ossidativo risultante. Questi eventi alterano la capacità degli astrociti di mantenere l'integrità neuronale.
È stato proposto che l'attivazione della microglia e degli astrociti contribuisce al processo neurodegenerativo (26-28). In risposta al danno o alle infiammazioni la microglia si attiva rapidamente e sintetizza vari fattori neurotossici e proinfiammatori, inclusi il fattore di necrosi tumorale, l'interleuchina-1, eicosanoidi, nitriti e superossidi(49,50). Mentre alcuni di questi fattori sono richiesti per la riparazione dei tessuti, la maggior parte induce o comunque incrementa la neurodegenerazione attraverso meccanismi non ancora chiariti (51). I modelli finora proposti (la relazione tra accumulo della AB e stress ossidativo nella neurodegenerazione) puntano l'attenzione sulla modulazione del sistema degli antiossidanti nella microglia attivata.
Studi precedenti hanno rivelato che bloccando le correnti di cloro sia negli astrociti che nella microglia si ottiene un'inibizione dello sviluppo del fenotipo neurotossico delle cellule attivate con AB (52-54). Abbiamo recentemente riportato che l'attivazione delle cellule microgliali mediante AB porta ad un aumento dell'espressione della proteina CLIC1 (54). Un'importante e inusuale caratteristica di tutte le proteine CLIC studiate fino ad ora è la loro abilità di esistere in due conformazioni una forma solubile e globulare ed una transmembrana in grado di formare canali ionici. CLIC1 è stata caratterizzata sia funzionalmente che strutturalmente (55-62). Studi elettrofisiologici hanno rivelato che CLIC1 ricombinante (espressa E. coli) purificata e solubile è in grado da sola di formare un canale ionico selettivo per gli ioni cloro in membrane lipidiche artificiali(57,59-61). E' stato inoltre osservato che CLIC1 è strutturalmente omologa alla superfamiglia delle GST. CLIC1 ha infatti un sito di legame per il glutatione caratterizzato dalla presenza di un residuo di cisteina (Cys24) altamente conservato nella famiglia CLIC. Questo suggerisce che l'azione di CLIC1 possa essere sotto il controllo dello stato redox della cellula, possibilmente attraverso le specie reattive dell'ossigeno e dell'azoto (ROS o RNS). CLIC1 ha la caratteristica peculiare di essere prevalentemente citoplasmatica, nella conformazione solubile, ed è possibile che sotto specifiche condizioni subisca la transizione conformazionale da forma solubile a forma transmembrana durante la quale esplica attività di canale ionico (60). La colonizzazione delle membrane biologiche avviene durante l'incremento di calcio citoplasmatico, l'ossidazione citoplasmatica e la diminuzione del pH. Le caratteristiche funzionali di CLIC1 e le sue numerose interazioni con diversi componenti intracellulari ci porta a considerare CLIC1 come un elemento cruciale durante la risposta infiammatoria mediata dalla microglia stimolata con AB. Un risultato importante è che CLIC1 aumenta specificatamente dopo stimolazione con AB. Altri attivatori microgliali come il lipopolisaccaride (LPS) non sono capaci di portare all'incremento di CLIC1 neanche dopo 48 h di stimolazione (54). Abbiamo preso spunto dalla diversa azione di AB e LPS per studiare in modo specifico la cascata trasduzionale che dalla stimolazione con AB porta al rilascio di fattori neurotossici. Sia western blot che registrazioni di singolo canale ottenute con la tecnica del patch-clamp mostrano un incremento della concentrazione totale della proteina e del numero di correnti registrate sulla superficie delle membrane cellulari. L'utilizzo di specifici bloccanti dei canali suggerisce un coinvolgimento di CLIC1 nella proliferazione della microglia (54,63,64) e nel rilascio di molecole neurotossiche come TNF-alfa e ossido nitrico (NO) (34,54). Inoltre questi bloccanti per CLIC1 hanno un effetto neuroprotettivo in co-culture di neuroni e microglia trattate con AB (54). Infine siRNA per CLIC1 mostrano una drastica riduzione del rilascio di TNF-alfa dopo 24 e 48 h di stimolazione con AB (54). Studiando l'espressione funzionale di CLIC1 pensiamo di poter dare il nostro contributo nel comprendere la relazione tra stimolazione con AB e rilascio di fattori neurotossici nelle cellule gliali.
In parallelo a queste osservazioni circa gli effetti neurotossici dell'attivazione microgliale vi sono comunque crescenti evidenze che dimostrano il ruolo potenzialmente benefico di astrociti e microglia nella rimozione di accumuli di amiloidi (65,66). Un'efficace strategia terapeutica potrebbe essere percorribile utilizzando le osservazioni sperimentali che indicano come l'inibizione dei processi infiammatori della microglia e l'attivazione astrocitica possa realizzarsi senza alterazioni nella capacità fagocitica. I peptidi amiloidi sono internalizzati in neuroni e astrociti e fagocitati dalle cellule microgliali. La degradazione dei peptidi amiloidi internalizzati è un altro campo di ricerca che deve essere sviluppato per capire il meccanismo molecolare responsabile di diverse malattie neurodegenerative. Il sistema cellulare più indicato nella rimozione dei composti amiloidi è il sistema ubiquitina-proteosoma (UPS), importante per la proteolisi cellulare e responsabile di diversi accadimenti cellulari. UPS è infatti coinvolto nel controllo di qualità delle proteine, mantenendo l'integrità della cellula, prevenendo l'accumulo di proteine aberranti formate dalla via biosintetica delle proteine o danneggiate dopo la sintesi. UPS è inoltre responsabile della distruzione selettiva di proteine non correttamente ripiegate, non ripiegate affatto o non assemblate dove probabilmente si verificano degli errori nel ripiegamento assistito da sistemi chaperonici e quindi in grado di mantenere l'omeostasi proteica (67). L'attività collettiva degli chaperon, l'UPS e l'azione lisosomale sono normalmente sufficienti per prevenire l'accumulo di proteine aberranti, tuttavia in particolari condizioni patologiche la capacità di questa macchina per il controllo qualitativo delle proteine viene interdetta e le proteine aberranti si accumulano ad un livello pericoloso. Molte malattie neurodegenerative come AD, polyQD, ALS e PPD sono tutte caratterizzate da un accumulo di aggregati proteici positivi per l'ubiquitina. Quindi si può pensare che uno degli aspetti critici delle diverse patologie neurodegenerative sia il malfunzionamento del sistema UPS che controlla la qualità proteica (25). Questa ipotesi è supportata da risultati che mostrano come, in sistemi cellulari appositamente allestiti come modelli neurodegenerativi, il numero di inclusioni cellulari positive per l'ubiquitina aumenta in presenza di inibitori del proteosoma. Una questione ancora aperta è perché polyQ ed altre proteine amiloidogeniche non vengano eliminate efficientemente dalla degradazione proteosomiale. E' stato riportato che la degradazione di proteine polyQ espanse vengono non completamente degradate e che si associano irreversibilmente in via diretta con il proteosoma interferendo con la sua funzione (68). E' stato anche dimostrato che AB esercita una funzione inibitoria sul proteosoma. Culture primarie di neuroni corticali e astrociti sono state usate per vedere la partecipazione della via ubiquitina–proteosoma durante la degradazione di AB e l'effetto di AB 1-42 e del frammento AB 25-35 in cellule nervose. I risultati dimostrano che AB produce un aumento significativo di coniugati proteina-ubiquitina e nell'espressione dell'enzima E1 attivato dall'ubiquitina. Inoltre i peptidi amiloidi inibiscono l'attività proteolitica del proteosoma 26S. Quando l'attività protelitica di 26S viene inibita con lactacistina si assiste ad un marcato decremento nella degradazione di AB, suggerendo AB come possibile substrato per questo complesso enzimatico sia in astrociti che neuroni. Il trattamento preliminare delle colture cellulari con lactacistina produce una significativa diminuzione nella vitalità cellulare, probabilmente come conseguenza della inibizione della degradazione di AB che porta ad un'esposizione persistente delle cellule che porta a morte cellulare. L'alterazione della via proteosoma-ubiquitina in AD potrebbe inficiare la rimozione proteolitica di AB 1-42 provocandone un accumulo anormale. <<<