RICERCA ITALIANA     

DISTURBI D'ANSIA E LEGATI ALLO STRESS: NUOVI MECCANISMI E BERSAGLI FARMACOLOGICI

Università degli Studi di Milano

Abstract

Lo stress ambientale è uno dei fattori principali nella patogenesi dei disturbi dell'umore e d'ansia, le piu' comuni patologie psichiatriche. Numerose evidenze legano alterazioni nel rilascio di noradrenalina (NA) agli effetti dello stress. Lo stress acuto aumenta l'efflusso di NA in aree corticali/limbiche, la cui funzione è essenziale per attenzione, memoria e stati affettivi ed ansiosi [6, 20, 30, 38, 40, 42]. Per molti anni le benzodiazepine (BDZ) sono state il principale strumento farmacologico per il trattamento dell'ansia, ma il loro impiego è limitato dalla induzione di dipendenza [2, 39]. Questo problema ha portato ad una riduzione delle prescrizioni di BDZ ed ha stimolato l'impiego di altri farmaci con attività ansiolitica, come gli antidepressivi (AD). Studi clinici hanno dimostrato che il trattamento cronico con AD è efficace nella terapia dell'ansia [39, 46]. Inoltre, studi preclinici hanno mostrato che gli AD riducono marcatamente l'efflusso di NA indotto da stress, un effetto simile a quello delle BDZ in acuto [12, 13]. È stato proposto che le modificazioni plastiche indotte dagli AD si oppongano agli effetti dannosi dello stress, esercitando un effetto positivo sull'umore, l'attenzione e la motivazione. Tuttavia, il meccanismo di questi farmaci, nonostante sia nota l'azione primaria (principalmente il blocco della ricaptazione delle monoamine), è meno chiaro rispetto a quello delle BDZ [4, 46]. Una miglior comprensione dell'azione di questi farmaci nel trattamento dell'ansia sarà fondamentale per l'identificazione di nuovi bersagli per farmaci nuovi e più efficaci.
L'obiettivo principale di questo progetto collaborativo è quello di comprendere il meccanismo dell'azione ansiolitica degli AD. Analizzando il meccanismo cercheremo di identificare bersagli molecolari rilevanti per lo sviluppo di nuovi farmaci (i.e., subunità del recettore NMDA). L'ipotesi di fondo è che lo stress acuto causi un aumento nel rilascio di glutammato in aree limbiche/corticali e che, a sua volta, questo contribuisca all'aumento del rilascio di NA nelle stesse aree (una tipica risposta allo stress) [12, 13], attivando recettori NMDA presinaptici che controllano il rilascio di NA. Sappiamo, dai nostri precedenti studi in collaborazione, che il trattamento cronico con differenti AD riduce il rilascio di NA indotto da NMDA, così come il rilascio di glutammato indotto da depolarizzazione in ippocampo [5, 33].
In questa prospettiva una particolare configurazione dei recettori NMDA nei terminali noradrenergici potrebbe costituire un interessante bersaglio putativo per nuovi potenti e selettivi farmaci ansiolitici. Testeremo la nostra ipotesi utilizzando ratti sottoposti ad un paradigma di stress acuto (foot shock), confrontando le risposte molecolari e cellulari allo stress di ratti trattati con veicolo o due diversi AD. Saranno utilizzate differenti metodologie in vivo, ex vivo e in vitro, tra cui: (1) microdialisi in vivo; (2) misura del rilascio di glutammato e NA da terminali nervosi in superfusione; (3) valutazione delle modificazioni nelle vie di trasduzione e nelle interazioni proteina-proteina rilevanti in terminali nervosi; (4) valutazione dei cambiamenti nelle subunità del recettore NMDA nei terminali nervosi noradrenergici; (5) valutazione dei cambiamenti nei recettori ionotropi e nelle isoforme di BDNF in co-culture locus coeruleus-ippocampo.

Riassumendo gli scopi principali di questo progetto sono:

1. Comprendere meglio i meccanismi cellulari/molecolari dello stress e dei disturbi ad esso correlati, in particolare rispetto al rilascio di NA e glutammato indotti dallo stress.
2. Comprendere il meccanismo cellulare/molecolare dell'effetto ansiolitico dei trattamenti cronici con AD, mediato dal loro effetto sul rilascio di NA e glutammato in ippocampo.
3. Identificare nuovi potenziali bersagli in questi meccanismi per lo sviluppo di farmaci per il trattamento dei disturbi d'ansia ed associati allo stress. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Giorgio Angelo RACAGNI Università degli Studi di MILANO

Obiettivo del Programma di Ricerca

L'obiettivo principale di questo progetto collaborativo è quello di svelare il meccanismo dell'azione ansiolitica dei trattamenti cronici con antidepressivi, farmaci che stanno sempre più sostituendo le benzodiazepine (BDZ) nel trattamento dell'ansia e dei disturbi associati allo stress. Analizzando questo meccanismo cercheremo di identificare bersagli molecolari rilevanti per lo sviluppo di nuovi farmaci (i.e., subunità del recettore NMDA). L'ipotesi di fondo è che lo stress acuto causi un aumento nel rilascio di glutammato in aree limbiche e corticali e che, a sua volta, questo contribuisca all'aumento del rilascio di noradrenalina (NA) nelle stesse aree (una tipica risposta allo stress) [12, 13], attivando i recettori NMDA presinaptici che controllano il rilascio di NA. Sappiamo, dai nostri precedenti studi in collaborazione, che il trattamento cronico con differenti antidepressivi riduce il rilascio di NA indotto da NMDA, così come il rilascio di glutammato indotto da depolarizzazione in ippocampo [5, 33].

Abbiamo, quindi, suggerito che il trattamento cronico con antidepressivi potrebbe ridurre l'ansia attraverso la combinazione di questi meccanismi: (a) riduzione del rilascio di glutammato indotto dallo stress, mediante interazioni molecolari a livello presinaptico identificate in precedenza [5]; (b) riduzione del rilascio di NA indotto da agonisti NMDA, attraverso modificazioni delle proprietà dei recettori NMDA presinaptici. In questa prospettiva una particolare configurazione dei recettori NMDA nei terminali noradrenergici potrebbe costituire un interessante bersaglio putativo per nuovi potenti e selettivi farmaci ansiolitici. Testeremo la nostra ipotesi utilizzando ratti sottoposti ad un paradigma di stress acuto (foot shock), confrontando le risposte molecolari e cellulari allo stress di ratti trattati con veicolo o due diversi antidepressivi (fluoxetina e reboxetina). Saranno utilizzate differenti metodologie in vivo e ex vivo, tra cui: (1) misurazione del rilascio in vivo di NA mediante microdialisi; (2) misurazione del rilascio di glutammato e NA da terminali nervosi (sinaptosomi) in superfusione purificati di fresco da ippocampo; (3) valutazione delle modificazioni misurabili nelle vie di trasduzione intracellulari e nelle interazioni proteina-proteina rilevanti in sinaptosomi; (4) valutazione delle modificazioni nell'espressione e nell'editing del mRNA dei recettori ionotropi per il glutammato nel locus coeruleus; (5) valutazione dei cambiamenti nelle subunità del recettore NMDA nei terminali nervosi noradrenergici in ippocampo. Convalideremo i risultati in vivo e ex vivo mediante un approccio in vitro, che consiste di fettine ippocampali trattate con un agonista inverso per le BDZ (FG 7142), utilizzato per replicare in vitro gli effetti cellulari dello stress in vivo.


RIASSUMENDO GLI SCOPI PRINCIPALI DI QUESTO PROGETTO SONO:

1. Comprendere meglio i meccanismi cellulari/molecolari dello stress e dei disturbi ad esso correlati, in particolare rispetto al rilascio di NA e glutammato indotti dallo stress.
2. Comprendere il meccanismo cellulare/molecolare dell'effetto ansiolitico dei trattamenti cronici con antidepressivi, mediato dal loro effetto sul rilascio di NA e glutammato in ippocampo.
3. Identificare nuovi potenziali bersagli in questi meccanismi per lo sviluppo di farmaci per il trattamento dei disturbi d'ansia ed associati allo stress.


COMPITI PRINCIPALI NEL PROGETTO SARANNO:

1. Valutare quanta parte del rilascio di NA indotto da stress in ippocampo dipenda dal rilascio di NA evocato da agonisti NMDA (in vivo e in vitro).
2. Conseguentemente, valutare se il blocco del rilascio di NA indotto da NMDA in seguito a trattamento cronico con antidepressivi [33] sia una componente rilevante dell'effetto esercitato da questi farmaci sul rilascio di NA indotto da stress.
3. Analizzare il ruolo del rilascio di glutammato indotto dallo stress nell'attivazione del rilascio di NA indotto da NMDA, e studiare se e come il blocco del rilascio di glutammato indotto da depolarizzazione da parte del trattamento cronico con antidepressivi [5] è coinvolto nei meccanismi di ansiolisi.
4. Valutare se le stesse interazioni proteiche nei meccanismi presinaptici, responsabili per l'effetto del trattamento cronico con antidepressivi sul rilascio di glutammato [5], sono anche coinvolte nel rilascio di glutammato indotto dallo stress.
5. Identificare le peculiari caratteristiche dei recettori NMDA espressi nei terminali noradrenergici presinaptici prima e dopo trattamento cronico con antidepressivi, così come le caratteristiche specifiche dell'espressione del recettore NMDA nel locu coeruleus (LC) (isoforme NR1, NR2A/B/C/D), e l'espressione e l'editing dei recettori AMPA, nelle medesime condizioni sperimentali.
6. Valutare il ruolo della localizzazione dendritica di specifiche isoforme di BDNF nella modulazione della composizione in subunità del recettore NMDA nei terminali noradrenergici dopo trattamento cronico con antidepressivi.
7. Valutare quali dei meccanismi/effettori identificati (isoforme NR1, subunità NMDA, variazioni nella trasduzione intracellulare, interazioni tra proteine presinaptiche, isoforme di BDNF, etc.) sia un bersaglio potenziale per nuovi farmaci nel trattamento dei disturbi d'ansia e associati allo stress . <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il ruolo del sistema noradrenergico nei disturbi d'ansia e associati allo stress

Lo stress ambientale è riconosciuto come uno tra i fattori principali nella patogenesi dei disturbi dell'umore e dell'ansia, le piu' diffuse patologie psichiatriche. Numerose linee di evidenza associano alterazioni nel rilascio delle monoamine noradrenalina (NA) e dopamine (DA) agli effetti patologici dello stress. In particolare, l'esposizione a stress acuto induce un aumento nell'efflusso di questi neurotrasmettitori in aree corticali/limbiche, quail la corteccia prefrontale (PFC) e l'ippocampo (HC), la cui funzionalità è essenziale per i processi di attenzione, memoria e negli stati affettivi ed ansiosi [6, 20, 30, 38, 40, 42]. Per molti anni le benzodiazepine (BDZ) hanno rappresentato il principale strumento farmacologico per il trattamento dell'ansia, ma il loro impiego è limitato dalla proprietà di questi farmaci di indurre dipendenza [2, 39]. Questo problema ha portato ad una riduzione delle prescrizioni delle BDZ ed ha stimolato l'impiego di altri farmaci con attività ansiolitica, ad esempio degli antidepressivi. Evidenze cliniche importanti hanno recentemente mostrato che il trattamento cronico con antidepressivi è efficace nella terapia dell'ansia [39, 46]. Inoltre, studi preclinici hanno mostrato che il trattamento cronico (ma non acuto) con antidepressivi riduce in maniera marcata l'efflusso di NA e DA indotto da stress in PFC, un effetto simile a quello che si ottiene con il trattamento acuto con BDZ [12, 13] (vedere i risultati preliminari di seguito). È stato proposto che le modificazioni plastiche a lungo termine indotte dagli antidepressivi sono in grado di opporsi agli effetti dannosi dello stress, esercitando al contempo i loro effetti positivi sull'umore, sull'attenzione e sulla motivazione. Tuttavia, il complesso meccanismo d'azione di questi farmaci, nonostante il ben noto meccanismo primario d'azione (principalmente il blocco della ricaptazione delle monoamine), è molto meno chiaro rispetto a quello delle BDZ [4, 46]. Una miglior comprensione dell'azione di questi farmaci nel trattamento dell'ansia e dei disturbi associati allo stress sarà fondamentale per l'identificazione di nuovi bersagli per farmaci nuovi e più efficaci.


Meccanismi correlati allo stress: il ruolo del glutammato

Uno tra i principali bersagli neurochimici dello stress è il sistema noradrenergico. Diverse linee di evidenza hanno mostrato che i neuroni noradrenergici in differenti aree cerebrali sono attivati da diversi tipi di stimoli stressanti. Infatti l'esposizione a stress acuto porta all'attivazione di questi neuroni e ad un aumento del rilascio di noradrenalina (NA) in varie aree cerebrali, tra cui PFC e HC [6, 20, 30, 38, 40, 42]. In particolare, il sistema noradrenergico del locus coeruleus (LC) gioca un ruolo centrale nel modulare l'attivazione comportamentale in risposta a stimoli ambientali improvvisi, cruciale nella risposta allo stress e agli stimoli ansiogeni [11, 27, 40].
Inoltre, diverse linee di evidenza indipendenti suggeriscono che i neuroni catecolaminergici sono sotto controllo tonico glutammatergico. La manipolazione farmacologica della neurotrasmissione glutamatergica previene l'attivazione dopaminergica corticale in risposta allo stress [7, 17]; tuttavia, la regolazione del rilascio di NA da parte del glutammato è stata, sino ad ora, poco studiata. Recettori NMDA ed AMPA sono stati riscontrati nei terminali noradrenergici di HC [34, 35], ed è stato mostrato che l'attivazione di tali recettori induce il rilascio di NA da terminali nervosi isolati (sinaptosomi) di HC [53]. Recentemente, in uno studio in collaborazione con il gruppo Raiteri, abbiamo dimostrato che il trattamento cronico con antidepressivi inibisce in maniera marcata il rilascio di NA indotto dalla stimolazione dei recettori NMDA presinaptici in HC [33] (vedere i risultati preliminari di seguito). Questi risultati, in linea con quelli del gruppo Dazzi [12, 13], ci hanno spinto ad ipotizzare che il rilascio di NA indotto dallo stress possa dipendere almeno in parte dall'attivazione dei recettori NMDA presinaptici e che il blocco del rilascio di NA indotto da NMDA in HC possa essere una componente rilevante negli effetti degli antidepressivi sul rilascio di NA indotto da stress. Pertanto, uno degli obiettivi principali di questo progetto sarà valutare, sia in vivo che in vitro, se il rilascio di NA indotto da stress dipende dall'attivazione dei recettori NMDA e se il blocco del rilascio di NA indotto da agonisti NMDA è una componente importante dell'effetto degli antidepressivi sul rilascio di NA indotto da stress.

Un ruolo del glutammato nell'azione dello stress e nella fisiopatologia dei disturbi dell'umore e d'ansia è sostenuto da un crescente numero di evidenze, tra cui: (a) livelli plasmatici di glutammato maggiori in pazienti affetti da disturbi dell'umore [2]; (b) aumenti anomali della neurotrasmissione glutammatergica e dei livelli di glutammato in aree cerebrali corticali/limbiche di pazienti depressi [14,15]; (c) atrofia dei dendriti apicali in neuroni ippocampali CA3 indotta da stress cronico [54]; (d) aumento dell'ampiezza e ridotta cinetica di decadimento della corrente mediata da recettore NMDA indotte da stress cronico [21]; (e) deterioramento della plasticità sinaptica in HC indotto da stress [22]. Inoltre, è stato mostrato che i trattamenti antidepressivi influenzano la neurotrasmissione glutammatergica: (a) gli antidepressivi down-regolano subunità del recettore NMDA e ne riducono la funzionalità [47]; (b) gli antidepressivi contrastano gli effetti dello stress su LTP [41,45]. Un aumento del rilascio di glutammato conseguente allo stress potrebbe esacerbare il rilascio di NA dipendente da NMDA in aree corticali/limbiche. Tuttavia, benchè l'effetto dello stress sulla neurotrasmissione glutammatergica e sulla plasticità sinaptica sia considerato centrale nella fisiopatologia delle malattie psichiatriche [28], ad oggi non vi sono evidenze dirette che lo stress aumenti il rilascio di glutammato indotto da stimolazione. Infatti, studi precedenti hanno misurato l'aumento di glutammato extracellulare in paradigmi di stress acuto o cronico mediante microdialisi in vivo [3,25,28], un metodo che presenta lo svantaggio di misurare il pool totale di aminoacido extracellulare, fortemente contaminato dal glutammato metabolico. Un metodo attendibile per la misurazione del rilascio basale, così come di quello stimolato, di glutammato endogeno (e GABA) prevede l'impiego di sinaptosomi purificati preparati di fresco, stimolati in superfusione continua [36,37]. In uno studio recente, utilizzando questo metodo in collaborazione con il gruppo Raiteri, abbiamo fornito per la prima volta prove chiare del fatto che il trattamento cronico con antidepressivi differenti riduce il rilascio di glutammato indotto da depolarizzazione, modificando le interazioni proteiche presinaptiche che ne regolano il rilascio esocitotico [5] (vedere risultati preliminari). Questo metodo sarà utilizzato per misurare le variazioni indotte dallo stress nel rilascio di neurotrasmettitore in ratti trattati con veicolo o due differenti antidepressivi (fluoxetina e reboxetina).


Nuovi bersagli putativi: subunità del recettore NMDA e isoforme di BDNF

L'ipotesi alla base di questo progetto è che lo stress causi un aumento nel rilascio di glutammato in aree limbiche e corticali e che questo, a sua volta, contribuisca ad aumentare il rilascio di NA nelle stesse aree attraverso l'attivazione dei recettori NMDA presinaptici che ne controllano il rilascio. Il trattamento cronico con antidepressivi, che riduce il rilascio di NA indotto da NMDA così come quello di glutammato indotto da depolarizazione [5, 33], potrebbe ridurre l'ansia attraverso la combinazione di entrambi i meccanismi. In quest'ottica, una particolare configurazione del recettore NMDA nei terminali noradrenergici potrebbe essere un interessante bersaglio putativo per nuovi farmaci ansiolitici potenti e selettivi. Appare, pertanto, importante comprendere quali cambiamenti sono indotti dal trattamento cronico con antidepressivi nei recettori NMDA dei terminali noradrenergici. È stato dimostrato che la modificazione della composizione in subunità del recettore NMDA porta a cambiamenti nella sua funzionalità. La presenza della subunità NR2A in associazione alla NR1-N1 corrisponde ad un decadimento più rapido della risposta NMDA, caratteristica del cervello maturo [29], mentre la forma immatura dei recettori NMDA comprende le subunità NR1-C1 e NR2B, ed è caratterizzata da un tempo di decadimento dell'EPSPs più lento [18]. Un ulteriore studio analizzerà le modificazioni indotte dagli antidepressivi nell'espressione di NR1 e delle isoforme NR2A/B/C/D nel LC. Saranno anche studiati l'espressione delle isoforme di recettori per il glutammato AMPA/Kainato, così come l'editing pre-mRNA delle isoforme di interesse.


BDNF e la regolazione dei recettori NMDA

È noto che il fattore neurotrofico di derivazione cerebrale (BDNF), una neurotrofina particolarmente abbondante nel cervello i cui livelli aumentano in seguito a trattamenti cronici con antidepressivi [7, 16], esercita alcuni dei suoi effetti pleiotropici a lungo termine alterando l'espressione cellulare delle subunità NR1 e NR2A del recettore NMDA [23, 26]. Uno studio recente ha dimostrato che il gene per il BDNF umano è composto da 8 esoni e può generare, per splicing alternativo, molteplici trascritti, ognuno composto da un unico esone non codificante in 5' (I-VII) e da un esone comune in 3' (VIII) contenente le regioni codificanti e non tradotte in 3' [24, 50]. Benchè la regolazione di alcuni di questi trascritti sia stata caratterizzata, l'esatta funzione di queste isoforme resta sconosciuta [9, 48, 49]. Lavori recenti in roditori hanno dimostrato che gli antidepressivi possono regolare in maniera selettiva l'espressione di isoforme di mRNA con specificità farmacologica e anatomica [14, 43].
Poiché l'mRNA per BDNF è destinato ai dendriti dei neuroni ippocampali [51] il suo trasporto, così come quello della proteina BDNF, a differenti domini subcellulari può rappresentare un aspetto fondamentale nei processi di riarrangiamento morfologico cellulare e sinaptico alla base degli effetti associati allo stress e agli antidepressivi in HC.
E' importante notare che i neuroni del LC esprimono sia BDNF sia i recettori TrkB [31], e l'attivazione di TrkB è necessaria e sufficiente per differenziare e mantenere il fenotipo di questi neuroni noradrenergici [19]. Inoltre, la distruzione del LC, attraverso applicazione in loco di 6-OHDA, causa una riduzione marcata nell'espressione di BDNF nella corteccia cerebrale [10]. Infine, i neuroni noradrenergici del LC di topi con delezione condizionale di BDNF in cervello postnatale mostrano alterazioni marcate nella plasticità e l'incapacità di aumentare l'espressione di TH in risposta al trattamento con oppiacei [1].

Pertanto, una parte sostanziale di questo progetto sarà volta all'analisi, mediante immunoistochimica, della composizione in subunità del recettore NMDA in terminali nervosi noradrenergici di HC, identificati mediante colocalizzazione con marcatori noradrenergici, in ratti trattati con veicolo o antidepressivi. Negli stessi campioni saranno analizzati i trascritti di BDNF contenenti differenti esoni mediante ibridizzazione in situ non radioattiva, come fatto in precedenza [51]. Successivamente, l'ipotesi sarà ulteriormente verificata in vitro mediante preparazione di co-colture di neuroni da LC ed HC [52], trattate con l'agonista inverso del recettore per le BDZ, FG 7142, così da riprodurre in vitro l'effetto dello stress in vivo.

Riassumendo, nel suo complesso questo studio ci consentirà di raggiungere una maggior comprensione dei meccanismi associati allo stress e ai disturbi ad esso correlati, così come di far luce sul meccanismo d'azione degli antidepressivi nel trattamento dei disturbi d'ansia e dell'umore. Un obiettivo principale del progetto sarà l'identificazione di nuovi bersagli (i.e., isoforme presinaptiche del recettore NMDA che regolano il rilascio di NA) per nuove strategie terapeutiche.


Risultati precedenti e preliminari

Diverse linee di evidenza, ottenute in maniera indipendente o in collaborazione tra i gruppi coinvolti in questo progetto, costituiscono componenti cruciali del razionale di questo lavoro.
1. In linea con le evidenze cliniche che mostrano una notevole efficacia ansiolitica dei farmaci antidepressivi, è stato recentemente dimostrato che la somministrazione cronica di antidepressivi con differenti meccanismi d'azione (imipramina, mirtazapina, venlafaxina, reboxetina) riduce il rilascio di NA indotto da stress (misurato mediante microdialisi in vivo), riducendo in maniera drastica la sensibilità dei neuroni noradrenergici corticali all'effetto dello stress [12, 13]. (Fig.1)



2. È stato recentemente dimostrato che il trattamento cronico con due antidepressivi differenti, reboxetina e fluoxetina, riduce significativamente la capacità dei recettori NMDA e AMPA per il glutammato di mediare il rilascio di NA da sinaptosomi da HC, mentre non modifica il rilascio indotto da depolarizzazione [33] (Fig. 2).



Tale modificazione è accompagnata da una riduzione selettiva della subunità NR1 del recettore NMDA (sia del mRNA che della proteina) in membrane sinaptiche isolate da sinaptosomi di HC. Questa riduzione nella risposta dei recettori glutammatergici sui terminali noradrenergici, osservata dopo trattamento cronico con antidepressivi, potrebbe essere parte fondamentale degli effetti positivi della somministrazione a lungo termine osservati nella clinica dei disturbi d'ansia e correlati allo stress.
3. In un recente studio, in collaborazione con il gruppo Raiteri, abbiamo dimostrato per la prima volta chiaramente dimostrato che il trattamento cronico con tre differenti antidepressivi (fluoxetina, desipramina, reboxetina) riduce in maniera marcata il rilascio di glutammato indotto da depolarizzazione, ma non quello di GABA. Questo effetto è dovuto a modificazioni discrete nelle interazioni tra proteine presinaptiche che regolano il rilascio di glutammato [5]. I nostri risultati suggeriscono che gli antidepressivi inibiscano selettivamente il rilascio di un pool fisiologico di glutammato (Fig. 3).

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