RICERCA ITALIANA     

Proteine di regolazione nelle piante: analisi biomolecolare
dell'interazione di proteine 14-3-3 e calmodulina con proteine bersaglio.

Università degli Studi di Roma "Tor Vergata"

Abstract

Il ruolo dell'interazione proteina-proteina nei processi cellulari delle piante è il tema di questo progetto.Tra le proteine di segnale finora note, alcune, come la calmodulina (CaM) o le proteine 14-3-3 giocano un ruolo specifico in vie di trasduzione del segnale diverse. I meccanismi molecolari alla base della loro azione sono stati chiariti solo negli ultimi anni. Sia le proteine 14-3-3 che la CaM sono molto conservate e svolgono la loro azione come regolatori attraverso l' interazione specifica con proteine ed enzimi bersaglio. Esse sono state scelte per questo progetto, in cui verrà studiata la regolazione a livello molecolare della loro interazione con alcuni bersagli specifici: in particolare la CaM con le Ca-ATPasi di tipo IIB e le 14-3-3 con l'H+-ATPasi della membrana plasmatica e con una MAPK.
Il piano sperimentale prevede lo studio dei parametri cinetici, biochimici e molecolari dell'interazione delle due proteine segnale con i loro bersagli e il ruolo da questa svolto nella regolazione di processi fisiologici. Saranno inoltre studiati, in stretta collaborazione dai due gruppi di ricerca, 1) i meccanismi molecolari di regolazione di diverse ATPasi di tipo P, bersagli delle due proteine segnale 14-3-3 e CaM, per identificare un possibile meccanismo di autoinibizione comune; 2) la possibile interazione e relazione funzionale tra le due proteine segnale nelle piante, come è già stato suggerito per i mammiferi.
La collaborazione tra le due UR, entrambe con una consolidata esperienza nel campo è iniziata già da tempo, è documentata da diversi lavori pubblicati e prevede esperimenti congiunti e scambio di metodologie e materiali.
Questa ricerca pone le basi indispensabili al chiarimento dei meccanismi biomolecolari alla base di complesse e ancora in larga parte inesplorate vie di trasduzione di segnali nelle piante <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Patrizia ADUCCI Università degli Studi di ROMA "Tor Vergata"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Lo studio del ruolo dell'interazione proteina-proteina in numerosi processi cellulari delle piante è di primaria importanza per la comprensione dei meccanismi che regolano le risposte delle piante a diversi stimoli endogeni ed esterni. Solo negli ultimi anni sono stati chiariti alcuni di questi meccanismi a livello molecolare ed appare evidente che alcune proteine di segnale come la calmodulina (CaM) o le proteine 14-3-3 giocano un ruolo specifico in vie di trasduzione del segnale diverse. Queste proteine inoltre sono molto conservate anche in sistemi animali dove analogamente svolgono un ruolo di regolatori attraverso la loro specifica interazione con proteine ed enzimi bersaglio. Anche alcuni di questi bersagli sono conservati nei due sistemi animale e vegetale. Sia la CAM che le proteine 14-3-3 sono presenti nelle piante in numerose isoforme, che variano a seconda delle specie e per le quali è stato ipotizzato un diverso ruolo fisiologico e una diversa interazione con i rispettivi bersagli.
Lo scopo di questo programma è la delucidazione a livello bio-molecolare dell'interazione delle due proteine regolatrici CaM e 14-3-3 con i loro bersagli proteici, in particolare la CaM con le Ca-ATPasi di tipo IIB e le 14-3-3 con l'H+-ATPasi della membrana plasmatica e con una MAPK. In questo progetto ci proponiamo inoltre di verificare se anche nelle piante, come suggerito per i mammiferi, proteine 14-3-3 e CaM interagiscano fra di loro.
Saranno presi in esame i parametri cinetici, biochimici e molecolari di tali interazioni e il ruolo da esse svolto nella regolazione fisiologica.
Entrambi i gruppi proponenti hanno una consolidata esperienza nel campo e hanno sviluppato una proficua collaborazione negli anni, documentata da diversi lavori pubblicati, sia attraverso ricerche in collaborazione che attraverso scambi di metodi e prodotti di ricerca. Tale ricerca pone le basi indispensabili al chiarimento dei meccanismi biomolecolari alla base di complesse e ancora in larga parte inesplorate vie di trasduzione di segnali nelle piante. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il presente progetto intende studiare due famiglie di proteine regolative che sono conservate da un punto di vista evolutivo in tutti gli eucarioti. Esse sono coinvolte in interazioni proteina-proteina in grado di regolare lo sviluppo cellulare e specifiche vie di traduzione di segnali. Mentre esse sono evolutivamente conservate, la maggior parte degli eucarioti, comprese le piante, ha un gran numero di geni e proteine spesso divergenti che svolgono funzioni altamente specializzate. Tra le numerose proteine regolative fino ad ora conosciute, la calmodulina (CaM) e le proteine 14-3-3 sono state approfonditamente studiate nelle piante, a causa del gran numero di funzioni a loro attribuite in diversi processi, come la crescita, lo sviluppo, le risposte a segnali endogeni e a stress biotici e abiotici. Sia la CaM e le 14-3-3 non hanno attività catalitica di per sé. Le loro attività di regolazione si manifestano infatti grazie alla loro capacità di modulare un gran numero di enzimi e proteine non-enzimatiche.
È quindi di fondamentale importanza caratterizzare l'interazione con proteine bersaglio purificate per comprendere il ruolo delle vie di traduzione regolate da CaM e 14-3-3.

Le proteine 14-3-3
Le 14-3-3 sono una classe di proteine largamente distribuite e altamente conservate in un gran numero di organismi, incluso lieviti, mammiferi e piante (Ferl, 1996; Fu et al., 2000; Roberts, 2000). Esse esistono in numerose isoforme (Wang and Shakes, 1996), le quali possono formare omo e eterodimeri in vivo. Le proteine 14-3-3 svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione di numerosi processi cellulari, come la regolazione del ciclo cellulare, il differenziamento, l'esocitosi, l'apoptosi, il "targeting" di proteine in vari compartimenti cellulari e nella coordinazione di diverse vie di trasduzione del segnale (Fu et al., 2000).
La caratteristica comune delle proteine 14-3-3 è la loro capacità di interagire con proteine bersaglio, modulandone quindi l'attività. Un gran numero di proteine sono state identificate come bersagli molecolari delle 14-3-3 e in alcuni casi il sito di legame per le 14-3-3 è stato individuato (Palmgren et al., 1998). L'interazione con le proteine 14-3-3 è generalmente inducibile dalla fosforilazione di un residuo di serina o treonina facente parte di una specifica sequenza di riconoscimento (Muslin et al., 1996, Yaffe et al., 1997).
Nelle piante le proteine 14-3-3, oltre che essere coinvolte in processi simili a quelli descritti negli animali, possiedono alcune caratteristiche peculiari, essendo infatti implicate nella regolazione del metabolismo primario, nei meccanismi di senescenza, nella germinazione, e nelle risposte della pianta all'attacco di organismi patogeni e a condizioni di stress abiotici (Roberts, 2000).
Una delle prime funzioni attribuite alle proteine 14-3-3 nelle piante è l'inibizione regolata dalla transizione luce-buio della nitrato reduttasi (Bachmann et al., 1996, Moorhead et al., 1996), un enzima chiave nel metabolismo dell'azoto.
Il metabolismo del carbonio è un altro processo metabolico fondamentale che utilizza le proteine 14-3-3 per la regolazione. Infatti la saccarosio-fosfato sintasi, la trealosio-6-fosfato sintasi e la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi sono regolate dalle 14-3-3 (Moorhead et al., 1999).
Le proteine 14-3-3 sono in grado di associarsi ai complessi "G-box" (de Vetten et al., 1992,elementi cis-agenti presenti nei promotori di numerosi geni eucariotici; le proteine 14-3-3 sono coinvolte nell'attività del promotore in quanto in grado di legarsi ai fattori di trascrizione GBFs (G-box Binding Factors). Recentemente, è stato dimostrato che le proteine 14-3-3 sono in grado di associarsi con VP1 (Viviparous 1) e EmBP1 (Em-Binding Protein 1), fattori di trascrizione coinvolti nell'espressione genica regolati dall'acido abscissico; questo suggerisce che le proteine 14-3-3 possano regolare la formazione di complessi tra "DNA binding proteins" e proteine regolatrici tessuto-specifiche (Schultz et al., 1998).
Le proteine 14-3-3 sono implicate nella regolazione dell'H+-ATPasi di membrana plasmatica (Jahn et al., 1997, Fullone et al., 1998, Baunsgaard et al., 1998), la principale pompa localizzata a livello della membrana plasmatica. Le 14-3-3 interagiscono con il dominio regolatore C-terminale della pompa inducendo una forte stimolazione dell'attività enzimatica. L'associazione delle 14-3-3 con l'H+-ATPasi di plasmalemma è regolata da un meccanismo di fosforilazione/defosforilazione che coinvolge una protein fosfatasi 2A e una protein chinasi non ancora identificata (Camoni et al., 2000). Gli ultimi tre residui della pompa (Tyr-Thr-Val) sono stati identificati come sito di legame per le 14-3-3; rappresentano un nuovo dominio di legame che non ha alcuna omologia con altri siti di legame per le 14-3-3 finora identificati. Il legame delle 14-3-3 induce la dissociazione del C-terminale dal sito di binding intramolecolare e quindi l'attivazione dell'enzima. Tale effetto è conseguenza del ruolo autoinibitorio svolto dal dominio C-terminale dell' H+-ATPasi. Tale meccanismo è comune a molte ATPasi di tipo P tra cui la Ca2+-ATPasi IIB (Carafoli,1991; Rasi-Caldogno et al., 1995; Bonza et al., 2000; Geisler et al., 2000; Luoni et al., 2004). L'interazione tra 14-3-3 e H+-ATPasi viene stabilizzata dalla fitotossina fusicoccina (FC) determinando un'attivazione persistente della H+-ATPasi (Fullone et al, 1998, Baunsgaard et al., 1998). Il complesso ternario 14-3-3- H+-ATPasi e FC è stato cristallizzato ed è stata determinata la struttura ai raggi X (Wurtele et al., 2003).
Le 14-3-3, come detto precedentemente, sono proteine dimeriche; in sistemi animali è stato dimostrato che, in molti casi, la dimerizzazione non è un requisito necessario per il legame con le proteine bersaglio. Numerosi esperimenti hanno evidenziato come diverse proteine leganti 14-3-3 siano in grado di farlo con la stessa efficienza nel caso quest'ultime fossero sotto forma sia di monomero che di dimero (Gu et al., 1998; Tzivion et al., 1998). E' però importante notare che, benché sia la forma monomerica che quella dimerica delle 14-3-3 risultino in grado di legare in modo equivalente la protein chinasi Raf, solo la forma dimerica può attivarla (Tzivion et al., 1998). Sono state riportate tuttavia, sempre in sistemi animali, proteine che non sono in grado di interagire col monomero, come la serotonina N-acetil transferasi(Obsil et al., 2001).
Nelle piante gli studi sull'effetto della dimerizzazione delle 14-3-3 sono ancora preliminari. Data l'elevata identità di sequenza con le 14-3-3 animali è ipotizzabile che anche nelle piante la dimerizzazione possa influenzare sia la specificità di bersaglio che le proprietà regolative.
Recentemente è stato proposto che la regione C-terminale delle proteine 14-3-3 possa avere un ruolo regolativo nell'interazione con i bersagli molecolari. La struttura cristallografica delle 14-3-3 animali ha mostrato un ripiegamento della porzione C-terminale nel dominio responsabile del legame con i bersagli (Liu et al., 1995), suggerendo che tale regione possa quindi avere un ruolo autoinibitorio. Alcuni autori hanno osservato la selettiva rimozione di un frammento C-terminale di un'isoforma 14-3-3 durante la germinazione di semi di orzo, ed hanno proposto che ciò possa rappresentare un meccanismo di regolazione dell'attività di tale proteina (Testerink et al., 2002).

La calmodulina
la calmodulina (CaM) è una proteina citosolica che agisce come un sensore primario in tutti gli eucarioti. La CaM è una piccola proteina con due domini globulari, ognuno dei quali caratterizzato dalla presenza di due "EF-hand", connessi da un'alfa elica flessibile. Il legame del Ca ai quattro "EF-hand" determina l'esposizione di una porzione idrofobica della molecola che rende il complesso Ca/CaM in grado di interagire con un sito specifico presente in proteine bersaglio (Sanders et al., 2002; Hetherington and Brownlee, 2004).
Al contrario dei vertebrati, che possiedono una famiglia genica che codifica per una singola isoforma di CaM, e dei funghi e dei lieviti, che possiedono un singolo gene per la CaM, le piante hanno più geni che codificano per una varietà di isoforme di CaM diverse, alcune delle quali con una sequenza aminoacidica divergente (Zielinski, 1998; Luan et al., 2002). Il genoma della pianta modello Arabidopsis thaliana contiene sette geni codificanti per quattro isoforme di CaM; queste quattro isoforme, che sono altamente simili a quelle animali, hanno tra loro una identità aminoacidica maggiore del 95% (Luan et al., 2002). Nonostante questa elevatissima identità di sequenza, queste diverse isoforme hanno una differente capacità di interagire con diverse proteine bersaglio e di modularne l'attività enzimatica (Liao et al., 1996; Reddy et al., 1999; Koehler and Neuhaus, 2000). Il genoma di Arabidopsis thaliana contiene anche sette geni codificanti per proteine simili alla CaM (CaM-like proteins); per tre di queste, che hanno un'identità aminoacidica con l'isoforma 2 di CaM (CaM2) compresa tra il 50 e il 75%, è stato dimostrato che possiedono un'attività simile a quella della CaM almeno in alcune condizioni (Luan et al., 2002). In particolare, CaM8 è in grado di complementare la mutazione CMD1 di lievito (Zielinski, 2002), ma non di interagire con canali ionici regolati dai nucleotidi ciclici (Koehler and Neuhaus, 2000), suggerendo che la proteina possa condividere con le "CaM-like proteins" di altre piante la capacità di interagire con un numero limitato di proteine target (Zielinski, 1998; Luan et al., 2002; Zielinski, 2002; Yamakawa et al., 2004). Le diverse isoforme di CaM vegetale non differiscono solo per la loro capacità di modulare l'attività di diversi bersagli, ma anche per le modalità di espressione (Zielinski, 1998; Luan et al., 2002; Zielinski, 2002); quindi, nelle cellule vegetali, una fine regolazione dell'attività delle proteine regolate da CaM può risultare anche dalla loro affinità per diverse isoforme di CaM che risultano espresse in modo diverso.
Nelle piante sono state identificate svariate proteine in grado di legare la CaM (Zielinski, 1998; Luan et al., 2002). Tra queste ci sono le Ca-ATPasi regolate da CaM (ACAs, Geisler et al., 2000; Sze et al., 2000) che estrudendo Ca dal citosol possono contribuire alla specificità del segnale codificato dal Ca (Sanders et al., 2002; Hetherington and Brownlee, 2004). Le ACAs sono enzimi che appartengono alla superfamiglia delle ATPasi di tipo P ed in particolare alla stessa sottofamiglia (IIB) della Ca-ATPasi del PM delle cellule animali (PMCA) (Geisler et al., 2000; Sze et al., 2000; Moeller et al., 1996; Carafoli, 1991; Brandt et al., 1998). Come PMCA (Carafoli, 1991; Brandt et al., 1998), le ACAs legano la CaM a livello di un dominio citosolico che può essere selettivamente rimosso mediante proteolisi controllata con tripsina (Rasi-Caldogno et al., 1993; Rasi-Caldogno et al., 1995; Olbe and Sommarin, 1998). Il trattamento proteolitico aumenta l'attività catalitica delle ACAs in modo simile a quello operato dalla CaM ed i due effetti non risultano additivi, ad indicare che il dominio rimosso dalla tripsina esercita una azione autoinibitoria che viene soppressa dal legame con la CaM (Carafoli, 1991; Brandt et al., 1998; Rasi-Caldogno et al., 1993; Rasi-Caldogno et al., 1995; Olbe and Sommarin, 1998). L'identificazione dei geni codificanti per le ACAs ha però rivelato una grande differenza strutturale con PMCA. Questa differenza risiede nella localizzazione del dominio di legame per la CaM: al contrario di PMCA, che possiede un'estesa porzione C-terminale contenente il dominio autoinibitorio e quello in grado di legare la CaM (Carafoli, 1991; Brandt et al., 1998), le ACAs hanno una porzione C-terminale molto corta e un'estesa porzione N-terminale che contiene questi due domini (Huang et al., 1993; Huang et al., 1994; Harper et al., 1998; Malmstrom et al., 1997, Bonza et al., 2000; Geisler et al., 2000).
I mammiferi hanno una varietà di isoforme di PMCA tutte localizzate esclusivamente a livello del PM; tutte queste isoforme derivano dallo splicing alternativo di quattro geni diversi (Carafoli, 1991; Brandt et al., 1998) e differiscono sia nella loro affinità per la CaM, sia nel grado di autoinibizione misurato in assenza di CaM (Carafoli, 1991; Brandt et al., 1998).
Le piante possiedono numerosi geni codificanti per ACAs (10 in A. thaliana e 11 in riso) che possono essere divisi in quattro raggruppamenti in base alla omologia di sequenza, al numero e alla posizione degli introni (Bonza et al., 2000). Inoltre, isoforme di ACAs sono state identificate non solo a livello del PM, ma anche a livello delle endomembrane come ER e TP (Geisler et al., 2000; Sze et al., 2000). Tra le isoforme di A. thaliana caratterizzate, At-ACA8 e At-ACA9, entrambe localizzate sul PM (Bonza et al., 2000; Schiott et al., 2004), appartengono allo stesso sottogruppo, mentre At-ACA2 e At-ACA4, localizzate rispettivamente su ER e TP (Harper et al., 1998; Geisler et al., 2000), appartengono ad altri due sottogruppi correlati tra loro.
Da analisi biochimiche dell'attività enzimatica delle Ca-ATPasi condotte in vescicole di membrane native è emerso che le ACAs localizzate a livello del PM potrebbero avere una più alta affinità per la CaM di quelle localizzate a livello delle endomembrane. Infatti, lo stimolo dell'attività Ca-ATPasica indotto da CaM esogena in vescicole di PM isolato è molto basso o addirittura non misurabile a meno che la CaM endogena venga rimossa attraverso lavaggi estensivi con un agente chelante per il Ca (Rasi-Caldogno et al., 1993, Olber and Sommarin, 1998, Robinson et al., 1998; Williams et al., 1990; De Michelis et al., 1993; Dainese et al., 1997; Olbe et al., 1997). Inoltre, la Ca-ATPasi del PM lega molto efficentemente la CaM in saggi di overlay (Rasi-Caldogno et al., 1995; Bonza et al., 2000; Dainese et al., 1997; Olbe et al., 1997; Askerlund, 1997; Bonza et al., 1998) e si lega così saldamente ad una matrice di CaM-agarosio che può essere eluita solo con EDTA 5 mM (Bonza et al., 1998). L'identità aminoacidica tra le diverse ACAs non è molto elevata a livello della porzione N-terminale che contiene il dominio di legame per la CaM (Bonza et al., 2000), però tuttora manca un'analisi dettagliata dell'affinità delle differenti isoforme per la/le CaM.
Attraverso la mutagenesi sito-diretta e l'uso di peptidi sintetici con sequenze corrispondenti a porzioni del dominio C-terminale di PMCA o N-terminale di ACAs, è stato dimostrato che il sito di legame per la CaM si sovrappone parzialmente a quello con funzione autoinibitoria (Carafoli, 1991; Brandt et al., 1998; Hwang et al., 2000; Malstrom et al., 2000; Curran et al., 2000; Luoni et al., 2004). Inoltre, le porzioni autoinibitorie di PMCA e di At-ACA2 sono in grado di inibire anche l'attività di Ca-ATPasi di tipo IIA che non possiedono un dominio autoinibitorio terminale (Geisler et al., 2000; Evans et al., 1998). Nel loro insieme questi risultati sono coerenti con un modello di regolazione delle Ca-ATPasi di tipo IIB che prevede che il legame della CaM ad un dominio terminale citosolico determini la dissociazione del dominio autoinibitorio dal legame con una porzione intramolecolare dell'enzima (Carafoli, 1991; Brandt et al., 1998; Hwang et al., 2000; Curran et al., 2000; Luoni et al., 2004) e suggerisce che le ATPasi di tipo P possano condividere meccanismo di autoinibizione comuni, indipendentemente dalla posizione e dalle sequenza del dominio terminale regolativo.

Sia la CaM che le proteine 14-3-3 sono state scelte in questo studio, e verrà studiata la loro interazione con alcuni bersagli specifici, la regolazione a livello molecolare e le conseguenze a livello cellulare. Inoltre è di estremo interesse studiare il possibile "cross-talk" tra le due proteine nelle piante, data la loro accertata capacità di interazione nei mammiferi. (Luk et al., 1999) <<<