RICERCA ITALIANA     

Vie di trasduzione e modifiche traduzionali e post-traduzionali nella protezione dall'apoptosi: disegno di nuove strategie terapeutiche antitumorali.

Seconda Università degli Studi di Napoli

Abstract

La terapia medica tradizionale delle neoplasie è attualmente affidata all'impiego di agenti citotossici convenzionali il cui meccanismo d'azione principale è il danno irreversibile e letale al DNA delle cellule tumorali. Accanto al danno al DNA, uno dei meccanismi d'azione della chemioterapia tradizionale è l'induzione di apoptosi nelle cellule neoplastiche. Tuttavia le cellule tumorali possono sviluppare dei meccanismi di fuga dall'apoptosi coinvolgenti le alterazioni dei circuiti regolativi della trasmissione del segnale mitogenico e del ciclo cellulare che assicurano alle cellule neoplastiche la sopravvivenza nell'ospite e la protezione dall'apoptosi. Numerosi dati stanno emergendo sul coinvolgimento di fattori della sintesi proteica nella proliferazione cellulare tumorale e nella trasmissione del segnale. Pertanto può essere ipotizzato uno stretto network tra vie di trasduzione e sintesi proteica direttamente coinvolto nella protezione delle cellule tumorali dall'apoptosi. Il progetto attuale è la prosecuzione di un PRIN finanziato in precedenza che ha portato alla definizione del coinvolgimento di fattori trasduzionali, traduzionali e post-traduzionali nella difesa delle cellule tumorali dall'insorgenza di apoptosi spontanea o indotta da farmaci. In particolare l'unità Abbruzzese ha rilevato che le cellule di carcinoma epidermoide attivano un pathway dipedente da ras ed EGF coinvolgente il fattore di inizio della sintesi proteica 5A (eIF-5A)ed il fattore di allungamento 1A (EF-1A)(in cooperazione con l'unità Arcari) in difesa dall'apoptosi indotta da IFNa ed etoposide. L'unità Illiano ha in parte definito il coinvolgimento della proteina chinasi A (PKA) nella regolazione del ciclo cellulare da parte dell'acido retinoico. L'unità Belfiore ha identificato che l'insulin receptor A (IR-A) può sostituire la funzione di IGF-IR nei tumori ormono-resistenti e guidare la difesa delle cellule neoplastiche dall'apoptosi. L'unità Castoria (aggiuntasi quest'anno) ha chiarito il cross-talk tra recettori androgenici e la via di MAPK dipendente da ras/src attivata nelle cellule tumorali e nelle cellule mesenchimali circostanti al carcinoma prostatico ormono-resistente. Infine l'unità Agostinelli ha studiato il coinvolgimento di modifiche post-traduzionali di aminoacidi nell'induzione di apoptosi in cellule tumorali farmaco-resistenti. Nel progetto corrente tali meccanismi protettivi verranno ulteriormente caratterizzati dal punto di vista molecolare ed estensivamente studiati. L'unità Abbruzzese definirà nuove strategie terapeutiche basate sull'impiego di agenti interferenti con il signalling o l'attività di eIF-5A. L'unità Arcari si occuperà della definizione del ruolo di EF1-A nella regolazione della proliferazione e nella protezione delle cellule tumorali dall'induzione di apoptosi da parte di agenti antitumorali. L'unità Belfiore studierà il ruolo dei sottotipi recettoriali di IR nel determinare resistenza ormonale, mentre l'unità Castoria definirà il ruolo del signalling ras/src-dipendente nel determinare resistenza ormonale nel carcinoma prostatico. L'unità Illiano si occuperà delle modifiche post-traslazionali ubiquitin dipendente di PKA e di altre molecole del signalling e di eIF-5A e EF-1A nell'apoptosi spontanea o farmaco-indotta in cellule tumorali. L'unità Agostinelli studierà il coinvolgimento dell'aminoossidasi e della transglutaminasi (tTG) nella regolazione della morte cellulare definendo le interazioni tra queste e i fattori traduzionali e del signalling. Le varie unità collaboreranno strettamente tra di loro estendendo le osservazioni su altri modelli cellulari tumorali o mettendo a disposizione degli altri le loro capacità tecnologiche. Il risultato finale atteso è il disegno di nuove strategie integrate e complementari per il potenziamento della morte cellulare e dell'efficacia terapeutica di agenti anti-tumorali. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Alberto ABBRUZZESE SACCARDI Seconda Università degli Studi di NAPOLI

Obiettivo del Programma di Ricerca

La terapia medica tradizionale delle neoplasie è prevalentemente affidata all'impiego di agenti citotossici convenzionali il cui meccanismo d'azione principale è il danno irreversibile e letale al DNA delle cellule tumorali. Tuttavia sino ad oggi, a causa del basso indice terapeutico di tali agenti, l'efficacia della chemioterapia è ancora limitata e le possibilità di guarigione dei pazienti, soprattutto negli stadi avanzati, sono ancora ridotte. Recentemente è stato rilevato che, accanto al danno letale al DNA, uno dei meccanismi d'azione della chemioterapia tradizionale è l'induzione nelle cellule neoplastiche di apoptosi o morte cellulare programmata attraverso l'interferenza con i circuiti molecolari regolativi di tale processo. Il rinvenimento di quest'ultimo nei tessuti tumorali appare essere attualmente un importante indice di risposta alla terapia anti-tumorale. L'apoptosi è ritenuto un meccanismo di suicidio della cellula eucariotica i cui componenti, normalmente non attivati, sono già presintetizzati nel citoplasma. Danni fisici o chimici o l'attivazione da parte di citochine di vie di trasduzione della "morte cellulare" sono in grado di attivare l'apoptosi. Quest'ultima è un evento importante durante l'embriogenesi e rappresenta probabilmente un meccanismo di protezione contro l'insorgenza del fenotipo trasformato. D'altra parte le alterazioni molecolari che si sviluppano nei processi di trasformazione neoplastica a carico dei componenti dei circuiti regolativi della trasmissione del segnale mitogenico e del ciclo cellulare assicurano alle cellule neoplastiche la sopravvivenza nell'ospite e le proteggono dall'insorgenza dell'apoptosi. Infatti il recettore per l'EGF (EGF-R) è spesso iperespresso nelle cellule tumorali epiteliali e media un effetto antiapoptotico in numerosi modelli cellulari tumorali. Inoltre citochine come l'interferone alfa possono indurre aumento dell'espressione e dell'attività dell'EGF-R che è una risposta protettiva antiapoptotica mediata da una via ras->erk-dipendente. Analogamente i diversi sottotipi del recettore per l'insulina (IR) sono diversamente coinvolti negli effetti metabolici cellulari o nella protezione delle cellule tumorali dall'apoptosi. Inoltre sembra che l'IR-A abbia un ruolo nella ormono-resistenza del carcinoma mammario e della prostata. A questo proposito recentemente è stato messo in evidenza un cross-talk tra i recettori androgenici e la via di trasduzione delle mitogen activated protein kinase (MAPK) dipendente da ras e src in cellule prostatiche. In particolare l'attivazione di MAPK mediata da ras/src potrebbe essere una delle cause dell'insorgenza della ormono-resistenza nel carcinoma prostatico. In questa patologia comincia ad apparire importante l'interazione tra la componente mesenchimale fibroblastica ed il tessuto tumorale nella induzione della proliferazione e di meccanismi di sopravvivenza che coinvolgono vie di trasduzione del segnale. Inoltre appare sempre più evidente il rapporto tra la morte cellulare, il signalling e i fattori coinvolti nella sintesi proteica (come il fattore di inizio della sintesi proteica 5A [eIF-5A] nella protezione da apoptosi e il fattore di allungamento 1A [EF-1A] nella induzione). Pertanto l'intervento su tali fattori potrebbe essere un'utile strumento per poter potenziare le capacità anti-tumorali di agenti o citochine. Un altro livello di regolazione della proliferazione e dell'apoptosi è inoltre rappresentato dalle modifiche post-traduzionali delle proteine. Un esempio è costituito proprio dall'eIF-5A che, per essere attivato, ha bisogno della modifica post-traduzionale poliamina-dipendente di un residuo di lisina che viene trasformato in ipusina. L'eIF-5A può essere a sua volta modificato dalla tTG ed in questo modo inattivato. Un'altra posibilità di modulazione dell'attività delle proteine correlate con la proliferazione cellulare è la loro degradazione via proteasoma ubiquitin-dipendente (altra modifica post-traduzionale). Infine i prodotti ossidativi della reazione delle poliamine con la diaminoossidasi possono essere coinvolti essi stessi nella induzione di apoptosi. Sulla base di tali premesse il nostro progetto di ricerca intende studiare i meccanismi molecolari con i quali i fattori della sintesi proteica (eIF-5A e EF-1A) e le vie di trasduzione del segnale EGF o IR o androgeno-dipendenti regolano l'apoptosi in cellule tumorali in risposta o non ad agenti anti-tumorali. Inoltre verrà indagato il ruolo delle modifiche post-traduzionali delle proteine (formazione dell'ipusina, transglutaminazione, ossidazione, ubiquitinazione e conseguente degradazione) nella regolazione delle vie di trasduzione che controllano l'apoptosi. Il risultato finale del progetto sarà l'identificazione di nuove strategie terapeutiche basate sull'interruzione delle vie di "escape" dall'apoptosi (EGF o IR-dipendenti o eIF-5A- o PKA- mediati o ubiquitin-dipendenti) o dell'attivazione di interruttori molecolari positivi (EF-1A o BSAO o tTGAsi o formazione di prodotti di ossidazione) di morte cellulare allo scopo di potenziare l'efficacia terapeutica di agenti tumorali o citochine. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

L'interferone alfa (IFNa) è una citochina di largo impiego nella terapia delle neoplasie ematologiche e di alcuni tumori solidi. Il suo meccanismo di azione antiproliferativa non è ancora stato chiarito anche se potrebbe esplicarsi almeno in parte attraverso l'induzione di apoptosi. D'altra parte il recettore per l'epidermal growth factor (EGF-R) ed i suoi ligandi sono importanti fattori di sopravvivenza delle cellule tumorali di origine epiteliale proteggendo queste ultime dall'innesco di processi di apoptosi. L'HNSCC è un tumore scarsamente sensibile agli agenti chemioterapici convenzionali e studi clinici che impiegano l'IFNa in associazione con l'acido cis-retinoico sono in corso. L'unità operativa del prof. Abbruzzese ha recentemente dimostrato che le cellule di carcinoma epidermoide umano esposte all'IFNa vanno incontro ad apoptosi e che l'EGF è in grado di antagonizzare tale effetto. L'apoptosi indotta dall'IFNa si verifica nell'ambito di una risposta da stress delle cellule neoplastiche. Infatti è stato rilevato un incremento dell'espressione di heat shock proteins e dell'attività di Jun kinase-1 (JNK-1), enzima "terminale" di un pathway attivato da stress, nelle cellule esposte ad IFNa ed ancora l'EGF è in grado di antagonizzare tale evento (1). Inoltre l'unità ha dimostrato il coinvolgimento di JNK-1 nell'apoptosi indotta da IFNa. L'IFNa, nelle medesime condizioni sperimentali, induce una iperattivazione della via di trasduzione del segnale EGF-dipendente e l'impiego sia di un dominante negativo di ras che di un inibitore farmacologico selettivo di mitogen extracelluar regulated kinase-1 o mek-1 è in grado di potenziare l'apoptosi indotta dall'IFNa ed è quindi una via di sopravvivenza indotta dalla citochina (2). Un altro pathway (dipendente da fattori di crescita) di sopravvivenza e di resistenza dall'innesco di apoptosi è quello coinvolgente l'insulin-like growth factor I e II (IGF-I ed IGF-II) ed il loro recettore associato (IGF-I-R) (3). Infatti il sistema dell'IGF sembra attivare le due vie che prevengono l'apoptosi nelle cellule eucariotiche ed è iperespresso in numerose neoplasie solide e l'IGF-II, un fattore di crescita importante nella vita fetale, ma non presente nel tessuto adulto, può essere riespresso nelle neoplasie (4,5). L'Unità Belfiore ha recentemente identificato l'esistenza di un secondo loop anti-apoptotico coinvolgente l'IGF-II ed il recettore per l'insulina (IR). Infatti una delle due isoforme dell'IR (IR-A) lega l'IGF-II con un'alta affinità ed è espresso predominantemente durante la vita fetale ed in alcune neoplasie umane (6,7). Nei tessuti adulti è stata rilevata una bassa espressione di IR che, invece, risulta elevata nella loro controparte trasformata (principalmente carcinomi tiroidei e mammari). Inoltre l'attivazione di IR-A da parte di IGF-II induce un più potente effetto mitogenico rispetto a quello causato dalla stessa insulina e la via di trasduzione del segnale attivata in seguito all'interazione con l'IGF-II è la stessa dell'IGF-I-R. L'espressione differenziale delle due isoforme del recettore insulinico costituisce un interruttore molecolare per deviare il segnale dal recettore insulinico al recettore dell'IGF-I e l'espressione di IR-A è maggiore nei tumori poco differenziati. Sulla base di queste considerazioni il loop IR-A/IGF-II appare un altro interessante target per l'induzione di apoptosi in cellule tumorali umane.
Tra i sistemi di trasduzione dei segnali, il complesso trasmembrana costituito da Recettore/G-protein/Adenilato ciclasi ha come effetto la modulazione del secondo messaggero cAMP, che agisce reclutando una proteina chinasi, la PKA, che controlla direttamente l'attività dei fattori di trascrizione CREB e CREM, supposti essere largamente responsabili per l'espressione dei geni cAMP-dipendenti (18, 19). La fosforilazione di proteine chiave coinvolte nella trasduzione del segnale (recettori, G-protein, enzimi amplificatori come fosfolipasi e adenilato ciclasi, small G-protein, cascata delle MAP-chinasi) mediata dalla PKA, può produrre attenuazioni o amplificazioni di segnali di crescita e differenziazione cellulare. L'Unità Illiano studia in particolare: la stabilità delle proteine componenti il sistema adenilato ciclasi, e la sua regolazione attraverso l'acido retinoico. L'acido all-trans Retinoico (ATRA), così come tutti gli ormoni steroidei (20,21), per molti anni è stato ritenuto esercitare tutti i suoi effetti attraverso l'interazione dei suoi recettori con la cromatina. Dati prodotti nel laboratorio dell'unità Illiano indicano un coinvolgimento dell'AC in questo senso (Illiano et AL, BBA, 2000) ed è opinione che gli effetti sull'AC non siano esclusivamente risposte post-nucleari, ma che qualche anello del sistema enzimatico sia direttamente modulato da esso come ad es. il pathway PKA/PKC. L'unità Illiano ritiene che il sistema di degradazione proteica ubiquitina/proteasoma possa funzionare sul complesso AC come un ulteriore sistema di regolazione. Il sistema ubiquitina/proteasoma è il principale sistema proteolitico non-lisosomiale in cellule eucariotiche (22), responsabile del turnover altamente selettivo di un gran numero di proteine regolatorie, ivi compresi molti effettori dei sistemi di trasduzione dei segnali (23). La degradazione proteolitica dipendente dall'ubiquitina, piccola proteina di 76 aa, è una complessa via del metabolismo proteico, implicata in una varietà di funzioni cellulari, che includono tra le altre il controllo della crescita e del ciclo cellulare (24, 25). La selettiva degradazione di proteine, mediata dal sistema ubiquitina/proteasoma, comporta la regolazione di espressione di proteine con importanti ruoli regolatori, come fattori di trascrizione, modulatori del ciclo cellulare (cicline, cdks, cdki, p53, c-myc, c-jun, c-fos, NF-kB, Ik-B) e trasduttori del segnale(26, 27). In considerazione, inoltre, di dati sperimentali prodotti nel laboratorio dell'Unità Illiano, la stessa Unità sta studiando le interrelazioni funzionali esistenti tra il complesso AC e il sistema ubiquitina/proteasoma e questo argomento rappresenta il punto centrale del loro progetto di ricerca (26, 27).
A riguardo della regolazione post-traduzionale dell'espressione proteica l'Unità Abbruzzese ha recentemente pubblicato che l'apoptosi indotta dall'IFNa è almeno parzialmente mediata dall'incremento dell'espressione e dell'attività della tTG causata da una riduzione della ubiquitinazione e della conseguente degradazione proteasoma-dipendente della tTG (28).Quest'ultimo costituisce un esempio dell'importanza delle modifiche post-traduzionali (ubiquitinazione e transglutaminazione) nel determinismo apoptotico.
Negli eucarioti, eubatteri ed archeobatteri, il processo di sintesi proteica segue lo stesso schema generale e rappresenta una tappa importante nel controllo della espressione genica e crescita cellulare (29). Il processo di traduzione consiste di tre tappe principali: inizio, allungamento e terminazione (29). E' da tempo riconosciuto che, nella regolazione della sintesi proteica, il controllo a livello della fase d'inizio ha un ruolo fondamentale. A questo proposito un altro interesse dell'unità operativa del Prof. Abbruzzese è lo studio del fattore eucariotico di inizio della sintesi proteica 5A (eIF-5A), una proteina di peso molecolare 18.000, che subisce una serie di modifiche post-traduzionali che coinvolgono il residuo di lisina 50 e portano alla formazione dell'aminoacido ipusina, correlato all'attività di eIF-5A ed alla proliferazione cellulare (30-35). La predetta unità ha recentemente rilevato che l'inibizione proliferativa e l'apoptosi indotte dall'IFNa in cellule di carcinoma epidermoide avviene in parallelo alla riduzione della sintesi di ipusina e presumibilmente dell'attività di eIF-5A (36). Numerosi studi indicano che negli eucarioti il controllo della sintesi a livello del ciclo di allungamento è parimenti importante durante il ciclo cellulare (37), l'heat shock (38), il trattamento con esteri del forbolo (39), ormoni e mitogeni (40), fattori di crescita (41), l'invecchiamento (42), lo stress ossidativo (43). Diversi fattori coinvolti nella sintesi proteica hanno mostrano proprietà di regolazione come ad esempio alcuni fattori di inizio (eIF-5A) (44) e il fattore di allungamento 2 (EF-2) la cui attività è modulata da modifiche post-traduzionali come l'ADP ribosilazione (45) e la fosforilazione (46, 47). Anche il fattore di allungamento 1A (EF-1A) è stato recentemente dimostrato essere coinvolto nella trasformazione tumorale del carcinoma della prostata. In tali cellule neoplastiche è stato identificato un oncogene dominante: PTI-1 (induttore del tumore della prostata). L'espressione di tale oncogene è stata anche rilevata in linee cellulari di carcinoma del polmone, del colon e della mammella, ma non nelle controparti normali. Il cDNA di PTI-1 è costituito da 2123 bp e caratterizzato da una 5'-UTR di 630 bp, con omologia all'RNA ribosomiale 23 S di Mycoplasma hyopneumoniae, legata ad una sequenza che corrisponde ad EF-1A umano troncato all'estremità N-terminale e con sei mutazioni puntiformi. Bloccando l'espressione di PTI-1 in linee cellulari trasformate esprimenti tale proteina con PTI-1 antisenso, si osserva una reversione del fenotipo tumorale. Il meccanismo con il quale questo oncogene agisce potrebbe essere legato ad un fenomeno di "infedeltà della traduzione" (48). L'espressione di EF-1A è anche correlata con il potenziale metastatico del carcinoma della mammella. L'azione di EF-1A in tale fenomeno è probabilmente dovuta alla sua interazione con la F-actina del citoscheletro. In entrambi i tipi cellulari EF-1A lega la F-actina, ma nelle cellule metastatiche si lega con affinità ridotta, determinando una modificazione nell'organizzazione citoscheletrica, condizione necessaria al processo metastatico (49). Dati recenti in letteratura, mostrano anche un ruolo di EF-1A in fenomeni di morte cellulare programmata. Infatti si è visto che l'espressione di EF-1A è regolata positivamente dal fattore trascrizionale p53 e l'up-regolazione del fattore determina un fenotipo apoptotico in una linea cellulare di eritroleucemia (50, 51). Recentemente EF-1A è stato anche messo in relazione all'apoptosi indotta da stress ossidativo. Si è osservato infatti che il trattamento di una linea cellulare di cardiomiociti con perossido di idrogeno induce un rapido aumento di EF-1A. E' stato inoltre osservato che tale aumento è dovuto ad un meccanismo di regolazione posttrascrizionale. L'uso di cDNA antisenso per EF-1A protegge le cellule dall'apoptosi mediata da perossido di idrogeno, suggerendo che l'upregolazione di EF-1A gioca un ruolo centrale nel programma apoptotico in risposta allo stress ossidativo (52, 53, 54). I risultati sopra descritti dimostrano il ruolo chiave della traduzione nella regolazione della crescita cellulare. Il chiarimento dei meccanismi attraverso i quali eIF-5A e EF-1A regolano direttamente o indirettamente la crescita e la trasformazione cellulare può essere di aiuto a capire il processo di de-regolazione della cellula nella trasformazione neoplastica.
La crescita e la proliferazione cellulare sono regolate da numerosi processi che avvengono a valle della sintesi proteica influenzati dalla presenza di poliammine. Nello sviluppo di nuove terapie antitumorali é da tenere in considerazione la differenza fra cellule normali e tumorali. Tale differenza consiste, tra l'altro, nel diverso metabolismo e nella diversa concentrazione di poliammine. Nei tessuti in crescita ed in quello tumorale il livello delle poliamine e delle aminossidasi aumenta notevolmente rispetto alle cellule normali (55). Inibitori degli enzimi coinvolti nella biosintesi delle poliamine (a tale riguardo le unità Agostinelli ed Abbruzzese hanno già dimostrato che le transglutaminasi tissutali attraverso la depezione di poliamine intracellulari possono avere un ruolo nella regolazione dell'attività dell'eIF-5A e della proliferazione cellulare) possono diminuire le loro concentrazioni nelle cellule, causando un effetto citostatici. L'Unità Agostinelli sta sperimentando un altro approccio che utilizza l'alto contenuto di poliamine presente nelle cellule tumorali (56). Si é osservato infatti un effetto citotossico dell'aminossidasi purificata dal siero bovino (BSAO), su colture cellulari di cellule ovariche di hamster cinese (CHO), in presenza di spermina esogena (57, 58). La BSAO é un enzima che catalizza la deaminazione ossidativa dei gruppi primari delle poliamine con formazione di acqua ossigenata, aldeide(i) ed ammoniaca. L'acqua ossigenata e l'aldeide(i) sono responsabili della citotossicità. Precedenti studi hanno dimostrato che a 37 °C, in presenza di concentrazioni di spermina inferiori a 50 micromolare l'acqua ossigenata sia il solo composto citotossico e che la catalsi esogena protegga la cellula dall'effetto citotossico (59). L'aldeide(i) causa citotossicità a più alte concentrazioni di spermina. Catalasi ed aldeide deidrogenasi, ed anche glucosio, sono capaci di proteggere le cellule dall'effetto citotossico dei prodotti di ossidazione della spermina generati nell'ambiente extracellulare. Altri aspetti della ricerca hanno riguardato la possibilità di sfruttare l'alto contenuto di poliamine in cellule tumorali allo scopo di individuare nuove strategie terapeutiche dirette contro il cancro (60). Infatti l'Unità Agostinelli ha recentemente pubblicato che la diaminoossidasi attraverso la formazione di aldeidi tossiche può indurre citotossicità in cellule tumorali farmaco-resistenti (61). <<<