RICERCA ITALIANA     

Analisi dell'interazione tra la proteina del nucleoide batterico H-NS e il DNA: caratterizzazione molecolare dei siti di nucleazione.

Università degli Studi di Camerino

Abstract

L'impaccamento del DNA e l'organizzazione strutturale della cromatina nelle cellule batteriche è affidata ad un gruppo di proteine leganti il DNA (H-NS, HU, IHF, StpA, Lrp, FIS and Dps), che vengono genericamente definite proteine istone-simili.
H-NS è una delle proteine più abbondanti associate con il nucleoide in Escherichia coli (così come in altri Enterobatteri). Oltre a partecipare all'organizzazione strutturale del cromosoma batterico, questa proteina è anche coinvolta nella regolazione, esercitata principalmente a livello trascrizionale, di un consistente gruppo di geni. Le basi strutturali che permettono ad H-NS di svolgere la sua funzione, risiedono nella capacità di questa proteina di riconoscere e legare in maniera specifica delle regioni di DNA intrinsecamente curvo, che si ritrovano frequentemente a monte di sequenze promotrici. E' noto che tali regioni contengono molto spesso delle sequenze ripetute di adenine, ed è stato dimostrato che svolgono una funzione di elementi regolatori, tuttavia il ruolo di questi tratti di DNA curvo è pressoché sconosciuto. In questo contesto, ci sono ancora molti problemi insoluti, che riguardano: a) la procedura dinamica mediante la quale H-NS è in grado di discriminare tra un legame specifico ed un legame non-specifico al DNA, b) i cambiamenti conformazionali indotti sulla proteina a seguito del legame al DNA, che potrebbero coinvolgere anche riarrangiamenti all'interno di domini adiacenti, fino a modificare la struttura quaternaria della proteina, c) la struttura intrinseca (e la conformazione) delle sequenze di DNA che rappresentano il bersaglio preferenziale di H-NS, d) il grado di deformazione del DNA causato dal legame di H-NS.
Questo programma di ricerca si prefigge come scopo di investigare alcuni dei dettagli dell'interazione H-NS-DNA, focalizzando l'attenzione sul mutuo riconoscimento che avviene nei siti di nucleazione di questo legame. La nostra strategia è basata sull'uso di un approccio integrato di analisi di genetica molecolare e biologia strutturale. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Roberto SPURIO Università degli Studi di CAMERINO

Obiettivo del Programma di Ricerca

Gli obiettivi principali che ci prefiggiamo in questo progetto di ricerca sono qui di seguito elencati:
1. identificazione di una sequenza "consenso" riconosciuta dalla proteina H-NS di E.coli, per mezzo di esperimenti di footprinting.
Per far ciò intendiamo utilizzare il dominio C-terminale di H-NS (H-NS 1-88), per estendere un'analisi (di cui abbiamo alcuni dati preliminari a disposizione) del legame a sequenze ben definite all'interno di promotori di geni che sono sotto il controllo di H-NS. Un simile approccio verrà realizzato utilizzando la proteina intera, in esperimenti di footprinting ad alta risoluzione, combinati con l'uso di apparecchiature che permettono l'esecuzione di cinetiche rapide. Questa parte del progetto verrà realizzata presso l'Università di Camerino, con il coinvolgimento parziale di uno studente di dottorato e di un borsista che si occuperà a tempo pieno di questo compito.
2. analisi strutturale, eseguita mediante spettroscopia NMR multidimensionale, delle basi molecolari che governano la specificità dell'interazione tra H-NS e il DNA.
La responsabilità per il raggiungimento di questo obiettivo sarà a carico del Dr. Marco Sette (Università di Roma), il quale possiede l'esperienza scientifica necessaria per affrontare tutti i differenti aspetti di biologia strutturale descritti in questo programma di ricerca. In aggiunta ad alcuni strumenti disponibili presso l'Università di Roma, potrà usufruire del necessario tempo-macchina per l'utilizzo di due strumenti per NMR localizzati rispettivamente presso il centro di ricerche IRBM di Pomezia (un Bruker AVANCE da 600 MHz, equipaggiato con una sonda "cryoprobe"), ed il National Institute for Medical Research di Londra (un VARIAN da 800 MHz). Nel corso di un lavoro eseguito di recente con il Dr. Sette, siamo stati in grado di ottenere una quantità rilevante di dati (spettri NMR), che abbiamo utilizzato per assegnare i segnali derivanti dal dominio C-terminale di H-NS marcato con isotopi stabili (13C/15N). Avendo a disposizione questo set di dati, ed i risultati derivanti dagli esperimenti di footprinting, ci proponiamo di analizzare: a) per quanto riguarda la proteina, i determinanti molecolari coinvolti nell'interazione con il DNA; b) per quel che concerne il DNA, le caratteristiche strutturali dei frammenti (oligonucleotidi) che rappresentano un bersaglio preferenziale per H-NS. In definitiva, il nostro obiettivo prevede di eseguire una comparazione delle variazioni strutturali/conformazionali, sia sulla proteina che sul DNA target, che hanno luogo a seguito del legame di H-NS (1-88) al DNA, e sulla base di questi risultati di riuscire a costruire un modello del complesso DNA-proteina, che tenga anche conto dei dati di mutagenesi ottenuti da vari gruppi di ricerca.
3. indagine sul ruolo svolto dal dominio N-terminale nel modulare le proprietà di legame al DNA da parte di H-NS. Questo aspetto verrà curato dalla Dr. M. Lammi (Università della Calabria) che effettuerà le reazioni di mutagenesi, le varie manipolazioni di DNA e le purificazioni di una serie di mutanti con alterate proprietà di oligomerizzazione. La collaborazione con questa ricercatrice è in corso ormai da molti anni, e recentemente si è intensificata in relazione ad un progetto riguardante le relazioni struttura-funzione dei fattori d'inizio traduzionali.
Con l'aiuto di queste proteine mutanti, che verranno realizzate con lo scopo di indebolire le interazioni che risultano nella formazione di dimeri, ci proponiamo di valutare il contributo dato dal dominio N-terminale di H-NS al riconoscimento di siti specifici sul DNA, ed inoltre di riuscire a monitorare la reazione di copertura di siti immediatamente adiacenti ai punti di nucleazione. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il nucleoide batterico si distingue dal nucleo di una cellula eucariotica per una serie di caratteristiche fondamentali, tra cui la mancanza di una membrana che separa il DNA cromosomale dal citosol e l'assenza di un'organizzazione strutturale del DNA in nucleosomi. In assenza di istoni, un set di proteine associate col nucleoide riveste una frazione consistente del cromosoma nelle cellule batteriche. Alcune review di riferimento che descrivono queste proteine sono Drlica and Rouvier-Yaniv (1987), Schmid (1988) e Murphy and Zimmermann (1997). L'organizzazione del DNA a costituire una struttura condensata nel nucleoide, implica la formazione di un serie di strutture (40-200) a forma di "loop" della grandezza variabile tra 10 e 100 Kbp, nelle quali il DNA è topologicamente vincolato. All'interno di questi domini, che risultano indipendenti da un punto di vista topologico, il DNA è superavvolto negativamente, e una porzione di deficit di "linking number" si ritiene sia stabilizzata da interazioni con le principali proteine del nucleoide, probabilmente in sinergia con una serie di poliamine (es. spermidina). Si ritiene che il nucleoide batterico sia costituito principalmente da cinque proteine: H-NS e il suo paralogo StpA, HU e il suo paralogo IHF e Fis.
1- Caratteristiche generali di H-NS
H-NS (histone-like nucleoid-structuring protein), l'oggetto di questo progetto di ricerca, è una tra le più abbondanti proteine che legano il DNA in Escherichia coli (Lammi et al.1984, Spassky et al.1984, Falconi et al.1988). Geni che codificano per proteine omologhe ad H-NS sono stati ritrovati in tutte le Enterobatteriacee, così come in batteri Gram-positivi isolati da habitat molto differenti da un punto di vista ecologico (La Teana et al.1989, Bertin et al.2001, Tendeng et al.2003). In E.coli H-NS è una proteina costituita da 136 residui (Mr= 15.6 KDa), codificata da hns, un gene localizzato a 27min. sul cromosoma (Pon et al.1988). Per questa proteina è stato ipotizzato un ruolo strutturale nell'organizzazione della cromatina batterica, tenendo conto della relativa abbondanza (fino a 100.000 molecole espresse come dimeri/cellula), delle sue proprietà biochimiche, e della sua localizzazione nel nucleoide (Durrenberger et al.1991).
2- Regolazione della trascrizione da parte di H-NS
Sono stati eseguiti diversi studi per analizzare l'espressione genica su scala globale comparando cellule wild-type e cellule recanti mutazioni nel gene hns. Sia le analisi effettuate mediante gel bidimensionali dei pattern di espressione delle proteine che, più recentemente, analisi mediante microarray, hanno dimostrato che un certo numero di geni (circa 100) mostra un pattern di espressione alterato, ed è direttamente o indirettamente controllato da H-NS (Bertin et al.1990, Yoshida et al.1993, Hommais et al.2001, Nasser e Reverchon, 2002). Una caratteristica che emerge da questo tipo di analisi è che una gran parte dei geni regolati (generalmente repressi) da H-NS è coinvolta nell'adattamento della cellula batterica a cambiamenti delle condizioni ambientali o a situazioni di stress (Hommais et al.2001, Dorman,2004). Il silenziamento genico operato da H-NS è stato studiato in dettaglio a livello molecolare nel caso dei geni hns, cspA e virF, e negli operoni rrnB, bgl e proU (Falconi et al.1993, Lucht et al.1994, Falconi et al.1996, Falconi et al.1998, Brandi et al.1999, Afflerbach et al.1999). Dalla comparazione dei geni controllati da H-NS, è risultato che molto probabilmente H-NS riconosce delle particolari caratteristiche strutturali del DNA bersaglio; in particolar modo sono state identificate delle regioni di DNA intrinsecamente curvo associate alle sequenze promotrici di tali geni (Rimsky et al.2001).
3- Proprietà fisiche di H-NS
3a- Caratteristiche strutturali dei domini
H-NS è organizzata in due domini strutturalmente distinti: un dominio N-terminale (residui 1-64) responsabile della dimerizzazione-oligomerizzazione, e un dominio C-terminale (residui 89-136) coinvolto nel legame al DNA; tra questi due domini è presente un linker flessibile, particolarmente sensibile all'azione delle proteasi (Shindo et al.1995, Esposito et al.2002, Renzoni et al.2001, Schroder et al.2001). Il dominio N-terminale è composto da tre alfa-eliche di cui due corte ed una particolarmente lunga (25 residui), separate da corte sequenze linker. L'elica lunga, denominata H3, forma una struttura "coiled coil" a seguito di formazione di dimeri. Recentemente è stata determinata la struttura dei cristalli del dominio N-terminale di VicH, una proteina simile ad H-NS presente in Vibrio cholerae. Questa analisi convalida un modello precedente, ottenuto mediante NMR, e conferma che questo dominio forma dei dimeri e adotta un ripiegamento peculiare, in cui i due monomeri stabiliscono un esteso contatto "intertwined" (Bloch et al.2003, Cerdan et al.2003). La struttura NMR del dominio C-terminale (residui 89-136) ha rivelato un ripiegamento piuttosto inusuale per un polipeptide che lega il DNA; esso consiste di due avvolgimenti di tipo beta antiparalleli, seguiti da un'alfa elica e da un'elica di tipo 3-10 (Shindo et al.1995).
3-b Oligomerizzazione
Nessuno degli studi strutturali sopra citati ha potuto fornire dati inequivocabili riguardanti la struttura quaternaria di H-NS, che consisterebbe di aggregati eterodispersi di trimeri (Renzoni et al.2001) o di monomeri, dimeri e tetrameri in equilibrio dinamico (Falconi et al.,1988, Ueguchi et al.1996, Spurio et al.1997, Ceschini et al.2000). Sulla basi di dati biochimici (Tippner e Wagner,1995), genetici (Ueguchi et al.1996, 1997, Williams et al.1996) e derivanti da analisi spettroscopiche (Shindo et al.1995, Smyth et al.2000, Renzoni et al.2001), si è costruito un modello, generalmente accettato, secondo cui il dominio N-terminale contiene alcuni dei determinanti molecolari richiesti per le interazioni proteina-proteina. A supporto di questa ipotesi, c'è il comportamento del mutante Leu30/Pro. Questa sostituzione aminoacidica altera la formazione dell'elica H3 (localizzata tra i residui 22 e 46), che è coinvolta nella formazione dei trimeri secondo il modello di Renzoni et al. (2001), ed interferisce anche con la formazione dei complessi dimerici secondo Ueguchi et al.(1997). Meno definito, invece, è il ruolo svolto dal dominio C-terminale, del quale è stata dimostrata la capacità di legare il DNA, ma di cui non si può escludere anche un coinvolgimento nella formazione di oligomeri (dimeri e/o tetrametri). Infatti, mentre il dominio C-terminale isolato mostra una bassa affinità per il DNA (Shindo et al.1995, 1999), delle mutazioni all'interno di questo dominio (delezione della Prolina115 e sostituzione del Trp108) non alterano la capacità basale della proteina di legare il DNA, ma interferiscono significativamente nella formazione di interazioni proteina-proteina e, di conseguenza, nel riconoscimento di un DNA curvo da parte di H-NS (Spurio et al.1997).
In un recente lavoro svolto presso il nostro laboratorio, sono state utilizzate due tipi di fusioni geniche allo scopo di investigare lo stato di oligomerizzazione di H-NS in vivo (Stella et al.2005, sottoposto a revisione). In questo studio si dimostra che: a) H-NS è in grado di formare sia dimeri che tetrametri nella cellula, b) il dominio N-terminale della proteina non è in grado di oligomerizzare in assenza del linker, mentre il dominio C-terminale (da sempre ritenuto esclusivamente un "DNA-binding domain"), è in grado di formare dimeri in vivo con una buona efficienza, ma non forma tetrameri.
4- Proprietà di legame al DNA
H-NS si lega con un'elevata affinità, ma con bassa specificità di sequenza al DNA a doppio filamento lineare o circolare, e riconosce in maniera preferenziale regioni di DNA curvo (Yamada et al.1990, Dame et al.2001). Il legame di H-NS in vitro a plasmidi circolari covalentemente chiusi produce un compattamento del substrato, senza alterare significativamente il linking number (Spassky et al.1984); inoltre la sua iperproduzione in vivo causa un processo di condensazione molto evidente del DNA cromosomale batterico (Spurio et al.1992).
Diversi esperimenti di DNA footprinting e di ritardo della mobilità elettroforetica hanno evidenziato che H-NS dimostra una marcata affinità per siti di DNA distanti tra loro e, dopo aver occupato questi regioni si propaga attraverso una serie di interazioni cooperative fino a ricoprire siti molto estesi, per i quali dimostra in generale una minore specificità di legame (Falconi et al.1993, Lucht et al.1994, Zhang et al.1996, Falconi et al.1998).
Il sito in cui avviene il legame iniziale serve quindi da punto di nucleazione per far sì che si inneschi una reazione di "polimerizzazione" lungo il DNA.
5- Problemi non risolti
In relazione al nostro programma di ricerca, ci sono almeno due aspetti fondamentali che meritano un'indagine approfondita: a) comprendere le basi molecolari che governano la specificità di interazione tra H-NS e il DNA; b) chiarire il meccanismo che è alla base di questo legame, e le conseguenze strutturali che ne derivano.
I dati disponibili in questo momento suggeriscono che H-NS possa essere coinvolta in diverse (e alternative) modalità di legame al DNA, ed allo stesso tempo possa costituire diverse strutture oligomeriche. Al livello delle sequenze -35 e -10 dei promotori, dove la disponibilità di RNA polimerasi deve essere finemente regolata, anche il legame di H-NS al DNA (e/o a siti multipli del DNA) deve avvenire con modalità molto precise. Come questo processo avvenga, quale siano le caratteristiche di sequenza e strutturali dei punti di nucleazione, e se siano adottate delle strategie di validità generale da parte di H-NS, sono tutti problemi non risolti. In aggiunta, sono stati proposti diversi modelli di "DNA bridging", ma non è mai stata investigata in dettaglio la sequenza temporale degli eventi che causano il ripiegamento del DNA e, di conseguenza, l'occlusione di una regione promotrice. <<<