RICERCA ITALIANA     

Metodi non invasivi per lo studio delle basi biologiche e fisiopatologiche delle malattie respiratorie: applicazioni cliniche ed epidemiologiche.

Università degli Studi di Parma

Abstract

Le malattie dell'apparato respiratorio rappresentano a tutt'oggi la terza causa di morte in Italia, dopo le malattie cardiovascolari ed i tumori. La distribuzione delle malattie respiratorie è cambiata significativamente nell'ultimo secolo per la netta riduzione della mortalità per tubercolosi e polmonite, a fronte di un aumento delle patologie cronico-degenerative, quali la broncopneumopatia cromica ostruttiva (BPCO) e l'asma bronchiale.
L'interesse per il ruolo dell'infiammazione delle vie aeree nello sviluppo e nella progressione di diverse malattie polmonari, in particolare dell'asma bronchiale e della BPCO, si è accentuato negli ultimi anni, anche grazie a nuove possibilità di indagine non invasive che si stanno rendendo disponibili e che comprendono l'analisi di gas, vapori ed aerosol nell'aria esalata e l'esame dell'espettorato indotto. L'aria esalata può essere analizzata per individuare indicatori biologici di patologia polmonare e, sotto questo profilo, sembra molto promettente il condensato dell'aria espirata (CAE), un fluido ottenuto raffreddando l'aria esalata durante la respirazione a volume corrente. Si tratta di una nuova tecnica che può fornire una valutazione indiretta della patobiologia polmonare.
In questo progetto, contando anche sulla complementarietà di diversi laboratori ben attrezzati, applicheremo le tecniche analitiche più sensibili, selettive e specifiche per la validazione di nuovi indicatori nel CAE e nell'espettorato di pazienti con malattie polmonari croniche ad impronta prevalentemente allergica (asma bronchiale) o degenerativa (BPCO), nonché in soggetti ad alto rischio di BPCO e neoplasia polmonare, in quanto fumatori o lavoratori professionalmente esposti ad ossidanti ambientali.
Dall'analisi delle matrici biologiche precedentemente descritte sarà quindi possibile avere informazioni sia sui meccanismi fisiopatologici in atto nelle vie aeree che sulla composizione del fluido di rivestimento broncoalveolare. Queste informazioni possono essere utili per una migliore comprensione dei meccanismi fisiopatologici che stanno alla base dei processi infiammatori dell'asma e della BPCO. Inoltre, queste metodiche non invasive possono essere utilizzate per lo studio delle risposte cellulari e biomolecolari a livello dell'apparato respiratorio in soggetti esposti a sostanze pneumotossiche ed allergizzanti.
Saranno applicate di tecniche analitiche di riferimento basate sulla spettrometria di massa (LC-MS/MS, GC-MS, ICP-MS) sufficientemente sensibili, specifiche e selettive da consentire una migliore comprensione dei meccanismi molecolari con cui gli ossidanti ambientali contribuiscono al deterioramento strutturale e funzionale del polmone
Partecipano al programma ricercatori di differenti discipline (pneumologi, medici del lavoro, tossicologi ed igienisti industriali e patologi generali) che si pongono in un'ottica interdisciplinare, per sviluppare indicatori biologici non invasivi di patologia polmonare allo scopo di: (i) valutare la risposta polmonare a specifici stimoli ambientali (allergeni, ozono, sensibilizzanti, riacutizzazioni) in soggetti con asma e BPCO; (ii) confrontare le metodiche non invasive attualmente disponibili, allo scopo di individuare un pattern di indicatori da utilizzare per lo studio delle pneumopatie e superare i limiti di sensibilità delle prove di funzionalità respiratoria, che si modificano solo tardivamente, permettendo così di individuare livelli di esposizione che non comportino alterazioni apprezzabili della salute dei soggetti esposti; (iii) sviluppare nuovi indicatori per la quantificazione della dose polmonare e per la valutazione degli effetti precoci polmonari in soggetti sani professionalmente esposti a sostanze pneumotossiche. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Antonio MUTTI Università degli Studi di PARMA

Obiettivo del Programma di Ricerca

Partecipano al programma ricercatori di differenti discipline (pneumologi, tossicologi occupazionali ed ambientali, igienisti industriali e patologi generali) che si pongono in un'ottica interdisciplinare, per affrontare insieme i seguenti obiettivi specifici:

a) valutazione dell'utilità clinica degli indicatori non invasivi di flogosi polmonare come strumenti diagnostici e prognostici in pazienti con asma e BPCO;

b) applicazione di metodi non invasivi per la valutazione della risposta polmonare all'esposizione di specifici stimoli (allergeni, ozono, sensibilizzanti, riacutizzazioni) in soggetti con asma e BPCO;

c) sviluppo di nuovi indicatori per la quantificazione della dose polmonare e per la valutazione degli effetti precoci polmonari in soggetti sani professionalmente esposti a sostanze pneumotossiche;

d) confronto tra le attuali metodiche disponibili non invasive allo scopo di individuare un pattern di indicatori da utilizzare per lo studio delle pneumopatie e superare i limiti di sensibilità delle prove di funzionalità respiratoria, che si modificano solo tardivamente, permettendo così di individuare livelli di esposizione che non comportino alterazioni apprezzabili della salute dei soggetti esposti;

e) applicazione di tecniche analitiche di riferimento basate sulla spettrometria di massa (LC-MS/MS, GC-MS, ICP-MS) sufficientemente sensibili, specifiche e selettive da consentire una migliore comprensione dei meccanismi molecolari con cui gli ossidanti ambientali contribuiscono al deterioramento strutturale e funzionale del polmone. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Le patologie respiratorie sono in continuo aumento; si stima che in Italia circa un terzo dei ricoveri ordinari sia dovuto a patologie correlabili con pneumopatie (1). Le malattie dell'apparato respiratorio rappresentano a tutt'oggi la terza causa di morte in Italia, dopo le malattie cardiovascolari ed i tumori (1). La distribuzione delle malattie respiratorie è cambiata significativamente nell'ultimo secolo per la netta riduzione della mortalità per tubercolosi e polmonite, a fronte di un aumento delle patologie cronico-degenerative, quali la broncopneumopatia cromica ostruttiva (BPCO) e l'asma bronchiale (2).

La BPCO, che rappresenta attualmente il 50%-55% di tutte le morti per malattie dell'apparato respiratorio, risulta in costante aumento, sia come mortalità precoce (cioè in numero di anni persi rispetto all'aspettativa di vita), sia come numero di anni passati in condizioni di invalidità. Attualmente è al 5° posto tra le cause di morte a livello mondiale, ma, se il trend di crescita rimane costante, è destinata a raggiungere il 3° posto entro il 2020. La BPCO costituisce una delle principali cause di spesa per i servizi sanitari di tutte le maggiori nazioni industrializzate. In Italia, la BPCO è al quarto posto in una graduatoria delle patologie croniche e la sua prevalenza è stimata nell'ordine del 5-7% circa della popolazione generale, ma il tasso, come in altri paesi industrializzati, raggiunge valori di molto superiori nella popolazione anziana (3,4).

Nonostante la consapevolezza di una situazione allarmante, la BPCO rimane ancora una patologia "fuori controllo" ed uno dei principali motivi viene ritenuto la sottostima diagnostica, dato che nella maggior parte dei casi la malattia è diagnosticata solo nelle fasi avanzate. È necessario pertanto intensificare programmi ed interventi sanitari per ridurre i fattori di rischio ambientali e quelli legati allo stile di vita, aumentare la sensibilità diagnostica e migliorare il controllo della malattia attraverso una ottimizzazione della terapia (5).

Il fattore di rischio più importante nella BPCO è il fumo di sigaretta, ma anche quello di pipa, sigaro, e altri tipi di tabacco; anche il fumo passivo contribuisce a scatenare i sintomi respiratori della BPCO. Esistono altre cause documentate di BPCO quali polveri e agenti chimici (vapori, irritanti e fumi) e cause domestiche di inquinamento da combustibile utilizzato per cucinare e riscaldare in ambienti mal ventilati. Anche l'inquinamento atmosferico si aggiunge alla quantità di particelle inalate dai polmoni, ma il suo impatto sulle cause che conducono alla BPCO non è ancora chiaro (6,7).

L'asma è una malattia in crescita in tutto il mondo, soprattutto tra i bambini. La sua prevalenza può essere stimata in Italia pari ad una percentuale compresa tra il 3% e l'8% della popolazione adulta e fino al 25% dei bambini. Nel 2002 gli italiani costretti a convivere con la malattia erano più di 3 milioni, i ricoveri ospedalieri oltre 29.000, con una degenza media tra 5 e 6 giorni e si sono registrati 1.063 decessi. Si tratta di una patologia in costante aumento, prevalente nei paesi occidentali e nelle zone urbane rispetto a quelle rurali (8).
L'asma è una malattia complessa: i fattori di rischio sono molteplici ed eterogenei e comprendono caratteri geneticamente determinati che modulano la risposta all'esposizione ad allergeni ed inquinanti domestici ed ambientali, abitudini alimentari e stili di vita, come ad esempio fumo attivo e passivo, esposizione professionale ad agenti chimici sensibilizzanti o irritanti (9).

Malgrado gli importanti progressi nelle nostre conoscenze circa l'importanza fisiopatologica dell'infiammazione e dei meccanismi immunologici delle alterazioni tessutali broncopolmonari, che hanno reso possibile lo sviluppo e la disponibilità di nuovi agenti farmacologici, l'incidenza delle malattie respiratorie sta aumentando in modo sproporzionato (10).

Per la valutazione di queste patologie, sono disponibili diversi strumenti, come i test di funzionalità respiratoria, che consentono di ottenere informazioni sulle alterazioni statiche e dinamiche dei volumi polmonari e degli scambi gassosi (11). Le tecniche radiologiche, specie la tomografia ad alta risoluzione, danno informazioni sulla perdita di tessuto polmonare (12). Entrambi gli approcci forniscono misure indirette delle alterazioni morfo-funzionali che si verificano nel polmone a seguito dell'esposizione cronica ad agenti pneumotossici.

Negli ultimi anni, si è accentuato l'interesse per il ruolo dell'infiammazione delle vie aeree nello sviluppo e nella progressione delle broncopneumopatie, in particolare della BPCO e dell'asma bronchiale. Tuttavia, il tipo di infiammazione delle vie aeree inferiori nelle BPCO è significativamente diverso da quello presente nell'asma bronchiale. Infatti, nelle vie aeree inferiori e nel parenchima polmonare dei pazienti con BPCO vi è un aumentato numero di macrofagi alveolari, neutrofili e linfociti T, con aumento del rapporto CD8+/CD4+. Nell'espettorato e nel lavaggio broncoalveolare si osserva un aumento del numero di macrofagi e di granulociti neutrofili (13).

Al contrario, nell'asma bronchiale si nota tipicamente un aumento del numero di granulociti eosinofili e l'attivazione dei mastociti e dei linfociti T CD4+. In entrambe queste malattie infiammatorie croniche delle vie aeree inferiori domina il quadro un'aumentata produzione di citochine (13). Tuttavia, mentre nelle BPCO predominano l'interleuchina (IL)-8 e il fattore di necrosi tumorale alfa (TNFalfa), nell'asma bronchiale predominano l'IL-4, l'IL-5, l'IL-13 e il fattore stimolante le colonie granulocito-macrofagiche (GM-CSF) (14-16).

Le metodiche tradizionalmente impiegate per lo studio della flogosi bronchiale (broncoscopia, lavaggio bronchiale, biopsia bronchiale e transbronchiale), nonostante rappresentino il gold standard di riferimento per lo studio dei processi infiammatori polmonari, a causa della loro invasività non sono adeguate ad un utilizzo routinario nella clinica e nella ricerca, nonché in protocolli di prevenzione sanitaria. Negli ultimi anni sono state introdotte con successo alcune metodiche di indagine meno invasive tra cui l'analisi dell'espettorato indotto (17) e la misura del monossido di azoto (NO) esalato (18).

L'espettorato indotto mediante inalazione di soluzione salina ipertonica ed isotonica infatti è un campione di materiale biologico proveniente dalle vie respiratorie alte e centrali, le cui cellule risultano più abbondanti e più vitali rispetto a quelle provenienti da espettorato spontaneo. L'induzione dell'espettorato è una procedura molto meno invasiva della broncoscopia con lavaggio broncoalveolare (BAL), e per questo più facilmente applicabile in larga scala sia per protocolli diagnostici che di follow-up. Questo esame permette di esaminare le cellule nell'espettorato e quindi di valutare il tipo e l'intensità dell'infiammazione delle vie aeree nel soggetto con asma bronchiale e BPCO (19, 20).

Le ricerche si sono ulteriormente concentrate su tecniche ancora meno invasive, tra cui l'analisi dell'ossido nitrico (NO) esalato. L'ossido nitrico ha origine dalla L-arginina che è convertita in L-citrullina dalla NO-sintetasi (NOS), un enzima che è presente in numerose isoforme. Una di queste, può essere indotta dalle citochine (NOS inducibile) a produrre grandi quantità di NO e per questo motivo la concentrazione di NO è aumentata nell'aria espirata dei pazienti asmatici (21).

Numerosi studi hanno confermato che esiste una relazione tra l'NO esalato ed i segni clinici ed i sintomi dell'asma. Il vantaggio della determinazione dell'NO rispetto ad altri test è che i cambiamenti della sua concentrazione precedono altre modificazion, le prove di funzionalità respiratoria o la broncoprovocazione aspecifica. L'NO esalato è elevato nell'asma bronchiale e negli allergici-atopici, sia adulti sia bambini. Elevati livelli di NO sono fortemente associati con condizioni note per accrescere l'infiammazione delle vie aeree come la provocazione bronchiale specifica, la stagione pollinica, l'allergia agli animali (21).

Lo studio dell'aria esalata si avvale anche di altre metodiche, in particolare notevole interesse sta destando la possibilità di analizzare la composizione del condensato dell'aria espirata (CAE), matrice che è ottenuta raffreddando l'aria esalata durante la respirazione a volume corrente. Il CAE è una matrice biologica relativamente poco esplorata. La sua composizione può essere usata per identificare marcatori biologici di esposizione, di effetto e di suscettibilità per monitorare la tossicità polmonare risultante dall'esposizione a composti chimici, in particolar modo metalli contenuti nel fumo di sigaretta e negli ambienti di lavoro (e di vita) inquinati (22).

I meccanismi che regolano la formazione di CAE non sono del tutto noti, tuttavia si ipotizza che le goccioline di liquido del rivestimento delle vie aeree siano liberate e trasportate dalla corrente di vapore espirata e possono in seguito essere raccolte nel condensatore. I fattori che determinano il numero di aerosol formati non sono stati studiati in dettaglio, anche se è probabile che l'equilibrio fra tensione superficiale, velocità ed umidità dell'aria inalata e cambiamenti nella turbolenza espiratoria svolgano un ruolo importante.
La raccolta di CAE è un metodo completamente non-invasivo per campionare le vie respiratorie, facilmente applicabile anche a casa e che può essere ripetuto anche parecchie volte in studi longitudinali. Varie molecole sono state rilevate nel CAE, compreso perossido di idrogeno, nitrito, nitrato, prostaglandine, leucotrieni, aldeidi, metalli tossici, ecc (23, 24).

Dall'analisi delle tre matrice biologiche precedentemente descritte (espettorato indotto, gas esalati, CAE) è quindi possibile sia avere informazioni sui meccanismi fisiopatologici presenti nelle vie aeree, rilevando i cambiamenti nei livelli dei mediatori, che avere informazioni sulla composizione del fluido di rivestimento broncolaveolare. Queste informazioni possono essere utili per una migliore comprensione dei meccanismi fisiopatologici che stanno alla base dei processi infiammatori di asma e BPCO. Inoltre, queste metodiche non invasive possono essere utilizzate per lo studio delle risposte cellulari e biomolecolari a livello dell'apparato respiratorio in soggetti esposti a sostanze pneumotossiche ed allergizzanti.

In questo progetto, contando anche sulla complementarietà di diversi laboratori ben attrezzati, applicheremo le tecniche analitiche più sensibili, selettive e specifiche per la validazione di nuovi indicatori nel CAE e nell'espettorato di pazienti con malattie polmonari croniche ad impronta prevalentemente allergica (asma bronchiale) o degenerativa (BPCO), nonché in soggetti ad alto rischio di BPCO e neoplasia polmonare, in quanto fumatori o lavoratori professionalmente esposti ad ossidanti ambientali. <<<