RICERCA ITALIANA     

METABOLISMO LOCALE ED ESPRESSIONE GENICA: NUOVE PROSPETTIVE IN CHIRURGIA

Università degli Studi dell'Insubria Varese-Como

Abstract

Fase Sperimentale:
· Ch. Generale
La fase sperimentale prevede la costituzione di tre linee di ricerca di chirurgia addominale sul ratto e sul maiale.
Misurazione intraparenchimale mediante microdialisi dei marker cellulari di danno ischemico, dei radicali liberi dell'ossigeno e dei
fattori di crescita, in corso di ischemia, riperfusione e rigenerazione epatica: studio sperimentale nel ratto.
Prevede l'impiego della microdialisi intra-parenchimale per identificare e quantificare direttamente a livello interstiziale epatico sia l'entità del danno cellulare da ischemia e riperfusione, sia la presenza dei fattori di crescita e la loro entità dopo diversi tipi di tecniche di ischemia.
La microdialisi: nuovo strumento nel monitoraggio del trapianto epatico.
L' implementazione di uno studio sperimentale nel
suino sugli effetti della preservazione del fegato con predeterminati livelli di danno ischemico. La valutazione ex post della relazione
tra danno ischemico, induzione di tolleranza e sopravvivenza del graft.
Microdialisi intraperitoneale: nuovo strumento per monitorare i pazienti sottoposti ad intervento chirurgico colo-rettale.
Prevede di mettere a punto un modello sperimentale di chirurgia addominale colo-rettale nel ratto, verificare la possibilità di
misurazione dei parametri in studio ( piruvati, lattati, glicerolo, glucosio) a livello di liquido peritoneale prelevato mediante
microdialisi.

Fase clinica
-Ch vascolare
L'unità di ricerca ha come scopo l'impiego della microdialisi nel monitoraggio del metabolismo periferico durante rivascolarizzazione degli arti inferiori con ischemia critica.
-vascular biology
In questo contesto, lo scopo del presente studio sarà quello di indagare il metabolismo leucocitario ed endoteliale (con particolare riguardo ai parametri direttamente correlati alla regolazione del processo infiammatorio e della ATH, e al ruolo in questo processo dell'Ang II) nei soggetti sottoposti a trattamento chirurgico per la rivascolarizzazione periferica. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Renzo DIONIGI Università degli Studi INSUBRIA Varese-Como

Obiettivo del Programma di Ricerca

Lo scopo di questo programma di ricerca è la valutazione del metabolismo tissutale di distretti di interesse chirurgico.
Fase Sperimentale
-Ch. Generale
Misurazione intraparenchimale mediante microdialisi dei marker cellulari di danno ischemico, dei radicali liberi dell'ossigeno e dei fattori di crescita, in corso di ischemia, riperfusione e rigenerazione epatica:studio sperimentale nel ratto.
Il fenomeno della rigenerazione epatica dopo asportazione più o meno ampia di parenchima è stato ampiamente dimostrato sia nell'uomo che nell'animale da esperimento. Il meccanismo fisiopatologico alla base di tale fenomeno non è del tutto chiarito. E' ormai dimostrato che a livello epatico cellule normalmente in fase G0, successivamente a fenomeni ischemica e/o epatectomie ritornano in fase G1 determinando una significativa rigenerazione parenchimale compensatoria, per poi tornare in fase G0. Tuttavia non è ancora stato chiarito quali fattori siano responsabili di tale ripresa della attività proliferativa. E' molto probabile che fattori di crescita come EGF, PGF etc possono essere prodotti, localmente e/o a livello intestinale su stimolo ischemico, e quindi stimolare la ri-attivazione cellulare epatica. Nel corso degli anni sono state proposte diverse metodiche per la misurazione della rigenerazione epatica post-epatectomie L'impiego della microdialisi intra-parenchimale sembrerebbe la metodica ideale per identificare e quantificare direttamente a livello interstiziale epatico sia l'entità del danno cellulare da ischemia e riperfusione, sia la presenza dei fattori di crescita e la loro entità dopo diversi tipi di tecniche di ischemia. Lo scopo della ricerca prevede di valutare gli incidi ci danno da ischemia e riperfusione, la produzione di RLO e dei fattori di crescita direttamente a livello del parenchima epatico mediante sonde
da micordialisi parenchimale epatica. Verranno inoltre studiati gli stessi parametri, con particolare attenzione ai fattori di crescita, durante la fase di rigenerazione epatica compensatoria.Lo studio si propone di studiare i medesimi parametri durante e dopo diversi tecniche di ischemia epatica.
La microdialisi: nuovo strumento nel monitoraggio del trapianto epatico.
L' osservazione che il trattamento immunosoppressivo, l'insorgenza e il numero degli episodi di rigetto, e il danno ischemico da preservazione degli organi appaiono strettamente collegati e inversamente correlati alla possibilità di indurre una tolleranza stabile. In sintesi, un organo danneggiato dall'ischemia avrà più probabilità di incorrere in episodi di rigetto e meno probabilità di rispondere ad un trattamento mirato all'induzione di tolleranza stabile. Non è allo stato attuale delle conocenze invece chiaro come questi fattori interagiscano e con quali meccanismi.
Metodi diversi sono stati proposti per monitorare la funzionalità degli organi trapiantati con riferimento al recupero funzionale perioperatorio e postoperatorio. Recentemente la microdialisi è stata preliminarmente valutata per questo scopo, elucidando la possibilità di compiere valutazioni in continua per periodi di tempo prolungati, impiegando biosensori impiantati cronicamente (in modelli sperimentali); Obiettivo dell'unità di ricerca è la formulazione di uno studio sperimentale sugli effetti della preservazione del fegato con predeterminati livelli di danno ischemico. La valutazione della ripresa funzionale dell'organo in relazione ad un protocollo di induzione di tolleranza alloantigene specifica basata sulla somministrazione in monoterapia di ciclosporina ad alte dosi per un periodo limitato di tempo e la valutazione ex post della relazione tra danno ischemico, induzione di tolleranza e
sopravvivenza del graft
microdialisi intraperitoneale: nuovo strumento per monitorare i pazienti sottoposti ad intervento chirurgico colo-rettale.
Prevede l'evoluzione di un modello sperimentale di chirurgia addominale colo-rettale nel ratto, verificare la possibilità di
misurazione dei parametri in studio ( piruvati, lattati, glicerolo, glucosio) a livello di liquido peritoneale prelevato mediante
microdialisi.
Fase Clinica:
-Chirurgia Vascolare
L'unità di ricerca ha come scopo l'impiego della microdialisi nel monitoraggio del metabolismo periferico durante rivascolarizzazione degli arti inferiori con ischemia critica.
- Vascular Biology
Recentemente sono stati documentati sia il ruolo protettivo delle statine nella ATH che la loro efficacia nel ridurre non solo la progressione della placca ma anche gli effetti avversi legati alla endoarterectomia.
In questo contesto, lo scopo principale del presente studio sarà di quello di indagare il metabolismo dei leucociti e delle cellule endoteliali (con particolare riguardo ai parametri direttamente correlati alla regolazione del processo infiammatorio e della ATH, e al ruolo in questo processo dell'Ang II) in soggetti in lista d'attesa per un trattamento chirurgico per la rivascolarizzazione periferica. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

I biosensori costituiscono un capitolo importante della Medicina e stanno progressivamente estendendo le loro applicazioni. Va subito precisato che con il termine di biosensore si intende un complesso costituito da uno strato "sensore" capace di interagire con un particolare composto ed un elemento che funge da trasduttore di segnale e registra queste interazioni. Un biosensore è definito come un dispositivo analitico contenente un sistema biologico reattivo in intimo contatto con un trasduttore di segnale. I sistemi biologici utilizzati possono essere enzimi, anticorpi, membrane biologiche, batteri, cellule, tessuti animali o vegetali; questi interagiscono direttamente o indirettamente con il metabolita da determinare e sono responsabili della specificità del sensore.
Microdialisi e Biosensori
Negli ultimi anni è stato sviluppato un metodo, la microdialisi, che apre la possibilità di prelevare sostanze chimiche dal fluido extracellulare di ogni tessuto del corpo. La microdialisi è una tecnica di campionamento in vivo basata sullo stesso principio della dialisi: in un tubo da dialisi, perfuso con un liquido, le sostanze chimiche diffondono in direzione della concentrazione più bassa sotto la spinta del gradiente di concentrazione. Se il tubo da dialisi è un microtubo di 100-200 mm di diametro e se il flusso è molto basso, pochi ml al minuto, si può pensare di non alterare la concentrazione del fluido extracellulare da analizzare.
Il cuore del sistema è la sonda microdializzatrice, realizzata in diverse geometrie usando sempre pochi millimetri (2-20) di una singola fibra cava da dialisi, simile a quelle usate nella dialisi renale.
Poichè la porosità delle fibre da microdialisi è tale da avere un taglio di esclusione molecolare intorno a 20.000 daltons o più basso (fino a 2.000), si ottiene un campione decisamente "pulito", privo cioè di proteine e di sostanze ad alto peso molecolare che potrebbero interferire con le successive analisi. Per queste ultime, la tecnica analitica più usata è la cromatografia liquida, ma la spettrometria di massa, la luminometria, l'immunoassay e l'elettrochimica sono altre tecniche usate.
I biosensori elettrochimici invece si sono rivelati in questo caso particolarmente idonei. Essi infatti sono specifici e selettivi, capaci cioè di sentire l'analita di interesse o anche più analiti, se usati in serie; hanno una risposta rapidissima, essenziale per misure in tempo reale o per seguire variazioni rapide di eventi metabolici o farmacologici che si intende studiare; sono duttili, capaci cioè di essere costruiti in varie forme e dimensioni anche piccolissime, e di essere alloggiati in celle a flusso continuo suscettibili di essere miniaturizzate; sono riusabili, di lunga durata e di basso costo.
Applicazioni e razionale scientifico
Le membrane endoteliali hanno un ruolo metabolicamente attivo e complesso. Una naturale conseguenza di questa nozione è che lo studio del metabolismo dello spazio intercellulare non può non prescindere dalle modifiche che le sostanze là presenti possono subire attraversando le membrane endoteliali per passare nel torrente circolatorio. Con la tecnica della microdialisi invece il prelievo avviene direttamente nel tessuto in esame. Un ulteriore vantaggio è rappresentato dal fatto che si possono inserire sonde per microdialisi in punti diversi dell'organo da studiare, ottenendo un monitoraggio separato di diverse aree, non ottenibile con altri mezzi. La microdialisi, per la sua natura, è continuamente attiva, permettendo un monitoraggio continuo e non ad intervalli di tempo discreti. Modulando opportunamente la frequenza con cui vengono cambiate le fiale di raccolta si possono ottenere le risoluzioni temporali preferite.
Per i suoi notevoli vantaggi la microdialisi è da molti anni impiegata nel campo delle neuroscienze, dove consente di prelevare sostanze aggirando la barriera ematoencefalica.
Metodo: La sonda per microdialisi è un catetere di polietilene a doppio lume che viene impiantato nel tessuto da studiare
generalmente attraverso una agocannule. La sonda viene perfusa con soluzione fisiologica o altri liquidi biocompatibili (sol.Glucosata, Ringer etc.), iniettata nel lume di ingresso mediante una pompa apposita ad elevata precisione. La parete della sonda, limitatamente alla porzione inserita in posizione intratissutale, è dotata di un segmento di membrana per dialisi. Attraverso di essa le molecole presenti nel fluido interstiziale entrano nel lume della sonda, seguendo i gradienti di concentrazione. Queste sostanze si trovano quindi nella colonna di fluido diretto verso lo sbocco situato al termine di tale lume. Il microdialisato viene poi raccolto all'esterno del paziente mediante microfiale connesse all'apposito adattatore in cui termina la sonda microdialitica. Le sonde per microdialisi sono disponibili in diverse conformazioni adatte a differenti locazioni nel corpo umano. Il cuore del sistema è rappresentato dall'analizzatore automatico CMA-600, che può analizzare tipicamente: glucosio, lattato, glicerolo, urea, piruvato e glutamato. L'analizzatore è dotato di un computer collegabile ai diversi apparati di monitorizzazione clinica del paziente, in modo da fornire un quadro sinottico dei parametri clinici e metabolici. Il microdialisato può in ogni caso essere analizzato anche con apparati diversi qualora si desideri determinare i livelli di altre molecole.Glucosio: Il livello di glucosio nel sangue è correlato dai cambiamenti della sua richiesta nei capillari e dalla richiesta di glucosio
all'interno delle cellule. Una ridotta concentrazione di glucosio è spesso parallela ad una ridotta concentrazione di pO2 ed è indicatore di ridotta perfusione di sangue nel cervello. Si può accoppiare la microdialisi con una microcella a flusso contenente un biosensore elettrochimico per il glucosio, realizzando così un dispositivo per seguire "in vivo" ed in continuo questo metabolita sia su animali che su pazienti. La sonda microdializzatrice viene inserita sottocute sul dorso di un coniglio, o nel braccio di una persona, ed il tampone fisiologico, pompato ad un flusso di 10-30 ml/min, si arricchisce delle sostanze presenti nel fluido interstiziale sottocutaneo prima di passare nella cella a flusso dove è alloggiato il biosensore che ne misura in continuo il contenuto di glucosio.
Lattato: Il lattato è un altro importante metabolita coinvolto nella glicolisi anaerobica ed è importante misurarlo tempestivamente in pazienti ricoverati in unita' intensive per disturbi cardiaci.
Il lattato è un marcatore dell'ischemia tissutale in quanto aumenta in condizioni di metabolismo anaerobio o nelle condizioni di ischemia o basso apporto di O2. L'esercizio fisico si traduce in aumento di lattato sia nel sangue che nel sottocute, che si presta così ad essere un sito di misura alternativo alle misure su sangue, con l'ulteriore vantaggio di permettere un monitoraggio continuo di questo metabolita.
Recenti campi di applicazione in chirurgia
La prospettiva più affascinante di questo accoppiamento microdialisi-biosensore è però quella che, semplicemente cambiando enzima, è possible analizzare un gran numero di altri metaboliti, il lattato ad esempio, o il piruvato (rapporto lattato/piruvato), glicerolo o la colina e acetilcolina, o il glutatione, solo per citare alcuni di quelli importanti in chimica clinica. Brevemente vengono riportati di seguito i campi di applicazione in chirurgia.
Neurochirugia: Sistema nervoso centrale. Rappresenta il campo in cui la microdialisi è stata maggiormente impiegata. Indicazione:
tutte le patologie che producono un danno ischemico (traumi, emorragie, tumori). Scopo: studio della cosidetta "area di penombra",
correlando i dati ottenuti con la pressione intracranica e la SVO2, in modo da determinare la scelta dell'azione terapeutica.
Chirurgia plastica e vascolare: tessuto adiposo e muscolo scheletrico. Misurazione della condizione metabolica di innesti cutanei o di territori rivascolarizzati per determinare la presenza di ischemia tissutale prima che questa sia clinicamente evidente.
Chirugia addominale: La microdialisi è indicata sia per la monitorizzazione del graft nel trapianto di fegato, sia per la scoperta precoce dell'ischemia intestinale dopo interventi di vario tipo, mediante cateteri liberi in cavitˆ peritoneale, in modo molto meno invasivo rispetto al lavaggio peritoneale.
Cardiochirurgia: La microdialisi consente lo studio del metabolismo in porzioni definite del muscolo cardiaco allo scopo di
determinare alterazioni ischemiche con una tempestività superiore ai metodi tradizionali ed una invasivita' minima. E' pubblicata amplissima letteratura sull'uso sperimentale sull'animale, mentre quello clinico sull'uomo è in fase di sviluppo attivo.
ATEROSCLEROSI E INFIAMMAZIONE
Sebbene il processo aterosclerotico sia un evento molto complesso, in cui un elemento centrale è rappresentato dall'ingresso di colesterolo nella parete delle arterie e dall'ossidazione delle lipoproteine all'interno della parete vasale (1-3), diverse evidenze sperimentali sono a favore di un ruolo svolto dai processi infiammatori.
In particolare, l'attenzione è stata posta sullo squilibrio della produzione di citochine (4,5). Le cellule endoteliali (EC) ottenute dall'ateroma nell'uomo, legano monociti e linfociti T; inoltre, l'espressione di VCAM-1 aumenta sulle EC che sovrastano una lesione ateroscleortica iniziale (6). I processi infiammatori sono inoltre responsabili dell'instabilità della placca e di una sua eventuale rottura (7). Infatti, è stato dimostrato che le molecole di adesione solubili sono coinvolte nello sviluppo della placca aterosclerotica e la loro presenza è documentata non solo nella placca, ma anche nel plasma ottenuto dai pazienti. In particolare, oltre a VCAM-1, la P-selectina e ICAM-1, sono fortemente espresse nell'endotelio che sovrasta la placca aterosclerotica umana (8).
Nelle prime fasi dell'aterosclerosi (ATH), i leucociti mononucleati sono reclutati nella parete vasale attraverso un endotelio intatto che esprime molecole di adesione per i leucociti (9) e la migrazione dlele cellule dipende da fattori chemiotattici prodotti nello strato subendoteliale e/o dalle cellule infiammatorie. In questo contesto l'IL-8, prodotta da monociti e da granulociti polimorfonucleati (PMN), ha un ruolo chiave agendo in modo autocrino-paracrino ampliando la risposta infiammatoria sistemica e localmente reclutando cellule infiammatorie. L'espressione di IL-8 è indotta nei monociti e nei macrofagi dalla presenza di LDL ossidata e di colesterolo (10,11). Il tessuto della placca contiene IL-8, derivata principalmente dai macrofagi intimali (12). Sembra che questa citochina acceleri l'ATH incrementando l'adesione monocita-endotelio (13) agendo come fattore mitogenico e chemoattrattante sulle cellule muscolari liscie (14) e mediando l'angiogenesi nella placca (15).
Un'altra citochina di particolare interesse nell'ATH è il "tumor necrosis factor (TNF) alfa" che è una citochina pleiotropica implicata nell'immunità T mediata (16) e contribiusce al processo infiammatorio inducendo altri mediatori come il PAI-1, (considerato un fattore di rischio nell'infarto miocardico; 17). Durante l'ATH nell'uomo è stata riscontrata un'elevata espressione di TNF-alfa (18) mentre l'HDL protegge le cellule endoteliali dall'apoptosi indotta da TNF-alfa (19).
La malattia vascolare periferica è spesso caratterizzata da ostruzioni nei vari distretti vascolari:ed è documentato che l'incidenza di ischemia miocardica e di ictus è molto elevata in pazienti che hanno una vasculopatia periferica (20). L'endoarterectomia (EA) femorale è una procedura sicura con una morbilità perioperatoria limitata; tuttavia la restenosi è un evento comune. L'interazione cellula-cellula e i meccanismi di segnale sono complessi nel network infiammatorio (21). Fra i linfociti che infiltrano la placca prevale la sottopopolazione Th1 delle cellule T CD4+ e queste cellule sono i principali produttori di IL-2 e interferon (IFN)-gamma. E' interessante osservare che ci sono diversità nell'espressione di citochine tra placche, ma quest'importante aspetto non è ben caratterizzato per il limitato numero di studi condotti direttamente sulla placca. Esistono meccanismi di controllo reciproco tra le vie che includono le risposte Th1 e Th2 tramite la produzione di citochine (priciplamente IFN-gamma e IL-10, rispettivamente) con azione inibitoria (22). L'equilibrio tra stimoli pro e antiinfiammatori può essere un punto critico per lo sviluppo e le complicanze dell'ATH. Tra le citochine coinvolte nella stabilizzazione della placca è riconosciuto il ruolo del TGF-beta (23).
IL SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA COME MODULATORE DELL'ATEROSCLEROSI E DELL'INFIAMMAZIONE
L'ATH è caratteizata da un complesso fenomeno in cui il sistema renina angiotensina (RAS) è riconosciuto essere un importante fattore modulante (24-26). In particolare, l'Ang II può causare una modificazione del metabolismo dei lipidi e dell'instabilità della placca. Inoltre favorisce l'uptake di colesterolo da parte dei macrofagi, la migrazione, la proliferazione e l'apoptosi delle VSMC e la deposizione di matrice (27). L'Ang II esercita i suoi effetti attraverso il legame e l'attivazione di diversi recettori (28) e contribuisce al processo aterosclerotico principalmente attraverso l'attivazione del recettore AT1, che porta con sé i tipici effetti dell'Ang II, inclusi vasocostrizione, crescita Bcellulare e sintesi della matrice (29-31). Inoltre, attraverso la via NF- dipendente, induce un aumento della produzione di TNF-alfa (32), aumenta il rilascio di molecole di adesione, di IL-8 e l'infiltrazione di neutrofili (33,34). L'Ang II cardiaca aumenta in pazienti con angina instabile e gioca un ruolo importante nell'infiammazione dei capillari coronarici contribuendo all'aumento dei linfociti T, dei macrofagi e delle EC e all'up regolazione dell'mRNA degli iNOs e di differenti citochine infiammatorie (35). RUOLO DELL'ATTIVITA' ANTIINFIAMMATORIA DELLE STATINE NEL PROCESSO ATEROSCLEROTICO
Le statine esercitano diversi effetti farmacologici che sono indipendenti dalla loro azione ipolipemizzante e che però possono essere importanti ai fini dei loro effetti terapeutici nell'ATH. Questi effetti possono essere ricondotti almeno in parte alla capacità di interferire con i meccanismi infiammatori che contribuiscono all'ATH (40) come la riduzione dell'espressione di molecole di adesione (41), l'inibizione dell'espressione di chemochine quali l'MCP-1 in leucociti attivati e in EC (42).
Le statine svolgono importanti azioni tramite la modulazione della produzione di IL-8 e TNF-alfa e agiscono migiorando la disfunzione endoteliale (43). Le statine direttamente aumentano l'attività della nitrossido sintetasi endoteliale (eNOS; 44) e il trattamento a lungo termine con statine aumenta l'espresisone di eNOS (45) che è diminiuta nei vasi aterosclerotici (46).
E' stato documentato che la simvastatina riduce i livelli sierici di Il-6, IL-8 e MCP-1 dopo 6 settimane di trattamento e riduce l'espressione di mRNA di citochine proinfiammatorie nelle cellule mononucleate ottenute da sangue in pazienti con ipercolesterolemia (47). Recentemente è stato pubblicato che soggetti sani nel più alto quartile di IL-8 (misurato in sangue periferico) hanno un aumentato rischio di coronaropatia rispetto a soggetti nel più basso quartile (48). In uno studio pilota è stato dimostrato che la produzione di IL-8 da parte di PMNs di pazienti ad alto rischio era ridotta dopo un trattamento di 30 giorni con simvastatina; inoltre è stato dimostarto che questa riduzione era già riscontrabile al terzo giorno di trattamento (49). <<<