RICERCA ITALIANA     

STUDI SUI FATTORI GENETICI ED IMMUNOLOGICI CHE REGOLANO IL DANNO TESSUTALE ED IL DECORSO CLINICO DELL'ARTRITE REUMATOIDE

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

L'Artrite Reumatoide è una malattia infiammatoria cronica capace di indurre erosioni ossee e lesioni articolari che portano alla invalidità permanente. La storia naturale della malattia si presenta in modo estremamente difforme nei diversi soggetti ed è molto sentita l'esigenza di individuare marcatori prognostici. Questa esigenza è accresciuta dalla recente diponibilità di famaci che possono drasticamente modificare il decorso della malattia ma che sono gravati da costi elevati e rischi di eventi avversi seri. Questo studio si propone: di valuare la prevalenza di alcuni markers genetici nella popolazione di malati italiani affetti da AR; di valutare se tali marcatori correlano con marcatori sierologici e possono essere usati quali indicatori di prognosi. In una popolazione già identificata di oltre 500 soggetti italiani affetti da AR ed arruolati allo studio presso le cliniche universitarie di Reumatologia di Roma, Siena e Padova verranno analizzati polimorfismi nei geni: HLA-DR –DQ; PTPN22; PAD2 e PAD4; OPN; CASP3 e CASP8. Verranno ricercati gli autoanticorpi anti proteine citrullinate e fattori reumatoidi di diverso isotipo. Verranno dosati prodotti di degradazione della cartilagine (COMP). Verranno infine studiati a livello proteico e di RNAm, gli enzimi PAD in correlazione con le Caspasi, e quindi con i fenomeni apoptotici correlati ai meccanismi di citrullinazione e di induzione di anticorpi anti-CCP. Ogni variazione genetica verrà analizzata separatamente e in combinazione con le altre variabili genetiche e fenotipiche con lo scopo di verificare le interazioni dei diversi fattori. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Guido VALESINI Università degli Studi di ROMA "La Sapienza"

Obiettivo del Programma di Ricerca

Questo progetto ha due obiettivi:
1) Lo scopo principale è l'identificazione di geni coinvolti nelle diverse manifestazioni cliniche (compresa la risposta alla terapia) e immunologiche dell'AR. A questo scopo i pazienti AR verranno tipizzati per diverse variazioni di sequenze nucleotidiche nei geni sottoelencati. La frequenza delle variazioni di sequenza saranno confrontate in pazienti AR suddivisi sulla base dei diversi fenotipi clinici e immunologici descritti nei progetti delle Unita' cliniche e caratterizzate dai centri clinici che partecipano a questo progetto.
2) Inoltre verrà analizzata l'associazione dei polimorfismi selezionati con la suscettibilità all'AR che finora non è mai stata analizzata nella popolazione Italiana. Sarà eseguito uno studio di associazione caso-controllo
Per entrambi gli obiettivi il coinvolgimento di ciascuna variazione genetica verrà analizzata separatamente e in combinazione con le altre variabili genetiche e fenotipiche con lo scopo di verificare le interazioni dei diversi fattori.

Per realizzare questo programma di ricerca verrà utilizzata la casistica clinica e la banca dati ad essa correlata, raccolta nel corso di uno studio osservazionale promosso in collaborazione con il Ministero della Salute (Studio ANTARES), Lo studio ANTARES è uno studio osservazionale di fase IV - promosso dal Ministero in collaborazione con la Società Italiana di Reumatologia, approvato con Decreto del ministero della sanità del 24 Maggio 2001 e pubblicato su GU n. 127 del 4-6-2001 - avente come obiettivo principale la valutazione dell'efficacia terapeutica e della tollerabilità dei farmaci anti-TNFa disponibili in commercio per la terapia dell'Artrite Reumatoide; esso ha coinvolto tutti i centri clinici universitari ed ospedalieri distribuiti sul territorio nazionale che hanno arruolato oltre 4000 pazienti.
I tre centri clinici impegnati nel presente programma di ricerca hanno selezionato e raccolto nel corso dello studio Antares, negli ultimi 4 anni, una consistente casistica clinica ( più di 500 pazienti affetti da artrite reumatoide) registrando con frequenza bimestrale le modificazioni dei parametri clinici, indicatori di attività di malattia, e raccogliendo e congelando campioni di siero.
I pazienti così già arruolati saranno sottoposti a prelievo per l'estrazione del DNA in occasione del primo controllo periodico (bimestrale) e su tale materiale verranno condotte le indagini genetiche presso l'unità dell'Università di Novara.
Prevalenza e correlazioni tra markers genetici e valutazioni clinimetriche (DAS28; ACR 20-50-70%; HAQ) verranno ulteriormente confrontate con gli autoanticorpi sierici (anti-CCP e fattori reumatoidi di diverso isotipo) e con un indicatore di danno cartilagineo (COMP) valutati sui campioni di siero raccolti ai diversi tempi del follow-up.
La possibilità di utilizzare per questo progetto di ricerca una casistica clinica già raccolta, la banca dati delle valutazioni cliniche già raccolte in forma numerica (clinimetria), ed i campioni di siero già raccolti con prelievi sequenziali e congelati, consente un consistente abbattimento dei costi e dei tempi di realizzazione di uno studio di grande rilievo.
Infatti l'obiettivo di individuare marcatori che possano essere usati quali indicatori prognostici e di outcome terapeutico appare particolarmente importante oggi che sono disponibili nuove terapie dell'artrite reumatoide altamente efficaci in una larga percentuale di malati ma gravate di possibili effetti collaterali e costi assai elevati. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

L'Artrite Reumatoide (AR) è una patologia cronica articolare a carattere infiammatorio, istologicamente caratterizzata da infiltrazione macrofagica e linfo-monocitaria, fenomeni d'intensa angiogenesi e proliferazione tissutale. Le prime fasi sono caratterizzate da un intenso fenomeno infiammatorio a carico della sinovia, successivamente, nelle fasi avanzate di malattia, la proliferazione del panno sinoviale e l'aberrante attivazione delle cellule del metabolismo osseo provocano la formazione di erosioni dell'osso subcondrale, determinando la distruzione dei capi ossei e l'anchilosi. A tuttoggi non è stato ancora identificato un unico fattore eziologico quale causa dell'AR, tuttavia lo sviluppo delle conoscenze in campo immunologico hanno permesso di interpretare una grande parte dei meccanismi patogenetici.

Quando un paziente affetto da AR aggressiva ed invalidante non risponde a farmaci convenzionali, anche in combinazione tra loro, presenta un alto rischio di vedere la malattia progredire come danno articolare , come invalidita', come comparsa di malattie, direttamente od indirettamente legate alla infiammazione cronica, quali le malattie cardiovascolari .

Sono oggi disponibile farmaci che possono contribuire al controllo dell' infiammazione cronica: sono i Biologici, tra i quali gli anti-TNF , sono certamente i piu' studiati .
Nell'ambito di un progetto Ministeriale chiamato ANTARES , diversi centri clinici di Reumatologia, tra cui i tre coinvolti in questo progetto di ricerca, hanno contribuito a predisporre una raccolta dati sui pazienti da inserire, sui risultati clinici e sugli eventuali effetti collaterali osservati nel corso del trattamento di soggetti affetti da AR con farmaci anti-TNF. .

Secondo il protocollo ANTARES i Farmaci Biologici sono stati prescritti a pazienti con Artrite Reumatoide attiva , non responsiva alla combinazione di due farmaci antinfiammatori a lunga durata d'azione ( cosiddetti DMARDs : disease modifying antirheumatic drugs) di cui uno deve essere il Methotrexate. Secondo il protocollo ANTARES i criteri da utilizzare per definire la AR non responsiva sono: pazienti con DAS > 3.7 ( Disease activity score , score di attivita' di malattia della European League Against Rheumatism) a tre mesi dall'inizio della suddetta terapia di combinazione. I pazienti sono stati sottoposti ad un controllo medico periodico bimestrale .
AR è una malattia multifattoriale con influenze genetiche ed ambientali. Diversi dati suggeriscono una componente genetica nella AR: il fatto che la sua prevalenza varia nelle differenti popolazioni e rimane invariata durante le migrazioni; il rischio di ricorrenza nei fratelli , che è 2-17 volte più alto della prevalenza nella popolazione(Silman 2002) ; la concordanza tra i gemelli mozigoti (16%), che è piu alta che nei dizigoti (3.6%)(Seldin 1999).
Il principale fattore genetico noto per AR è nella regione HLA. Secondo l'ipotesi "dell'epitopo condiviso" ( shared epitope, SE) l'associazione più forte è con alleli HLA-DRB1 che condividono nella terza regione ipervariabile (aa 70-74) una sequenza aminoacidica simile: QKRAA (in DRB1*0401), QRRAA (in DRB1*0404 , *0405, *0101, *0102) o RRRAA (in DRB1*1001) (MacGregor 2000).
Nei pazienti AR italiani SE conferisce un OR= 2.17 (1.57-3.0) come riportato da un recente studio condotto su 264 pazienti (Bongi 2004). Altri studi suggeriscono che il coinvolgimento dei geni HLA nella suscettibilità a AR è spiegata meglio considerando sia gli alleli DR che DQ (Vos 2001). Secondo questo modello la suscettibilità a AR è conferita dagli alleli DQ (DQB1*03-DQA1*03 e DQB1*0501-DQA1*01) mentre la protezione è determinata da alleli DRB1 che portano la sequenza DERAA. Dati recenti favoriscono questo al modello dello SE (Huizinga 2002).
I geni HLA spiegano meno del 50% del contributo genetico complessivo alla AR. Questo induce ad ipotizzare il coinvolgimento di altri geni come suggerito anche dai diversi studi di linkage in tutto il genoma che hanno identificato diverse regioni genomiche dove probabilmente mappano geni di suscettibilità a AR. Sono stati riportati molti studi volti a identificare questi geni, condotti con i metodi classici dell'associazione tra la malattia e geni candidati. I geni candidati sono selezionati perché mappano in regioni cromosomiche interessanti (secondo quanto emerso dagli studi di linkage) e/o a causa del loro presunto ruolo nella malattia.
Tuttavia per la maggior parte dei potenziali geni candidati il coinvolgimento nella suscettibilità a AR non è stata dimostrata o non è stata replicata in studi indipendenti. Un'eccezione è il gene PTPN22 che codifica per una tirosin fosfatasi specifica delle cellulle ematopoietiche che interagisce attraverso il dominio ricco di proline P1 con la cinasi Csk. Questa interazione fisica controlla lo stato di fosforilazione di tirosine regolatorie di molecole che fanno parte della cascata di trasduzione del segnale nel complesso del TCR come Lck e ZAP70 e determina un'inibizione dell'attivazione dei linfociti T.
L'AR è una patologia in cui il danno tissutale si esplica prevalentemente a carico della membrana sinoviale, dell'osso subcondrale e della cartilagine articolare; è stato dimostrato un grande parallelismo fra le manifestazioni cliniche (rigidità, tumefazioni articolari, artralgie ) ed il danno d'organo (sinoviti ed erosioni cartilaginee ed ossee). Nella pratica clinica raramente si realizza la necessità di una valutazione istologica del danno, dal momento che alcune valutazioni diagnostiche strumentali, quali la radiologia e l'ecografia articolare, sono sufficientemente accurate da consentire anche stime comparative efficaci. Cionono¬stante l'aspirazione ad individuare marcatori sierologici ha spinto la ricerca ad identificare prodotti di degradazione tissutale ipoteticamente correlabili con l'attività di malattia e l'estensione del danno d'organo.

E' stato documentato (Recklies et al. 1998, Neidhart et al. 1997, Mansson et al 1995, Mannson et al, 1997; Arti et al, 1999 ) che quando la matrice della cartilagine articolare viene degradata a causa di un processo patologico, frammenti proteici vengono prodotti e diffusi nel liquido articolare. Alcune di queste proteine, quali la COMP, appaiono successivamente anche nel circolo ematico e possono essere utilizzate per monitorare l'avanzamento della degradazione cartilaginea nelle patologie infiammatorie e/o degenerative articolari, quali l'artrite reumatoide (RA)( Mansson et al 1995, Forslind et al. 1992) e l'osteoartrite (Petersson et al, 1998, Clark et al, 1999).I marcatori di degradazione cartilaginea come la COMP sarebbero in grado di fornire informazioni precoci sulla eventuale ripresa di malattia o di predire una prognosi più o meno grave.
Il principale problema nell'utilizzo della COMP nel monitoraggio dell'AR è sicuramente la mancanza di dati su ampie casistiche, che indichino i tempi e l'entità di variazione di tali livelli nell'incipienza di un danno cartilagineo. Qualora si riuscisse ad individuare l'attendibilità e la criticità di tali variazioni in relazione all'entità del danno, si potrebbe ottimizzare non soltanto l'interpretazione clinica, ma anche la strategia terapeutica in corso di AR.
D'altra parte nel siero dei pazienti affetti da AR è possible rinvenire numerosi anticorpi diretti contro antigeni self. Alcuni di questi autoanticorpi si rinvengono anche nel siero di pazienti affetti da altre malattie reumatiche autoimmuni quali il lupus eritematoso sistemico (LES), o la connettivite mista (MCTD), e non sono quindi specifici per l'AR. Gli anticorpi associati all'AR comprendono il FR, anti-RA33, anti-collagene di tipo II, anti-calpastatina e l'anti-fibronectina.
Nel siero dei pazienti con AR è possibile rinvenire anche anticorpi specifici per la diagnosi di AR: anti-BiP, anti-Sa ed anti-proteine citrullinate (ACPA). Gli anticorpi diretti contro le proteine citrullinate comprendono: anticorpi anti-fattore perinucleare (APF), anticorpi anti-cheratina(AKA), anti-fillagrina ed anti-CCP.


Negli anni recenti un crescente interesse è stato dedicato agli anticorpi rivolti contro proteine citrullinate ed un peptide sintetico ciclico citrullinato ( cyclic citrullinated peptide, CCP) è ormai correntemente usato quale target antigenico in un test diagnostico (anti-CCP2) che si è dimostrato altamente sensibile e specifico per l'artrite reumatoide (AR)( Schellekens et al, 1998; Schellekens et al, 2000).
L'interesse per gli anticorpi anti-CCP è accresciuto ulteriormente dal fatto che questi autoanticorpi compaiono precocemente nel siero dei soggetti destinati a sviluppare la malattia (Nielen et al, 2004) e correlano con la forma erosiva e la prognosi peggiore (Kroot et al, 2000; Vencovsky et al, 2003).
Vi sono evidenze sperimentali che dimostrano come si abbia a livello sinoviale una produzione locale di anti-CCP, infatti la concentrazione relativa di questi autoanticorpi è nel liquido sinoviale 1,4 volte maggiore che nel siero (Vossenaar et al, 2004). Si può pertanto ipotizzare una diffusione dal liquido sinoviale al circolo generale e la presenza in situ di plasmacellule secernenti anti-CCP depone per una sintesi anticorpale antigen-driven (Masson-Bessière et al ., 2001; Reparon-Schuijt et al. 2001). Ci si deve dunque interrogare circa la possibile presenza di molecole immunogeniche ricche in citrullina a livello della mebrana sinoviale.
La citrullinazione è un evento posttraslazionale che comporta la conversione di residui di arginina in citrullina ad opera di enzimi specifici denominati PAD (peptidylarginine deiminase ).
Abbiamo di recente dimostrato come il trattamento con farmaci biologici anti-TNF sia in grado di diminuire il titolo degli anti-CCP e come questa diminuzione sia correlata con i migliori risultati clinici (Alessandri et al., 2004); poiché il trattamento anti-TNF è in grado di influenzare i processi apoptotici (Lugering et al., 2001) questo potrebbe spiegare anche un'influenza su processi di citrullinazione e sulla sintesi locale di anti-CCP.

L'apoptosi è un processo fisiologico strettamente regolato dall'azione delle Caspasi, proteasi in grado di tagliare le proteine tra i residui di cisteina ed aspartato a valle di specifiche sequenze di consenso. Tutte le Caspasi sono costitutivamente espresse nel
citoplasma in forma inattiva di pro-enzimi e sono attivati da numerosi stimoli fra i quali il legame ligando-recettore FasL-Fas. Successivamente al legame di tre molecole di ligando, il recettore viene attivato per oligomerizzazione. La fase di trasmissione del segnale di morte all'interno della cellula avviene attraverso il reclutamento di proteine citosoliche specifiche che attivano a loro volta la Caspasi 8. Altre Caspasi (Caspasi effettrici 3, 6 e 9) sono di seguito attivate per proteolisi a cascata dalla prima, portando alla degradazione dei loro substrati specifici citosolici e nucleari.
Fenomeni di morte cellulare per apoptosi sono osservabili anche nell'AR, sia a livello periferico che nella membrana sinoviale. E' quindi giustificato ipotizzare che le Caspasi, gli enzimi esecutori di tale processo, e/o il polimorfismo dei geni che codificano per esse, possano essere implicati nella patogenesi dell'AR anche attraverso un'influenza sul processo di citrullinazione proteica.

Come detto sopra la citrullinazione è un processo prosttraslazionale che si realizza in diverse circostanze e che non può essere considerato esclusivo della flogosi sinoviale associata all'AR; si può pertanto ipotizzare che molecole ricche in citrullina siano presenti anche in altri tessuti normali e patologici. Vista l'elevata specificità degli anti-CCP per l'AR e quindi la loro presenza solo nel siero di soggetti affetti da questa poliartrite cronica, si deve considerare che in questa condizione morbosa si realizzino due circostanze che rendono particolarmente immunogenici i peptidi citrullinati. Tali cicostanze potrebbero essere o una aumentata espressione degli antigeni citrullinati nella sinovia reumatoide o una magiore capacità dei soggetti malati di evocare una risposta immune contro queste proteine. A sostegno della prima ipotesi è il dimostrato polimorfismo dei geni che codificano per PAD presenti in cluster sul cromosoma 1p36, la stessa regione dove si colloca il locus di suscettibilità per AR (Suzuki et al., 2003; Shiozawa et al., 1998). A questo ben si correla l'osservazione di un'aumentata prevalenza degli anti-CCP nei soggetti omozigoti per l'aplotipo di suscettibilità rispetto agli eterozigoti o agli omozigoti per non-suscettibilità (Suzuki et al.,2003). <<<