RICERCA ITALIANA     

STRATEGIE INNOVATIVE PER LO STUDIO PRE-CLINICO DELLA EFFICACIA DI FARMACI E ANTICORPI NEUTRALIZZANTI UMANI CONTRO IL VIRUS DELL'EPATITE C (HCV).

Università degli Studi di Roma "La Sapienza"

Abstract

Il virus dell'epatite C (HCV) è una delle principali cause dell'epatite cronica ad eziologia virale. Circa l'80% dei soggetti infetti da HCV manifesta una cronicizzazione dell'infezione con lo sviluppo nel 15-20% di cirrosi e/o epatocarcinoma, dopo 20-30 anni dall'infezione. Circa un terzo dei pazienti affetti da HIV sono infettati anche da HCV ed esistono evidenze a favore del fatto che la malattia progredisca più rapidamente nei pazienti coinfetti. L'introduzione della terapia combinata interferon più ribavirina e l'impiego dell' interferon peghilato (Peg-IFN) ha incrementato il successo terapeutico da meno del 10% a più del 50% dei casi ma non ha risolto in maniera definitiva il problema del trattamento dell'epatite cronica da HCV.
E' nostra opinione che alcuni aspetti virologici (es. mancanza di un modello di infezione produttiva), patogenetici (es. non è noto il ruolo svolto dalla risposta umorale nella storia naturale dell'infezione) e terapeutici (esiste ancora una elevata percentuale di soggetti che non risponde alla terapia o che subisce una riattivazione della malattia quando la stessa viene sospesa) debbano essere affrontati con maggiore incisività.
Quindi sulla base delle diverse e complementari esperienze dei gruppi partecipanti al progetto e nell'intendimento di ottenere dati che siano trasferibili alla ricerca clinica, abbiamo pensato di proporre un programma di ricerca focalizzato all'acquisizione di nuove informazioni relative allo sviluppo di modelli sperimentali pre-clinici che consentano di:
a- studiare l'interazione tra virus dell'epatite C (HCV) e cellule di origine epatica, renale ed intestinale con particolare riferimento alla messa a punto di un modello sperimentale di infezione produttiva.
b- sviluppare e caratterizzare funzionalmente la risposta anticorpale neutralizzante anti-HCV avvalendosi anche di modelli sperimentali sviluppati nel corso del progetto.
c- identificare nuove molecole o strategie ad attività antivirale ed ottimizzare le terapie correntemente in uso avvalendosi anche di modelli sperimentali sviluppati nel corso del progetto. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Guido ANTONELLI Università degli Studi di ROMA "La Sapienza"

Obiettivo del Programma di Ricerca

L'infezione da virus dell'epatite C (HCV) costituisce un problema sanitario di primaria importanza dal momento che circa l'80% dei soggetti infetti da HCV manifesta una cronicizzazione dell'infezione con lo sviluppo dopo 20-30 anni dall'infezione di cirrosi e/o epatocarcinoma nel 15-20% dei casi. In effetti l'HCV è una delle principali cause di epatopatia cronica ad eziologia virale nei paesi occidentali in cui rappresenta la causa principale di trapianto di fegato (50% dei casi). Nonostante l'introduzione della terapia combinata interferon più ribavirina e l'impiego dell' interferon peghilato (Peg-IFN) abbia incrementato il successo terapeutico da meno del 10% a più del 50% dei casi esiste ancora una elevata percentuale di soggetti che non risponde alla terapia o che subisce una "riattivazione" della malattia quando la stessa viene sospesa. Inoltre circa un terzo dei pazienti affetti da HIV sono infettati anche da HCV ed esistono evidenze a favore del fatto che la malattia progredisca più rapidamente nei pazienti coinfetti. E' stato dimostrato inoltre che HCV si può ritrovare in numerosi tessuti non epatici e che l'infezione cronica da HCV è caratterizzata da elevata incidenza di sindromi extraepatiche. Quanto la diffusione del virus nei distretti extra-epatici influenzi la storia naturale o il decorso dell'infezione non è ancora noto. La risposta immune HCV-specifica sembra incapace di determinare una completa clearance del virus in una considerevole proporzione di soggetti infettati mentre sembra coinvolta nella patogenesi dell'infezione. A questo riguardo e' utile sottolineare che mentre è noto che la risposta cellulo-mediata sembra svolgere un ruolo rilevante nell'induzione del danno epatico HCV-correlato, meno chiaro risulta il ruolo esercitato dalla risposta anticorpale. Tale ruolo non è stato ancora studiato in maniera approfondita né da un punto di vista funzionale né da un punto di vista molecolare.
Dalle considerazioni sopraesposte si evince che l'acquisizione di nuove conoscenze sull'infezione da HCV, dato anche il suo forte impatto epidemiologico, rappresenta una delle priorità della ricerca biomedica. Abbiamo ritenuto opportuno pertanto proporre un progetto di ricerca finalizzato al chiarimento di alcuni aspetti virologici, patogenetici e terapeutici dell'infezione da HCV che più di altri, a nostro avviso, necessitano di un intervento efficace. Sulla base delle diverse e complementari esperienze dei partecipanti al progetto e tenendo in considerazione gli sviluppi applicativi delle acquisizioni che si potranno ottenere, intendiamo eseguire un programma di ricerca focalizzato all'acquisizione di nuove informazioni relative allo sviluppo di modelli sperimentali pre-clinici che consentano di:
A- STUDIARE L'INTERAZIONE TRA VIRUS DELL'EPATITE C (HCV) E CELLULE DI ORIGINE EPATICA, RENALE ED INTESTINALE con particolare riferimento alla messa a punto di un modello sperimentale di infezione produttiva.
B- SVILUPPARE E CARATTERIZZARE FUNZIONALMENTE LA RISPOSTA ANTICORPALE NEUTRALIZZANTE ANTI-HCV
C- IDENTIFICARE NUOVE MOLECOLE O STRATEGIE AD ATTIVITÀ ANTIVIRALE
D- OTTIMIZZARE LE TERAPIE CORRENTEMENTE IN USO

Per quanto riguarda il punto A in particolare ci si propone di:
1) sviluppare linee di epatociti umani a differente stato di differenziazione;
2) valutare la suscettibilità e permissività ad HCV delle diverse linee epatocitarie e caratterizzare gli aspetti virologici dell'infezione;
3) valutare gli effetti della replicazione virale sulle funzioni delle cellule epatiche;
4) mettere a punto un test di neutralizzazione di HCV in epatociti;
5) valutare la suscettibilità e la permissività a HCV delle cellule renali glomerulari e tubulari;
6) valutare la suscettibilità e la permissività a HCV delle cellule epiteliali intestinali.
Per quanto riguarda il punto B ci si propone di:
1) valutare la risposta immune umorale dell'ospite nei confronti di HCV e di caratterizzare l'attività biologica di anticorpi monoclonali umani che in un sistema di pseudovirus si sono mostrati neutralizzanti
2) analizzare la risposta del virus alla pressione selettiva esercitata da detti anticorpi in termini di evoluzione genetica in un sistema replicativo controllato (sia cellulare, che in un modello di topo privo d'immunità).
Per quanto riguarda il punto C ci si propone di valutare se molecole di interferone diverse dall'interferone alfa 2 che viene correntemente impiegato, possano esplicare un'attività antivirale nei confronti di virus diversi noti per la loro sensibilità all'IFN, virus simili all'HCV (es. BVDV) o verso l'HCV stesso. Il nostro intento è inoltre quello di verificare se esista un'interazione sinergica tra i diversi tipi di IFN o tra gli interferon e altri composti antivirali.
Per quanto riguarda il punto D ci si propone di:
1) studiare le interazioni farmacologiche tra farmaci attualmente utilizzati per la terapia dell'infezione cronica da HCV e farmaci antiretrovirali utilizzati nella terapia dell'infezione da HIV;
2) studiare i meccanismi biologici alla base di sinergismo tra interferon e ribavirina;
3) studiare la "farmacodinamica" in vitro dell'IFN alfa e degli altri interferoni eventualmente individuati nell'obiettivo precedente.
Riteniamo sia utile ribadire che e' prevista una stretta collaborazione tra le vari componenti del progetto, che la esecuzione del progetto prevede che tutti i partecipanti si avvalgano dei modelli sperimentali sviluppati nel corso del progetto ed infine che tutto il progetto è focalizzato all'ottenimento di risultati che siano trasferibili alla ricerca clinica. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

L'infezione da virus dell'epatite C (HCV) costituisce un problema sanitario di primaria importanza dal momento che si stima che circa il 3% della popolazione mondiale (170-200 milioni di persone) sia infettata da HCV (1). L'elevato impatto sociale di questa infezione è dovuto all'alto numero di casi di epatite C che presentano una evoluzione cronica dell'infezione (50-80%) ed al fatto che il 15-20% dei pazienti con infezione persistente sviluppa una patologia epatica progressiva con possibile esito in cirrosi ed epatocarcinoma (2). In effetti il virus dell'epatite C (HCV) è una delle principali cause di epatopatia cronica ad eziologia virale nei paesi occidentali (3) ed attualmente l'epatite C rappresenta in questi paesi la causa principale di trapianto di fegato (50% dei casi; 4).
Nell'ultimo decennio sono stati ottenuti degli enormi progressi nella identificazione e caratterizzazione del virus, nella storia naturale, epidemiologia, diagnosi e terapia dell'infezione. Dai dati in letteratura risulta tuttavia evidente che diversi aspetti riguardanti soprattutto la virologia, la patogenesi e la terapia dell'infezione da HCV non sono ancora stati trattati in maniera esaustiva. A ciò va aggiunto il dato epidemiologico ormai consolidato relativo all'alta incidenza nella popolazione mondiale della coinfezione HCV/HIV. In quest'ultimo caso, nonostante l'ottenimento recente di importanti avanzamenti, le informazioni relative ai suddetti aspetti risultano ancora preliminari e lacunose.
Dato l'elevato impatto epidemiologico dell'infezione e della coinfezione HCV/HIV è opinione comune che una delle priorità attuali della ricerca biomedica sia quello di cercare di acquisire nuove informazioni relative ai succitati temi. Di seguito verranno esaminati i diversi aspetti dell'infezione da HCV che a nostro avviso richiedono un intervento urgente e che il progetto intende affrontare nell'intendimento che i risultati ottenuti siano trasferibili alla ricerca clinica.
ASPETTI VIROLOGICI
A causa della mancanza di un modello di infezione produttiva del virus in coltura (5), molti aspetti del ciclo vitale di HCV nella cellula ospite sono ancora del tutto ignoti. In effetti i modelli attualmente disponibili sono relativi all'utilizzo di "repliconi" genomici e/o subgenomici che non permettono in nessun caso di arrivare alla produzione di virioni (6-8). Non è stato quindi possibile studiare: le prime fasi del ciclo replicativo del virus incluso il legame con il recettore cellulare; la modalità di assemblaggio e di rilascio dei virioni infettanti; gli effetti citopatologici attivati dalla replicazione virale.
E' anche interessante notare che il sistema di repliconi subgenomici, impiegato per consentire la replicazione del virus in colture cellulari (9), si basa sulla delezione dei geni strutturali e la conseguente inibizione della sintesi delle glicoproteine virali e della proteina del core. Proprio quest'ultima proteina virale sembra giocare un ruolo chiave nella patogenesi dell'infezione in quanto è risultata capace di modulare la trascrizione dei geni cellulari, la proliferazione e/o l'apoptosi della cellula infettata, il metabolismo lipidico e la risposta immune dell'ospite (10). Studi di espressione genica effettuati su tessuto epatico di scimpanzè infettati con HCV hanno dimostrato che il virus attiva rapidamente la risposta di interferon (IFN) di tipo I (alfa/beta), ma che questa risposta non è capace di bloccare la replicazione virale negli epatociti (11). Ciò malgrado che il sistema dei repliconi subgenomici dimostri una intrinseca sensibilità di HCV a IFN-alfa (12). La clearance del virus risulta associata, invece, all'attivazione di geni indotti da IFN-gamma e di geni coinvolti nella presentazione dell'antigene (11). L'induzione e la sensibilità all'immunità innata sembra, comunque, giocare un ruolo determinante nella storia naturale dell'infezione di HCV (13) ed è stato dimostrato che essa può essere modulata dalla glicoproteina E2 (14). Tutti questi dati indicano l'importanza di analizzare l'interazione tra HCV ed epatocita in un sistema che permetta di valutare gli effetti diretti dell'infezione virale produttiva sulla regolazione del ciclo cellulare, sull'induzione di IFN (di tipo I e II), nonché sull'espressione di citochine, chemochine, recettori chemochinici e Toll-like da parte degli epatociti infettati, fattori che possono condizionare lo sviluppo della risposta innata e la sua cooperazione con la risposta adattativa (15,16). I risultati ottenuti in questo sistema avrebbero anche implicazioni sulla delucidazione dei meccanismi di patogenesi e di persistenza dell'infezione di HCV in vivo (17). Lo studio delle interazioni dirette tra HCV ed epatociti permetterebbe, inoltre, di caratterizzare gli effetti dell'infezione virale sulle attività metaboliche proprie di tali cellule (e.d. la funzione di detossificazione) e la possibile influenza sulla replicazione virale di stress funzionali epatocitari (e.d. assunzione di alcool). Anche il modello recentemente allestito di produzione in vitro di HCV non permette l'analisi dell'intero ciclo replicativo virale ed utilizza cellule di epatoma con caratteristiche non comparabili a quelle delle cellule epatiche in vivo (18). Si deve pertanto concludere che, per poter ottenere avanzamenti significativi nella comprensione del ciclo vitale di HCV e dei meccanismi patogenetici virus-indotti, è necessario mettere a punto nuovi modelli di infezione di HCV in coltura e in animale da esperimento, modelli allo stesso tempo più semplici e più informativi. Uno dei laboratori facenti parte del progetto ha svolto numerose ricerche sul tropismo e gli effetti citopatologici di agenti virali in diversi tipi cellulari attraverso la messa a punto di un sistema di immortalizzazione di colture primarie capace di mantenere elevati livelli di differenziazione cellulare e, di conseguenza, di riprodurre nelle popolazioni cellulari in vitro caratteri strutturali e funzionali simili a quelli riscontrati a livello tessutale (19,20). Per quanto concerne l'interazione tra HCV ed epatociti, è da rilevare che il fegato costituisce uno degli organi più complessi sul piano sia strutturale che funzionale e che le linee di epatociti finora utilizzate presentano modeste analogie con le cellule epatiche in vivo, bersaglio naturale di HCV (21). Le recenti acquisizioni nel campo delle cellule staminali/progenitrici e dell'ingegneria tessutale permettono di ipotizzare lo sviluppo di colture cellulari più rappresentative del "tessuto epatico" e, di conseguenza, di condizioni più idonee alla realizzazione di sistemi di replicazione di HCV in vitro (22-26). E' da ricordare che la rigenerazione epatica è dovuta alla proliferazione degli epatociti maturi (27) e che le cellule staminali presenti nel fegato adulto sono "committed" a differenziarsi solo in epatociti (22). Studi di uno dei gruppi facenti parte del gruppo di ricerca hanno permesso di identificare una linea nuova di progenitori epatici e di caratterizzarne le condizioni di induzione differenziativa e di organizzazione in un ambiente tridimensionale in microgravità (28-30). Prove preliminari hanno dimostrato che queste cellule epatiche sono suscettibili di infezione produttiva da HCV. L'uso di un sistema standardizzato e riproducibile di analisi dell'interazione tra HCV e cellule epatiche organizzate e funzionali dovrebbe permettere l'effettuazione di studi rilevanti anche quindi per quanto riguarda la patogenesi dell'infezione virale.
ASPETTI PATOGENETICI
Da un punto di vista più strettamente patogenetico e' ormai consolidato il concetto che la risposta immune HCV-specifica sembra incapace di determinare una completa clearance del virus in una considerevole proporzione di soggetti infettati. A questo riguardo diversi studi suggeriscono che la risposta cellulo-mediata, svolga un ruolo rilevante nell'induzione del danno epatico HCV-correlato. Meno chiaro risulta il ruolo esercitato dalla risposta anticorpale. La persistenza del virus in presenza di una risposta anticorpale HCV-specifica sembra suggerire che tali anticorpi non siano in grado di proteggere efficacemente dall'infezione e di determinare una clearance efficace del virus; tuttavia, lo sviluppo di anticorpi specifici potrebbe essere coinvolto in reazioni ADCC (antibody-depentent cellular cytotoxicity) nei confronti di cellule epatiche (e non) infette. Inoltre, la formazione di immunocomplessi virus-anticorpi, verosimilmente molto frequente nel corso di infezione cronica anche se mai accertato fino ad ora nel caso dell'HCV, potrebbe non solo favorire l'infezione in cellule e distretti dell'ospite normalmente non suscettibili (tramite Fc), ma anche facilitare l'insorgenza di patologie immunitarie correlate all'infezione (es. crioglobulinemia).
Nell'ambito della risposta contro HCV il ruolo degli anticorpi non è stato ancora studiato in maniera approfondita anche dal punto di vista molecolare. Esistono dati che dimostrano l'esistenza di cloni anticorpali in grado di inibire HCV. Studi recenti effettuati anche nel laboratorio di uno dei proponenti hanno valutato la capacità di anticorpi monoclonali (MAb) umani di inibire l'ingresso nella cellula di pseudovirus costruiti con le proteine dell'envelope di HCV e hanno chiaramente dimostrato come cloni anticorpali diretti contro la glicoproteina di superficie E2 di HCV (HCV/E2) dotati di una spiccata attività neutralizzante coesistano, nel repertorio immune di un paziente infettato da HCV, con cloni del tutto inattivi e anche con cloni che sembrano essere in grado di promuovere l'infezione virale (31). Se il contesto descritto in tale studio configura una situazione che si realizza in vivo, il solo titolo anticorpale anti HCV/E2 non rappresenta un parametro efficace per la valutazione del paziente persistentemente infettato, in quanto non distingue la quota di anticorpi utili al paziente, da quella costituita da anticorpi inutili o addirittura dannosi. La regione E2 di HCV include sequenze che codificano per domini virali ritenuti cruciali per avviare le prime fasi dell'infezione. Inoltre, in tale regione virale è presente la sequenza ipervariabile denominata HVR1 che si ritiene abbia un'importanza centrale perché il virus possa sfuggire alla risposta immune dell'ospite. Da qui la necessità di mettere a punto una tecnica in grado di valutare nel dettaglio le caratteristiche della risposta umorale anti-HCV/E2. A tal fine, riveste una grande potenzialità un sistema capace di valutare la presenza delle diverse popolazioni anticorpali anti-HCV/E2 rilevabili nel siero di pazienti HCV positivi, dotate ognuna di una spiccata e peculiare attività biologica. E' opinione comune che gli epitopi riconosciuti dagli anticorpi umani anti-HCV e dotati di attività neutralizzante non siano riproducibili da peptidi sintetici, sebbene siano attualmente in uso (32). Una possibile alternativa per caratterizzare la risposta anti-E2 è costituita dall'utilizzo di anticorpi monoclonali umani anti-E2 marcati in un sistema di dosaggio delle sottopopolazioni anticorpali mediante una procedura competitiva. Infatti, una simile strategia consente di valutare sieri di pazienti HCV positivi osservando la loro capacità di spiazzare il legame sulla glicoproteina E2 di HCV di MAb marcati diretti contro i diversi epitopi. Un sistema di questo tipo è stato recentemente sviluppato da uno dei laboratori facenti parte del progetto ed applicato alla valutazione di soggetti infettati in diverse condizioni cliniche.
Lo studio molecolare della risposta anticorpale contro HCV d'altra parte potrebbe indirettamente aiutare a comprendere i complessi meccanismi di evasione immunitaria del virus che portano alla cronicizzazione dell'infezione.
In conclusione è evidente che la disponibilità di un modello quale quello proposto da una delle unità del progetto potrebbe rappresentare la chiave di volta per l'ottenimento di risultati pre-clinici direttamente trasferibili alla pratica clinica sui diversi aspetti sopraesposti.
ASPETTI TERAPEUTICI
Dal punto di vista terapeutico è noto che, nonostante l'introduzione della terapia combinata IFN più ribavirina e l'impiego dell' IFN peghilato (Peg-IFN) abbia incrementato il successo terapeutico da meno del 10% a più del 50% dei casi, esiste ancora una elevata percentuale di soggetti che non risponde alla terapia o che subisce una "riattivazione" della malattia quando la stessa viene sospesa (33,34). Il trattamento standard con IFN alfa o Peg-IFN e ribavirina è frequentemente associato allo sviluppo di effetti collaterali che condizionano negativamente la qualità della vita dei pazienti (35,36). Va poi considerato che un terzo dei pazienti affetti da HIV sono infettati anche da HCV. L'introduzione di nuovi farmaci e/o l'ottimizzazione delle strategie terapeutiche già a disposizione potrebbe pertanto soddisfare le attuali speranze e aspettative di clinici e pazienti sia per quanto riguarda l'infezione da HCV sia per quanto riguarda la confezione HCV/HIV.
L'identificazione di composti ad attività antivirale in grado di agire sul ciclo di replicazione dell'HCV e' stata fortemente rallentata dalla sostanziale assenza di un modello sperimentale di replicazione in condizioni controllate. I modelli proposti, gia' menzionati, hanno forti limitazioni, ne' d'altra parte è possibile in tali sistemi sperimentali molto "rigidi" dal punto di vista procedurale andare a valutare in maniera accurata l'attività di farmaci antivirali e le loro reciproche interazioni quando i composti vengano usati in combinazione. Occorre sottolineare inoltre che la terapia dell'infezione da HCV e' poco caratterizzata relativamente alla farmacocinetica e alla farmacodinamica soprattutto quando vengano considerati i trattamenti combinati (antivirali + antiretrovirali). A tal riguardo è noto che il trattamento prolungato con alcuni farmaci anti-HIV può indurre l'espressione di fattori cellulari che influenzano l'attività di altri farmaci (37,38). Inoltre è praticamente sconosciuta la relativa attività antivirale di differenti sottotipi di IFN alfa contro l'HCV o virus affini. Dati in letteratura suggeriscono che alcuni sottotipi di IFN alfa hanno un effetto inibente superiore nei confronti di alcuni virus (40) e che l'IFN beta e gamma sinergizzano in maniera significativa nei confronti del virus della SARS (39).
Sfruttando le analogie molecolari e virologiche dell'HCV con altri membri della stessa famiglia di virus è possibile ipotizzare l'utilizzo di sistemi surrogati utili allo studio della replicazione del virus dell'epatite C (ad esempio il BVDV). Tali sistemi "surrogati" avrebbero il vantaggio di consentire lo studio di farmaci anti flavivirus e lo studio delle interazioni tra farmaci correntemente impiegati nel trattamento dell'infezione da HCV e della coinfezione HCV/HIV. La disponibilità di un modello quale quello proposto da una delle unità del progetto potrebbe pertanto rappresentare un elemento di fondamentale importanza per uno studio approfondito dell'attività antivirale dei vari farmaci (consolidati o in fase avanzata di sperimentazione) o nuovi IFNs (da soli o in combinazione) contro l'infezione da HCV

Sulla base di quanto sopra discusso, sulla base delle diverse e complementari esperienze dei gruppi partecipanti al progetto e tenendo in considerazione gli sviluppi applicativi delle acquisizioni che si potranno ottenere, abbiamo pensato di eseguire un programma di ricerca i cui principali obiettivi possono essere così riassunti:
A- STUDIARE L'INTERAZIONE TRA VIRUS DELL'EPATITE C (HCV) E CELLULE DI ORIGINE EPATICA, RENALE ED INTESTINALE con particolare riferimento alla messa a punto di un modello sperimentale di infezione produttiva.
B- SVILUPPARE E CARATTERIZZARE FUNZIONALMENTE LA RISPOSTA ANTICORPALE NEUTRALIZZANTE ANTI-HCV;
C- IDENTIFICARE NUOVE MOLECOLE O STRATEGIE AD ATTIVITÀ ANTIVIRALE ED OTTIMIZZARE LE TERAPIE CORRENTEMENTE IN USO. <<<