RICERCA ITALIANA     

Ruolo di citochine ed ormoni di origine gastrointestinale ed adipocitaria nella patogenesi dell'obesità e delle sue complicanze

Università degli Studi di Firenze

Abstract

Nella patogenesi dell'obesità si riconoscono più fasi, di cui la prima è caratterizzata dall'induzione dell'aumento del peso dovuta ad uno sbilanciamento fra l'aumentato introito calorico ed il ridotto dispendio energetico. In questa fase alcuni ormoni gastrointestinali, tra cui ghrelin e GLP-1, possono giocare un ruolo determinante nel provocare un aumento dell'appetito o un'alterazione della sazietà. Una volta che si è instaurato un aumento di volume e di numero delle cellule adipose, soprattutto quelle presenti nel tessuto adiposo viscerale, si assiste ad un aumento della secrezione di adipochine che contribuiscono a mantenere dei circoli viziosi: da una parte ostacolano la perdita di peso e dall'altra contribuiscono a generare le complicanze dell'obesità. Le principali complicanze hanno una valenza di tipo metabolico: diabete mellito, iperlipoproteinemia, ipertensione arteriosa che assieme all'obesità stessa rappresentano i più importanti fattori di rischio modificabili della malattia cardiovascolare e vascolo-cerebrale.
Nel presente programma di ricerca si assiste ad un'importante rete di collaborazione tra centri di rilevanza nazionale ed internazionale, che da anni studiano questi aspetti della patogenesi dell'obesità e delle sue complicanze. Entrando nei dettagli del programma, il progetto prevede di studiare il ruolo dei gastro-entero ormoni, ed in particolare ghrelin e GLP1 (ed il suo inattivatore DPPIV) nella regolazione periferica e centrale dell'assunzione di cibo e del metabolismo glicolipidico. I parametri ottenuti in vivo saranno confrontati in studi in vitro utilizzando cellule endoteliali aortiche umane per quello che riguarda gli effetti periferici legati al rischio cardiovascolare, e le cellule neuronali del sistema olfattivo umano fetale per quanto concerne gli effetti centrali di regolazione fame –sazietà.
Per quello che riguarda gli studi a livello della secrezione adipochinica, le altre tre unità di ricerca concentreranno la loro attenzione sulla secrezione adipochinica e la loro espressione genica a livello degli adipociti, all'equilibrio ed in condizioni di stimolo, di base e dopo la perdita di peso. Verrà data importanza al ruolo delle molecole correlate con l'infiammazione nella regolazione della secrezione di alcune adipochine, così come dei recettori purinergici P2.
Pertanto si studieranno i livelli circolanti di adiponectina , TNF-alfa, nonché l'espressione di mRNA nel tessuto adiposo di adiponectina, TNF-alfa, NFkB e PPARgamma e tali valori saranno correlati con un ampio pannello di parametri bioumorali ed antropometrici. I dati ottenuti in vivo saranno paragonati con dati in vitro usando cellule adipose in coltura. Inoltre verrà valutata la secrezione i leptina, adiponectina, IL-6, TNF-alfa nelle persone adulte rispetto a persone anziane e saranno correlati con numerosi dati bioumorali ed antropometrici. I valori di adipochine in circolo verranno valutati in confronto con l'espressione di mRNA da parte di campioni di tessuto adiposo ottenuto dagli stessi soggetti. Infine si verificherà l'espressione dei differenti sottotipi di recettori purinergici P2 nelle cellule adipose di soggetti normali, il metabolismo di ATP a di altri nucleotidi mediati attraverso diversi recettori purinergici P2 in adipociti umani in coltura, anche in relazione alle variazioni di concentrazioni di calcio, la diversa espressione di recettori purinergici P2 durante la differenziazione di preadipociti in adipociti, ed infine la differenza di espressione di tali recettori nel tessuto adiposo di pazienti obesi in confronto con soggetti di controllo. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Carlo Maria ROTELLA Università degli Studi di FIRENZE

Obiettivo del Programma di Ricerca

La patogenesi dell'obesità è sicuramente multifattoriale. I fattori ambientali vanno ad agire su una componente genetica giocando un ruolo importante nella patogenesi, nei meccanismi che la mantengono, nel renderla resistente alla terapia ed infine nell'instaurarsi delle sue complicanze di cui le più importanti sono il Diabete mellito di tipo 2, le iperlipoproteinemie e l'ipertensione. Il cluster di aggregazione di queste condizioni morbose aumenta notevolmente il rischio cardiovascolare nei pazienti obesi. Nel presente programma si individuano due principali linee di ricerca.
La prima linea è diretta a studiare il ruolo dei due più importanti ormoni di origine gastrointestinale (ghrelin e GLP-1) nel meccanismo di regolazione della fame e della sazietà di pazienti obesi, nonchè dei loro effetti sul metabolismo glucidico. Infatti ghrelin è un ormone oressizzante ed esercita effetti diabetogeni, mentre GLP-1 a livello centrale e periferico esercita una notevole azione anoressizzante.L'obiettivo è quello di valutare come i diversi gradi di tolleranza glicidica possano indurre modifizioni del GLP-1 e del suo metabolismo modulando l'attività della DPPIV. Tali risultati verranno correlati con le eventuali modificazioni di markers precoci di disfunzione endoteliale e di rischio cardiovascolare quali la PCR, LDL-ox, VWF, PAI-1 e adiponectina.
Ulteriore obiettivo è quello di riprodurre in vitro modelli cellulari atti a studiare i meccanismi periferici e centrali del GLP-1 e della DPPIV. Accanto al ruolo del GLP-1, lo studio intende dimostrare l'eventuale presenza nell'obesità di alterazioni specifiche delle attività di ghrelin sulla modulazione del metabolismo glucidico, lipidico e della regolazione dell'introito alimentare; alterazioni specifiche della regolazione metabolica e nutrizionale della secrezione di ghrelin e di altri modulatori periferici e centrali del senso della fame e di insulinosensibilità. Inoltre obiettivo dello studio sarà anche valutare eventuali effetti del calo ponderale, ottenuto con la sola dieta oppure con l'associazione di una terapia farmacologia, sulla secrezione, sull'attività endocrino-metabolica di ghrelin e sui livelli di altri modulatori periferici e centrali del senso della fame e di insulino-sensibilità. Lo studio dei meccanismi di base nella regolazione periferica e centrale di questi sistemi si correla con l'obiettivo di trovare nuove strategie terapeutiche: da qui l'esplorazione di possibilità di terapia genica con GLP-1 in modelli cellulari e animali.
La seconda linea di ricerca si articola in tre fasi. La prima è tesa a valutare le concentrazioni circolanti di alcune adipochine e la loro espressione genica nel tessuto adiposo in varie condizioni fisiologiche e durante la perdita di peso. In particolare lo scopo è quello di confrontare in soggetti adulti- maturi ed anziani pareggiati per massa adiposa, i livelli circolanti, l'espressione tessutale e la produzione in cultura di alcune adipochine prodotte dal tessuto adiposo, al fine di valutare se la funzione endocrina dell'adipocita è modulata dall'invecchiamento, indipendentemente dall'entità del grasso corporeo.La seconda fase ha lo scopo è quello di valutare le relazioni tra adipochine pro-infiammatorie, leptino-resistenza, insulino-resistenza e markers di compliance arteriosa in soggetti adulti e anziani, con ampio range di BMI.per identificare un possibile meccanismo attraverso il quale l'adiponectina inibisce la sintesi di citochine l'unità di ricerca si propone di utilizzare colture di adipociti umani in presenza o assenza di adiponectina e di valutare l'attivazione dell' NF-kB, l'espressione genica del PPAR- g e del TNF-a (quest'ultimo anche nel medium di coltura).
La terza fase si propone di valutare i meccanismi di segnalazione da parte dell'ATP extracellulare e di altri nucleotidi dei differenti sottotipi di recettori P2 purinergici negli adipociti umani valutando le variazioni delle concentrazioni intracellulari di calcio, le variazioni del potenziale di membrana, le alterazioni della permeabilità della membrana plasmatica a soluti di peso molecolare fino a 900 Da e la capacità degli adipociti di secernere ATP; valutare la presenza di una differente espressione dei recettori P2 purinergici durante la differenziazione degli adipociti e il ruolo dell'attivazione di questi recettori da parte dell'ATP e di altri nucleotidi sulla funzione degli adipociti umani valutata attraverso la determinazione dell'uptake di glucosio, e la secrezione di alcune citochine quali la leptina, la resistina, l'adiponectina, l'interleuchina 6 (IL-6), IL TNF-alfa; valutare l'espressione dei differenti recettori purinergici nel tessuto adiposo omentale di soggetti magri e di soggetti obesi in relazione alle condizioni metaboliche di ciascun soggetto. <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Il rapido incremento della prevalenza di diabete tipo 2, obesità, e delle complicanze associate, rappresenta un importante problema sanitario globale. Sia la dieta che i farmaci oggi disponibili inducono perdita di peso persistente solo in una stretta minoranza di soggetti: infatti, una volta instaurato uno stato cronico di eccedenza ponderale, il sistema nervoso centrale interpreta la restrizione calorica come minaccia alla sopravvivenza. In risposta alla restrizione alimentare, i sistemi di controllo nell'ipotalamo riducono il dispendio metabolico e deviano l'utilizzazione dell'energia al fine di mantenere la composizione corporea esistente.
L'obesità semplice è caratterizzata non solo dalla presenza di insulino-resistenza, ma anche da numerose alterazioni endocrine, tra cui una ridotta secrezione di GH ed un'iperattività dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene. La compromissione dell'attività dell'asse somatotropo appare secondaria ad una disfunzione neurosecretoria, anche se recenti studi hanno suggerito che una sregolazione nella produzione di fattori metabolici e ormoni periferici possa svolgere un ruolo chiave.
Recentemente la lista dei mediatori del controllo fisiologico del metabolismo energetico e dell'appetito è stata arricchita da numerosi nuovi ormoni centrali e periferici tra cui ghrelin, leptina, adiponectina, oressine, PYY, NPY, GLP1 e resistina.
Ghrelin è un ormone gastrico che circola nel torrente ematico in due forme: una acilata in serina 3 e una seconda, l'80-90% della ghrelinemia totale, priva di acile. Mediante specifici recettori ghrelin acilato esercita numerose attività endocrine e non endocrine.
Tra queste, particolare interesse è stato rivolto al marcato effetto oressante e di controllo del dispendio energetico.(1-3) Tali effetti sono mediati da uno specifico network neuronale che è modulato, in senso opposto, dalla leptina, ormone peptidico ad azione anoressante centrale prodotto da adipociti differenziati. Tale sistema subisce a sua volta l'integrazione di numerosi altri ormoni centrali e periferici tra cui adiponectina, oressine, PYY, NPY, GLP1 e resistina. Ghrelin possiede anche importanti attività metaboliche dirette a livello periferico. Ghrelin, sia in forma acilata, sia in forma non acilata modula il metabolismo glicidico a livello epatico e promuove l'adipogenesi direttamente a livello degli adipociti.
Nell'uomo, la somministrazione acuta di ghrelin acilato inibisce la secrezione insulinica e induce un indipendente effetto iperglicemizzante. Tali effetti vengono antagonizzati dalla co-somministrazione con ghrelin non acilato. (4-7) Nell'obesità semplice i livelli di ghrelin sono ridotti, in maniera inversamente proporzionale all'indice di massa corporea. Tali alterazioni secretorie sono risultate tuttavia essere un adattamento funzionale reversibile allo stato positivo di bilancio energetico piuttosto che un fattore eziologico dell'obesità (8).
Il Glucagon-like peptide (GLP-1) è un polipeptide in grado di stimolare la secrezione insulinica glucosio mediata, che viene secreto dalle cellule L-intestinali in risposta al pasto. Inoltre gioca un ruolo nella regolazione dell'assunzione di cibo ed è un fattore trofico per le b-cellule. Il gene per il proglucagone è espresso sia nelle cellule L-intestinali che nelle a-cellule pancreatiche (9).L'ileo è la principale fonte di GLP-1, infatti, i pazienti con colon-resezione mostrano una normale secrezione del GLP-1 (10). Il GLP-1 (7-36) amide è la forma attiva del GLP-1, la sua concentrazione nel plasma umano e nel tessuto pancreatico e intestinale è 5 volte maggiore del GLP-1 (7-37) (11). Nell'uomo la secrezione del GLP-1 è pulsatile con 5-7 picchi per ora (12) e i livelli circolanti aumentano dopo una curva da carico di glucosio o dopo un meal test (13). Il GLP-1 è inoltre sintetizzato e secreto da una popolazione di neuroni ipotalamici localizzati nel nucleo del tratto solitario (14). Recettori per il GLP-1 sono stati individuati in diverse aree ipotalamiche, nel talamo, nell'amigdala e sulla corteccia (15). L'iniezione intracerebroventricolare di GLP-1 in ratti, riduce l'assunzione di cibo (16). Nonostante il GLP-1 riduca gli effetti dell'NPY sull'assunzione del cibo (17), non sono stati dimostrati effetti diretti sui neuroni secernenti NPY. I dati disponibili suggeriscono che i neuroni del nucleo del tratto solitario che secernono GLP-1 nell'ipotalamo in particolare nel nucleo arcuato e paraventricolare, potrebbero essere coinvolti nell'assunzione di cibo. Bisogna considerare come i dati attualmente disponibili derivano da modelli animali e che poco si conosce sulla regolazione nell'uomo. Gli effetti del GLP-1 periferico sul sistema nervoso centrale sono ancora controversi: la forma attiva del GLP-1 attraversa la barriera emato-encefalica e interagisce con i recettori centrali del GLP-1 (18), ma rimane sconosciuto l'effetto di tale interazione. E' stato dimostrato come i livelli di GLP-1 dopo pasto misto (19) e dopo carico orale di glucosio (20) siano ridotti in pazienti con diabete mellito tipo 2.La riduzione dei livelli di GLP-1 glucosio indotta è stata anche valutata durante clamp iperinsulinemico euglicemico (20). La riduzione postprandiale dei livelli della forma attiva del GLP-1, in soggetti con diabete mellito tipo 2, come conseguenza dell'iperglicemia cronica, potrebbe giustificare la riduzione del picco di secrezione insulinica precoce, tipica dei pazienti con diabete mellito tipo 2; infatti la somministrazione in volontari sani di antagonisti recettoriali del GLP-1, induce un'alterazione della secrezione insulinica pasto-indotta e un aumento della glicemia post-prandiale, simile a quella riscontrata nei pazienti diabetici tipo 2 (21-23).In vivo, il GLP-1 è rapidamente inattivato con il taglio di un dipeptide NH-terminale principalmente dalla dipeptidyl-peptidase-IV (DPP-IV) (24). In un piccolo campione di diabetici tipo 2 anziani sono stati riscontrati ridotti livelli circolanti di DPP-IV (25), mentre in un altro studio sempre con una bassa numerosità di diabetici tipo 2, i livelli di DPP-IV sono risultati invariati rispetto ai controlli matchati (19). La bassa numerosità dei campioni e il discutibile dosaggio della componente circolante della DPP-IV verso quella endoteliale rende tali dati non conclusivi. D'altra parte, in cellule endoteliali glomerulari umane in vitro, l'esposizione ad alte concentrazioni di glucosio aumenta l'espressione e l'attività della DPP-IV, potendo quindi contribuire alla riduzione del GLP-1 nei diabetici tipo 2 (26). Inoltre la sensibilità delle b-cellule al GLP-1 è attenuata nei diabetici rispetto ai soggetti non diabetici (27).
La risposta del GLP-1 (7-36) amide all'OGTT è stata riscontrata più bassa negli obesi rispetto ai controlli magri, mentre nessuna differenza è stata riscontrata dopo un carico orale di grassi (28); quest'ultimo dato è stato poi riconfermato dallo stesso gruppo, su un differente campione di soggetti obesi e magri (24). In un successivo studio, pazienti obesi mostrano più bassi livelli basali di GLP-1 e un più rapido svuotamento gastrico rispetto a soggetti magri matchati (29). In soggetti obesi a 20 anni dall'intervento di by-pass digiuno-ileare per obesità, si evidenziano livelli basali e postprandiali di GLP-1 aumentati rispetto a soggetti obesi non operati (30). Tale incremento, che si associa ad un rallentamento dello svuotamento gastrico, potrebbe contribuire al miglioramento della tolleranza glicidica (31). In pazienti con diabete tipo 2 e in soggetti non-diabetici (32) il GLP-1 ha mostrato ridurre il peso corporeo e l'assunzione di cibo.
L'obesità è caratterizzata da un aumento del tessuto adiposo che contribuisce ad un'aumentata secrezione di citochine proinfiammatorie (come il TNF-alfa), una diminuita secrezione di adiponectina ed un pattern "infiammatorio" del tessuto adiposo (33). IL TNF-alfa; non solo ha un ruolo fondamentale nell'indurre la secrezione di leptina, IL-6 e altre citochine infiammatorie e l'espressione delle molecole di adesione sulle cellule endoteliali, ma anche nell'aumentare lo stresso ossidativo (33). L'adiponectina, secreta esclusivamente dal tessuto adiposo è di cruciale importanza nell'associazione tra obesità, diabete tipo 2 ed insulino resistenza. Contrariamente al TNF-alfa; ha un effetto protettivo sia sull'inizio che sulla progressione dell'aterosclerosi (34). L'espressione e la secrezione di adiponectina vengono inibite dal TNF-alfa; (35) e numerosi studi indicano che nel tessuto adiposo l'espressione e la secrezione di adiponectina e di TNF-alfa; si inibiscono l'un l'altro (34,36).E' stato ipotizzato che il meccanismo attraverso il quale avviene questo effetto antagonistico coinvolga il fattore di trascrizione NFkB: questa, infatti, è la via utilizzata da alcune citochine proinfiammatorie (come il TNF-alfa) per stimolare la sintesi di citochine e delle molecole di adesione. L'adiponectina, al contrario, è in grado di ridurre l'attivazione dell'NFkB indotta dal TNF-alfa (36)
I peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) sono fattori di trascrizione che appartengono alla superfamiglia dei recettori nucleari dotati non solo di importanti effetti metabolici, ma anche cardiovascolari (37-39). Numerose evidenze sia in vitro che in modelli animali hanno dimostrato che l'attivazione dei recettori PPARgamma;, non solo migliora l'insulino resistenza, ma anche determina un ampio spettro di effetti aterosclerotici (40).A questo proposito è stato evidenziato in cellule miocardiche come l'attivazione dei PPARgamma; sia in grado di ridurre l'attivazione dell'NFkB; inoltre la terapia con tiazolidinedioni, farmaci attivatori dei PPARgamma; aumenta i livelli circolanti di adiponectina (41). In animali obesi è stata infine dimostrata una ridotta espressione del recettore PPARgamma;.
Finora poche sono le conoscenze sulle vie attraverso le quali l'adiponectina inibisce la secrezione di citochine. In un recentissimo lavoro è stato dimostrato in colture di adipociti di maiale, come l'adiponectina sia stata in grado di bloccare la produzione di TNF-alfa; attraverso un'inibizione dell'attivazione dell'NFkB ed un aumento dell'espressione del PPARgamma;. L'ipotesi è che l'adiponectina funzioni con un meccanismo autocrino sopprimendo l'infiammazione nell'adipocita.
La relazione tra obesità', rischio cardiovascolare e aterosclerosi potrebbe essere mediata quindi dalla produzione da parte del tessuto adiposo di adipochine. L'invecchiamento si associa a significativo incremento del grasso corporeo con sua re-distribuzione in senso centripeto, nonché incremento della prevalenza della sindrome metabolica. E' stato suggerito che anche nei soggetti anziani, in particolare se affetti da sindrome metabolica, vi sia aumentato livello di peptidi infiammatori. E' possibile ipotizzare che, con l'invecchiamento, si verifichi incremento della secrezione di adipochine proinfiammatorie da parte del tessuto adiposo e che tali adipochine possano essere responsabili, almeno in parte, dell'incremento del rischio di sindrome metabolica osservato in eta' geriatrica (42-45)
E' stato inoltre ipotizzato, e solo in parte osservato nel ratto, che nel soggetto anziano vi sia iperleptinemia sia a digiuno che dopo carico di glucosio e ridotta leptino-sensibilità, con ridotta capacità ossidativa dei grassi, aumentata deposizione lipidica in sede ectopica (muscolo, fegato, pancreas, cuore), con conseguente lipotossicità (46,47). Iperleptinemia e leptino resistenza potrebbero quindi essere ulteriori fattori in grado di spiegare l'aumentato rischio di alterazioni emodinamico-metaboliche osservato in età geriatrica.
Una caratteristica interessante della risposta infiammatoria presente nell'obesità è che questa sembra iniziare e risiedere nel tessuto adiposo con il coinvolgimento anche di altre strutture (48). A tale riguardo non è ancora noto il ruolo dell'adipocita nella risposta infiammatoria che si osserva nell'obesità anche se è stato dimostrato che queste cellule sono in grado di produrre un elevato numero di citochine e vi è inoltre una stretta sovrapposizione tra le caratteristiche biologiche degli adipociti e quelle dei macrofagi (49,50): per esempio i precursori degli adipociti possiedono attività di tipo fagocitino (51) e molti dei geni che sono noti essere importanti nelle funzioni degli adipociti sono espressi anche nei macrofagi (51). Il tessuto adiposo esprime numerosi geni coinvolti nella risposta infiammatoria e la loro espressione è regolata da agenti farmacologici che vengono utilizzati nella terapia dell'insulino resistenza dell'obesità (come ad esempio i tiazolininedioni) e sono inoltre espressi in modo differente nel tessuto adiposo degli animali magri e obesi (52,53). Infine è ben noto che un elevato numero di macrofagi si infiltra il tessuto adiposo in espansione e tale caratteristica è tipica dell'obesità (54). Queste considerazioni potrebbero avere importanti ricadute di tipo clinico in quanto l'alterata produzione di citochine pro-infiammatorie da parte del tessuto adiposo potrebbe essere coinvolta nella patogenesi della sindrome metabolica e nelle complicanze cardiovascolari che caratterizzano l'obesità. Il tessuto adiposo esprime infatti elevati livelli di citochine pro-infiammatorie quali TNF-alfa, IL-6, TGF-beta, la proteina chemotattica per i monoliti (MCP-1) e altre adipocitochine (55-60).
I nucleotidi extracellulari rappresentano un gruppo di sostanze che mediano un elevato numero di funzioni in molti tipi cellulari quali la contrazione delle cellule muscolari lisce, la produzione endoteliale di ossido nitrico, la stimolazione del rilascio di citochine dalle cellule del sistema immunitario, la modulazione di una serie di pathways metabolici (61). Numerosi tipi cellulari esprimono recettori di membrana per l'ATP ed altri nucleotidi e sono denominati P2 purinergici (61). Studi di tipo farmacologico e di biologia molecolare hanno portato alla classificazione di questi recettori in due famiglie: P2X e P2Y. I recettori P2X sono canali ionici attivati dal ligando e permeabili a cationi monovalenti e fino ad oggi ne sono stati individuati 7 sottotipi (62). I recettori P2X sono espressi in modo differente nei tessuti e mostrano un coinvolgimento in funzioni cellulari specializzate quali la trasmissione transmembrana, la crescita cellulare, reazioni citotossiche, l'apoptosi (63). La famiglia dei recettori purinergici P2Y comprende 8 sottotipi clonati fino ad oggi nell'uomo. Questi recettori appartengono alla famiglia dei recettori accoppiati alle proteine G che attraversano 7 volte la membrana plasmatici cellulare e sono tipicamente accoppiati alla mobilitazione di calcio da depositi intracellulari attraverso il coinvolgimento di proteine G della classe Gq/G11 e l'attivazione della fosfolipasi C. Esiste inoltre la possibilità che alcuni sottotipi di recettori P2Y siano accoppiati attraverso il coinvolgimento di proteine G della classe Gi/G0 all'inibizione dell'adenilato ciclasi (61,64). In particolare nell'obesità il tessuto adiposo presenta un'aumentata espressione delle diverse citochine e la loro secrezione da parte del tessuto adiposo gioca un ruolo importante nel determinare le complicanze metaboliche dell'obesità. Fino ad oggi solo uno studio ha caratterizzato parzialmente dal punto di vista farmacologico i recettori P2 purinergici nelle cellule stremali del tessuto adiposo umano (65). In particolare non vi sono studi riguardanti gli specifici sottotipi recettoriali P2X e/o P2Y espressi nel tessuto adiposo e gli effetti biologici indotti dall'ATP extracellulare e da altri nucleotidi in queste cellule in relazione alla secrezione di citochine e ad un possibile coinvolgimento nei meccanismi correlati alle caratteristiche infiammatorie dell'obesità. <<<