RICERCA ITALIANA     

VALIDAZIONE DI TECNICHE DI AUTOFLUORESCENZA PER IL RICONOSCIMENTO DEI LINFONODI NEOPLASTICI BORDERLINE

Università degli Studi di Firenze

Abstract

Il progetto si articola sullo studio di linfonodi neoplastici sia metastatici che primitivi, con particolare riferimento alle forme borderline, vale a dire sulla ricerca di quelle microlocalizzazioni linfonodali che sono notoriamente di difficile interpretazione. L'obiettivo del progetto è di validare l'efficacia dell'analisi dell'autofluorescenza per una sua possibile applicazione alternativa alle metodiche tradizionali in campo diagnostico. Per giungere a questo risultato è stato necessario riunire più competenze sia nell'ambito medico che tecnico. Il gruppo di studio comprende due unità chirurgiche (unità I e IV) e una anatomatopatologica (unità V) e due unità tecniche per l'analisi dell'immagine (sia da un punto di vista delle analisi multispettrali, unità II, sia per quanto riguarda lo sviluppo del software di riconoscimento, unità III).
Le unità chirurgiche effettuano il campionamento di linfonodi, sia macroscpicamente metastatici sia borderline, provenienti da pazienti con tumori del colon e dello stomaco. Il campionamento dei linfonodi potenzialmente portatori di micrometastasi sarà effettuata mediante l'identificazione del linfonodo sentinella. La tecnica prevede l'uso del patent blue. I linfonodi selezionati, congelati ed opportunamente sezionati, saranno sottoposti ad analisi di autofluorescenza e MIAM. Sulle stesse sezioni l'unità V, anatomia patologica, svolgerà l'analisi di immunoistochimica , meodica che , al momento. rappresenta l'indagine standard per la ricerca delle micrometastasi. Inoltre saranno valutati dai medici dell'Ematologia i linfonodi primitivi ed anche essi sottoposti ad indagine di autofluorescenza e MIAM con il confronto immunoistochimico. Oltre al confronto tra l'analisi con tecniche di autofluoresceza e di immunoistochimica, lo studio valuterà anche la ricaduta dell'uso del linfondo sentinella sulla stadiazione dei tumori presi in esami. Per questa tecnica di selezione dei linfonodi,inoltre sarà effettuato il confronto dei risultati ottenuti dalle due Unità chirurgiche (I eIV), per ottimizare tempi di esecuzione e le modalità di campionamento. Infine i componenti del gruppo di studio si prefiggono di realizzare un sistema computerizzato per la lettura dei vetrini, basato sul concetto del microscopio ad epifluorescenza per l'analisi diretta intraoperatoria dei linfonodi stessi. Per questa parte del progetto e le difficoltà tecniche che esso comporta è richiesta una stretta sicronizzazione delle azioni dei componenti del gruppo di ricerca. <<<

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Paolo BECHI Università degli Studi di FIRENZE

Obiettivo del Programma di Ricerca

Il progetto si articola sullo studio di linfonodi neoplastici sia metastatici che primitivi, con particolare riferimento alle forme borderline, vale a dire sulla ricerca di microlocalizzazioni che sono notoriamente di difficile interpretazione. Recentemente è stato dimostrato che la tecnica di autofluorescenza consente di discriminare tra tessuto linfoide neoplastico e non-neoplastico sulla base del pattern di autofluorescenza,che evidenzia inequivocabilmente la perdita di organizzazione strutturale nel tessuto neoplastico. L'obiettivo è quello di validare l'efficacia dell'analisi dell'autofluorescenza per una sua possibile applicazione alternativa alle metodiche tradizionali in campo diagnostico. Per giungere a questo risultato è stato necessario riunire più competenze sia nell'ambito medico che tecnico. Il gruppo di studio comprende due unità chirurgiche e una anatomopatologica e due unità tecniche per l'analisi dell'immagine (sia da un punto di vista delle analisi multispettrali, unità II, sia per quanto riguarda lo sviluppo del software di riconoscimento, unità III). La ricerca di ogni componente mira alla realizzazione dell'obiettivo finale, attraverso il conseguimento di obiettivi differenziati per ognuno.

Le unità chirurgiche eseguiranno il campionamento dei linfonodi utilizzando la metodica del linfonodi sentinella. Gli obiettivi sono molteplici, inanzitutto la metodica necessitò di una fase di messa a punto (curva di apprendimento) per ottimizzare i tempi e le modalità tecniche di esecuzione . La metodica inoltre sarà eseguita dalle due unità chirurgiche in modo da valutare anche le possibili difficoltà nel ripetere la metodica ed ottenere anche la sua standardizzazione. Questa prima fase ha anche l'obiettivo di convalidare l' efficacia della metodica nella identificazione di quelle micrometastasi che potrebbero sfuggire all'esamen istologico convenzionale e di valutare la sua utilità nel campionamento dei linfonodi da sottoporre ad analisi di autofluorescenza. Inoltre nel caso che sia possibile reclutare linfonodi microscopicamente neoplastici, questi saranno utilizzati per incrementare la numerosità dei campioni già esistente
Il corretto reclutamento dei linfonodi metastatici con il linfonodo sentinella fornendo materiale per le sezioni sia si autofluorescenza che istopoatologiche consentirà alla U V di effettuare le indagini specifiche per conseguire gli obiettivi precipui , vale a dire la valutazione dell'incidenza di cellule tumorali circolanti (ITC)/micrometastasi nel linfonodo sentinella di pazienti operati per carcinoma del tratto gastro-enterico attraverso l'uso di sezioni seriate, che consentono la valutazione di tutto il linfonodo, con l'ausilio delle tecniche immunoistochimiche. Questa valutazione inoltre ha un fine ultimo e fondamentale, vale a dire esaminare con l'immunoistochimica le stesse sezioni esaminate con tecniche di autofluorescenza per valutare le micrometastasi presenti confrontando i risultati con quelli ottenuti in autofluorescenza.. Tale confronto fornirà la validazione dell'autofluorescenza anche nelle forme con microlocalizzazioni e quindi di complessa e difficile interpretazioneL'unita II si occuperà appunto di compiere unitamente con l'unità V unaulteriore validazione della tecnica "Multispectral Imaging Autofluorescence Microscopi" MIAM, con l'analisi dei linfonodi "borderline", cioè di quei linfonodi che , pur non risultando macroscopicamente infiltrati, potrebbero essere sede di micrometastasi.
L'unità III , a questo punto dovrà identificaregli algoritmi di analisi di immagini MIAM per il riconoscimento di linfonodi neoplastici

Inoltre uno degli obiettivi primari del progetto sarà lo sviluppo di un sistema automatizzato, basato sulla struttura di un microscopio ad epi-fluorescenza, ed adatto ad essere utilizzato per la diagnosi in sede intraoperatoria, capace di discriminare linfonodi normali e neoplastici in base all'imaging e alla spettroscopia di sezioni istologiche da biopsie linfonodalile <<<

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Selezione chirurgica dei linfonodi metastatici

L'obiettivo fondamentale della chirurgia dei tumori è di ottenere un trattamento "radicale", ottenendo però, il massimo risultato ai fini della radicalità con il minore traumatismo possibile e riducendo così l'incidenza di mortalità e morbilità postoperatorie. La linfoadenectomia e la sua estensione riveste un ruolo di innegabile importanza in questo senso: essa è stata ed è tuttora oggetto di ricerche in molti tumori (ad es. il melanoma , il tumore della mammella, quello del polmone, della prostata, oppure del colon-retto e in altri ancora). L'identificazione intraoperatoria di linfonodi metastatici in molti casi, rappresenta un momento focale per la strategia chirurgica e l'estensione della linfoadenectomia.
Per la valutazione dello stato linfonodale, negli ultimi anni , si è affermata sempre più la metodica cosìdetta del " linfonodo sentinella" (SL) cioè l'individuazione della prima stazione linfonodale che è interessata dalla diffusione metastatica (1-7).

Il SL: colorante vitale e radiocolloidi
L'indagine con il colorante vitale "blue dye" è una metodica intraoperatoria (8). Il colorante maggiormente utilizzato in Europa è il Patent Blue (8); esso si lega alle proteine endogene e viene così "intrappolato" all'interno dei capillari linfatici (9), e raggiunge velocemente la prima stazione linfonodale, il SL, appunto. Il tempo di esecuzione deve essere breve, perchè il colorante transita velocemente nei linfatici, e nei linfonodi stessi . Tempi prolungati condurranno al progressivo "scolorarsi" della prima stazione mentre si evidenzieranno quelle successive e più lontane.
L'altro metodo d'identificazione dei linfonodi utilizza mezzi "marcati", ad es. con TC99. In questa metodica , uno dei concetti limitanti è rappresentato dalla somministrazione di un tracciante che è comunque radioattivo, l'altro è dovuto ai costi sempre elevati. Questa tecnica è poco maneggevole, ha delle modalità di esecuzione precise, l'iniezione nella sede del tumore deve essere eseguita molte ore prima poiché la radioattività vi permane a lungo (6,10). La lentezza della progressione è direttamente proporzionale alle dimensioni delle particelle radioattive con una range di accumulazione nei linfonodi che varia dallo 0.01% all1% (10).

SL e cancro del colon
Nei tumori del colon, il linfonodo sentinella è usato per la stadiazione più che per modulare l'ampiezza della linfadenectomia. Infatti circa il 55% dei pazienti affetti da cancro del colon ha un tumore apparentemente limitato alla parete colica con linfonodi negativi, ma circa il 20-30% di essi finirà per presentare una progressione della malattia e morirà nonostante la radicalità dell'intervento sul primitivo. L'ipotesi più accreditata e che i linfonodi siano interessati da foci di micrometastasi che riescono a sfuggire all'esame istopatologico convenzionale (11). Inoltre i linfonodi in questa area , spesso non superano le dimensioni di 5mm e sono difficilmente individuabili su pezzo operatorio fissato in formalina come prevede lo standard attuale.
Nei tumori del colon la presenza di microlocalizzazioni linfonodali, inoltre, potrebbe modificare l'estensione della linfadenectomia in caso di vie linfatiche aberranti con percorsi di diffusione diversi da quelli abituali.
Per quanto riguarda i tumori del retto, la maggior parte degli autori ritengono la metodica difficile da applicare e secondo alcuni addirittura impossibile (12). Nel caso di traccianti radiomarcati, la vicinanza del tumore primitivo, sede di iniezione, provoca una sovrapposizione della radioattività che confonde il segnale proveniente dai linfonodi (13). Se si utilizza il blue, il retto deve essere mobilizzato per effettuare il ritrovamento dei linfonodi, complicando così l'esecuzione (14,15). Per la metodica ,infine, la colorazione "ex vivo", non permette di identificare la presenza di vie linfonodali aberranti, condizione che giustificherebbe variazioni dell'ampiezza della linfoadenectomia.

SL e tumori dello stomaco
Sulla linfadenectomia nel cancro gastrico sono numerose le ricerche in corso. Infatti, mentre nei paesi asiatici la linfadenectomia D2 è procedura standard anche nell'early cancer, nei paesi occidentali la sua estensione è meno standardizzata e per l'early gastric cancer non è inclusa la linfadenectomia di routine.
Sul SL, sono stati effettuati numerosi trials negli ultimi anni.(3-7,16,17) La complessità del drenaggio linfatico nello stomaco e la presenza di una incidenza, relativamente bassa (15-20%) di "skip lesions" ha indotto una certa cautela riguardo al SL. Al momento anche se la letteratura offre, ampie dimostrazioni sull'affidabilità della metodica (16,17), non è ritenuto giustificabile ridurre l'estensione della linfadenectomia in seguito ai risultati del SL (17).
Anche nel cancro di stomaco le metodiche più utilizzate sono il colorante vitale da una lato e il mezzo radiomarcato dall'altro. La metodica ricalca essenzialmente quella gia descritta per il colon e il linfonodo sentinella è quello che si colora per primo, entro i 4-5-minuti dalla iniezione peritumorale sottosierosa del colorante vitale.
Nella metodica con Tc99 l'iniezione in sede peritumorale viene eseguita il giorno prima per via endoscopica. Il radiocolloide progredisce verso i linfonodi nelle 2 ore successive alla iniezione e permane per circa 20 ore. Anche nel caso del tumore gastrico, la stretta vicinanza della prima stazione linfonodale al tumore, può condurre alla sovrammissione dell' emissioni di radioattività, rendendo così più difficile l'esecuzione del campionamento (19).
Nel nostro studio abbiamo optato per l'uso intraoperatoria del colorante vitale (Patent Blue) così come è descritto in letteratura (15-18), per via sottosierosa. La scelta cade su questa metodica perché è di semplice esecuzione, non richiede particolari equipaggiamenti in sala operatoria, è meno costosa e più rapida, con una ricaduta limitata sui tempi (11).
Questo campionamento viene espressamente utilizzato per esaminare i linfonodi anche con la tecnica dell'autofluorescenza, e confrontare i risultati con quelli della immunoistochimica.
Nel presente studio, inoltre sarà proseguita la valutazione delle linfoadenopatie primitive e la loro ulteriore definizione.

Focus sulle "micrometastasi"
La stadiazione patologica della maggior parte dei tumori solidi si basa sul grado di estensione tumorale nell'organo di origine, sulla diffusione metastatica ai linfonodi e agli organi a distanza. Il riscontro di malattia localmente disseminata è fra gli obiettivi principali della chirurgia oncologica, da qui l'estremo interesse nel riuscire a documentare la presenza di cellule tumorali occulte nei linfonodi regionali di pazienti affetti da neoplasia. La maggior parte degli studi effettuati fino ad oggi si sono focalizzati sul carcinoma della mammella. E' noto che si possono identificare foci tumorali occulti nei linfonodi ascellari precedentemente valutati negativi con le tecniche istopatologiche standard. I dati ottenuti su ampie casistiche dall'International Breast Cancer Study Group hanno dimostrato che la presenza di metastasi occulte identifica pazienti con carcinoma della mammella con rischio di recidiva e di morte per neoplasia significativamente aumentato. Altri studi hanno dimostrato un valore prognostico significativo per le metastasi linfonodali occulte anche nei pazienti con melanoma e in quelli con carcinoma polmonare. Il riscontro foci neoplastici nei linfonodi negativi con la colorazione in ematossilina-eosina è un fenomeno piuttosto comune anche nel carcinoma del colon-retto. I risultati della letteratura, basati su metodologie immunoistochimiche, sono alquanto eterogenei con percentuali di linfonodi positivi variabili nelle diverse casistiche dal 2 al 76%. Queste diversità possono essere in parte giustificate dal diverso numero di linfonodi repertati così come dal diverso numero di sezioni effettuate sui linfonodi esaminati nei diversi studi.
Il termine "micrometastasi" è stato ampiamente utilizzato per indicare piccoli raggruppamenti di cellule tumorali spesso non identificati a causa delle modalità di campionamento. Un ulteriore motivo di confusione nasce dal diverso uso del termine
micrometastasi applicato anche ad indicare la presenza di cellule tumorali isolate (ITC) nel sangue, nel midollo osseo, nei vasi linfatici e nei linfonodi attraverso l'uso di tecniche morfologiche e non morfologiche. Questa ultima definizione viene utilizzata e descritta nella sesta edizione dell'AJCC Manual for Staging of Cancer.
ITC sono definite cellule tumorali singole o piccoli gruppi di cellule le cui dimensioni risultano < 0,2mm; micrometastasi sono depositi tumorale di dimensioni > 0,2mm e < 2mm.
L'uso di sezioni seriate sui linfonodi recuperati dal materiale chirurgico aumenta la possibilità di repertare la presenza di malattia metastatica (ITC e/o micrometastasi). E' stato calcolato che se l'esame di un linfonodo è effettuato tramite lo studio di una sezione di spessore di 5 micron, solo lo 0,04% del linfonodo risulta esaminato introducendo quindi significative possibilità di errore di campionamento.
La presenza di cellule tumorali isolate o di piccoli cluster tumorali può sfuggire alla colorazione standard in ematossilina-eosina. Da qui l'applicazione di metodiche speciali quali l'immunoistochimica e le tecniche di biologia molecolare. L'immunoistochimica rappresenta la tecnica ancillare di prima scelta dopo l'esame in ematossilina-eosina per la ricerca di malattia occulta. Per la ricerca di cellule maligne di origine gastrica o intestinale sono disponibili svariati anticorpi diretti verso antigeni epiteliali (anticorpi per le citocheratine 8 e 18, citocheratina 7, citocheratina 20, ecc). Il recente sviluppo delle tecniche di biologia molecolare ha messo a disposizione un vasto repertorio di metodologie molte delle quali hanno trovato applicazione nello studio delle micrometastasi. Nella maggior parte è utilizzata la reazione a catena di polimerizzazione (PCR), che permette l'amplificazione esponenziale di piccolissime quantità di acido nucleico (DNA o RNA). Nonostante che le tecniche di biologia molecolare , in particolare la "reverse transcriptase chain reaction" (RT-PCR), siano più sensibili, l'immunoistochimica rimane per ora la tecnica più specifica e più riproducibile, che permette di differenziare morfologicamente le cellule neoplastiche da quelle non-neoplastiche e le ITC dalle micrometastasi.
Lo studio del SL ha incrementato l'accuratezza diagnostica sullo stato linfonodale (ad es. nel melanoma e nel carcinoma della mammella) ma il suo ruolo nei carcinomi gastrici e del colon non è al presente ben definito. La valutazione del SL, con studio seriato e immunoistochimica, potrebbe portare un importante contributo all'accuratezza della stadiazione della neoplasia. Inoltre, la bassa incidenza di "skip lesions" suggerisce che il mappaggio del SL presenti una certa precisione nel prevedere la presenza di metastasi linfonodali.

L'analisi dei tessuti con autofluorescenza
Le cellule ed i tessuti biologici contengono molecole che, se eccitate con radiazione di adatta lunghezza d'onda, sono fluorogeniche (20). I principali fluorofori endogeni sono proteine (21), coenzimi nicotinici (22), flavine (23) e lipopigmenti (24). Questa fluorescenza endogena è denominata autofluorescenza per distinguerla da quella che si può ottenere utilizzando marcatori fluorescenti esogeni (25).
Variazioni morfologiche o funzionali di cellule e tessuti, dovute a normali processi fisiologici, all'instaurarsi di condizioni patologiche, o ad interazioni farmacologiche, influenzano la concentrazione e la distribuzione dei fluorofori endogeni e dell'autofluorescenza. Si intuisce facilmente come l'analisi dell'autofluorescenza possa fornire informazioni sullo stato morfologico e funzionale di cellule e tessuti, e come le tecniche basate sul monitoraggio della fluorescenza possono essere utilmente applicate sia nella ricerca di base che nella diagnostica. Infatti nel periodo 1985-1995 sono stati circa 500 i lavori indicizzati (Medline), su questo argomento mentre dal 1995 al 2005 il numero delle pubblicazioni indicizzate è salito ad oltre 1100, a dimostrazione del crescente interesse su questa metodica e le sue possibili applicazioni.
Le tecniche analitiche basate sulla rivelazione dell'autofluorescenza non richiedono particolari procedure di allestimento dei campioni , sono più conservative e meno invasive rispetto a quelle che utilizzano marcatori esogeni , si prestano ad essere applicate in vivo e possono essere effettuate in tempo reale e con notevole abbattimento dei costi.
Il maggior problema delle tecniche di spettroscopia di autofluorescenza è la risoluzione ed attribuzione dei segnali, perchè cellule ed tessuti contengono diversi fluorofori con spettri di eccitazione-emissione parzialmente sovrapposti.
In campioni complessi, come le sezioni istologiche, la separazione e determinazione quantitativa delle diverse componenti risulta, con le sole tecniche spettroscopiche, assai complessa. Le tecniche di Multispectral Imaging Autofluorescence Microscopy (MIAM) possono migliorare sensibilmente la caratterizzazione dei tessuti: combinando risoluzione spettrale e spaziale, forniscono informazioni sia sugli spettri di fluorescenza e sull'intensità di emissione dei diversi fluorofori, sia sulla loro localizzazione (25).
La tecnica MIAM può essere applicata sia per la diagnosi dei linfonodi neoplastici. Studi statisticamente significativi da noi condotti su linfonodi di pazienti con iperplasia reattiva, con linfomi Hodgkin e non Hodgkin, o affetti da tumori gastrointestinali, dimostrano che l'analisi con tecnica MIAM è attendibile, anche a confronto con l'immunoistochimica standardizzata (26).

L'interpretazione dell'immagine
L'ottimale per il medico, sarebbe, quindi poter utilizzare un sistema automatico di analisi delle immagini a fluorescenza che in tempo reale evidenziasse i casi sospetti e fornisse un supporto nella diagnosi finale.
Finora non sono stati proposti molti sistemi di diagnosi automatica (Computer Aided Diagnosis) che utilizzano le tecniche di autofluorescenza e MIAM.
Le poche proposte presenti in letteratura (27-30) definiscono tecniche di decisione basate sulla sola analisi delle immagini in fluorescenza o sulla sola analisi spettrofluorimetrica, senza, in genere, considerare altre caratteristiche (citometriche,
morfologiche, strutturali). Nell'ambito delle tecniche di interpretazione automatica di immagini, il modello di sistema di decisione più vicino alle caratteristiche del problema descritto è senz'altro quello del Sistema Multi Esperto (MES) (31,32) che consente di utilizzare diversi classificatori cooperanti, ognuno dei quali è specializzato su una particolare caratteristica da analizzare. Questo schema di classificazione è stato finora usato per molte applicazioni (33-37) con un certo successo. L'idea di fondo è che una decisione collettiva, presa sulla base delle risposte di un insieme di classificatori, ha probabilità di essere corretta maggiore rispetto ai singoli classificatori, se questi forniscono decisioni basate su informazioni complementari (58).
Per la progettazione di un Sistema Multi-Esperto è cruciale la scelta dello schema di combinazione. In letteratura sono presenti numerose proposte basate su tecniche differenti(36-38) ; tuttavia, sebbene sia stato dimostrato che alcuni schemi di combinazione possono ottenere risultati migliori rispetto ai singoli classificatori componenti, non esiste una teoria consolidata che motivi perché alcuni schemi di combinazione siano migliori di altri e indichi quale sia lo schema più utile da impiegare in determinate circostanze (38). Quindi la scelta della tecnica di combinazione è strettamente dipendente dalla particolare applicazione e va definita caso per caso. <<<